Abstract
Les horloges circadiennes sont fonctionnelles dans tous les organismes sensibles à la lumière, ce qui permet une adaptation au monde extérieur, en anticipant les changements environnementaux quotidiennes. Des progrès considérables dans notre compréhension de la connexion étanche entre l'horloge circadienne et la plupart des aspects de la physiologie ont été réalisés dans le domaine au cours de la dernière décennie. Cependant, effilocher la base moléculaire qui sous-tend la fonction de l'oscillateur circadien chez l'homme reste de la plus haute défi technique. Ici, nous fournissons une description détaillée d'une approche expérimentale à long terme (2-5 jours) enregistrement bioluminescence et de collecte de moyen d'écoulement dans les cellules primaires humaines en culture. A cet effet, nous avons transduit des cellules primaires avec un reporter de luciférase lentivirale qui est sous le contrôle d'un promoteur de gène d'horloge de base, ce qui permet l'évaluation parallèle de la sécrétion d'hormones et de bioluminescence circadien. En outre, nous décrivons les conditions pour perturber l'horloge circadienne dans prcellules humaines imary en transfectant siRNA CLOCK ciblage. Nos résultats sur la régulation circadienne de la sécrétion d'insuline par les îlots pancréatiques humains, et Myokine la sécrétion par les cellules musculaires squelettiques humaines, sont présentés ici pour illustrer l'application de cette méthodologie. Ces paramètres peuvent être utilisés pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et d'analyser leur impact fonctionnel sur les cellules primaires dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.
Introduction
Le système de chronométrage circadien (du latin "Circa diem") a vu le jour dans tous les organismes sensibles à la lumière, comme un mécanisme d' adaptation à la rotation de la Terre. Chez les mammifères, elle est organisée de façon hiérarchique, qui englobe l'horloge centrale, qui est située dans le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus ventrale et périphérique (ou esclave) qui sont des oscillateurs fonctionnant dans différents organes. En outre, ces oscillateurs autonomes auto-entretenues cellules sont fonctionnelles dans presque toutes les cellules du corps 1. Signaux photiques représentent un signal de synchronisation dominant (Zeitgeber) pour les neurones du RCS, alors que les signaux neuronaux et humorale émanant du SCN réinitialiser les horloges périphériques. En addition des rythmes de repos-activité, qui poussent dans les cycles d'alimentation à jeun tour, sont d' autres synchroniseurs pour horloges périphériques 2. D'après les connaissances actuelles, la composition moléculaire de l'horloge de base est basée sur la transcription et traducboucles de rétroaction tions, qui sont conservées entre les organismes. Cela comprend les activateurs de transcription BMAL1 et CLOCK, qui activent ensemble la transcription des gènes négatifs noyau horloge PER et CRY. Des niveaux élevés de PER et de protéines CRY inhibent leur propre transcription par l'inhibition du complexe / CLOCK BMAL1. Une boucle auxiliaire se compose des récepteurs nucléaires REV-Erbs et reurs, qui régulent également la transcription de BMAL1 et CLOCK. En outre, les événements post - traductionnelles , y compris la phosphorylation, sumoylation, acétylation, O-GlcNAcylation, la dégradation et l' entrée nucléaire des protéines noyau d'horloge représentent une couche supplémentaire de régulation important dans l' établissement du cycle d'oscillation 24 h 3.
L'accumulation des données provient des études dans des modèles de rongeurs et met en évidence le rôle critique du système circadien dans la coordination des fonctions métaboliques et endocriniens 4-5. Un certain nombre de large-échelle de l' analyse du transcriptome suggèrent que l' alimentation - cycles de jeûne jouent un rôle central dans la synchronisation des oscillateurs périphériques 6-8. En accord avec ces études, l' analyse métabolomique et lipidomiques chez les rongeurs et les humains ont révélé qu'un grand nombre de métabolites osciller dans les tissus, le plasma et la salive d'une manière circadien 9-11. Fait important, la plupart des hormones présentent des rythmes circadiens dans 5,12-13 de sang. En outre, les horloges circadiennes de l'hormone correspondante produisant des tissus périphériques pourraient réguler la sécrétion d'hormones localement. Oscillateurs circadiens cellulaires autonomes ont été décrits dans les rongeurs et les cellules des îlots pancréatiques humains 14-16. Ces oscillateurs jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'îlot transcriptome du pancréas et de la fonction 15,17-18. En outre, la sécrétion Myokine par myotubes squelettiques humains a été démontré récemment pour présenter un modèle circadien, qui est régulée par oscillato cellulaire autonomers opératoires dans ces cellules 19.
Plusieurs approches pour l' étude des rythmes circadiens chez les humains in vivo ont été largement utilisés. Par exemple, la mélatonine plasmatique ou les niveaux de cortisol, ainsi que thoracique température de surface de la peau (revue dans les références 3,20) ont été étudiés pour évaluer horloges circadiennes endogènes. Bien que ces méthodes permettent d' étudier les oscillations circadiennes systémiques in vivo, ils sont loin de fournir une évaluation fiable des rythmes circadiens autonomes libres fonctionnant dans différents organes et tissus. Néanmoins, une telle dissection de la régulation systémique serait un outil indispensable pour la compréhension de l'effet spécifique des horloges moléculaires intracellulaires sur la fonction de ces cellules. Par conséquent, un effort important a été entrepris pour développer des approches fiables pour l' étude des horloges humaines dans des cellules cultivées immortalisées ou primaires synchronisées in vitro. Surtout, il a été démontré quecaractéristiques d'horloge mesurées dans des cellules de fibroblastes primaires de peau en culture reflètent étroitement les propriétés d'horloge individuelles de l'ensemble de l' organisme 21. Le développement des reporters circadiens fluorescents et bioluminescentes a considérablement avancé cette approche 22-27. En outre, l' étude des horloges de cellules primaires qui sont dérivées de différents organes périphériques permet l'étude des propriétés moléculaires des horloges spécifiques de tissus humains 3,5,16,19-20,28. Ainsi, l' évaluation des horloges circadiennes dans explants in vitro ou les cellules primaires synchronisées, en utilisant les journalistes bioluminescentes, représente une méthode très utile pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et leur impact sur le fonctionnement des organes.
Dans cet article, nous présenterons des protocoles détaillés pour l' évaluation de l' expression du gène circadien dans les cellules des îlots pancréatiques primaires et les muscles squelettiques humains synchronisés in vitro, ainsi que l'impact de l' horloge cellulaire autonomela perturbation de la fonction de sécrétion de ces cellules.
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Protocol
Déclaration éthique: Manipulations inclus dans ce protocole ont été approuvés par le comité d' éthique de l'hôpital universitaire de Genève et par l'éthique Comité SUD EST IV (Accord 12/111) 19. Les îlots humains ont été isolés à partir de pancréas de donneurs multi-organes de mort cérébrale dans le Centre de transplantation Islet à l'hôpital universitaire de Genève (Suisse) , comme décrit par nous dans les références 16,18, ou obtenu à partir d' une source commerciale.
1. Préparation de la culture cellulaire primaire
- Isolement îlots pancréatiques humaines, Dissociation et Culture
NOTE: Enduire chaque tube embout en plastique ou d'une pipette avec Connaught Research Laboratories médicale (CMRL) afin d'éviter les îlots ou les cellules des îlots de coller à la surface en plastique, qui peut conduire à une perte importante de matériel cellulaire moyen.- Un jour avant l'îlot dissociation cellulaire ajouter 1 ml de matrice extracellulaire laminine-5-riche (dérivé de 804G cellules comme descrilit en référence 29) par 3,5 cm plat. Avant étalement des cellules, aspirez la matrice et laver la vaisselle 3 fois avec de l'eau bi-distillée stérile. Laisser le plat sécher sous la hotte à flux laminaire pendant 5 min.
- A l'intérieur de l'armoire à flux laminaire, distribuer les îlots obtenus avec un milieu CMRL dans 15 tube (s) ml. Centrifuger à 272 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension le culot dans 1 ml d'un tampon phosphate stérile une solution saline de Dulbecco (DPBS) préchauffée à 37 ° C sans calcium et magnésium. Centrifuger à 272 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de DPBS.
- Pour compter le nombre total d'îlots, pipettes 10 ul de la 1 ml suspension d'îlots dans un nouveau 3,5 cm plat. Comptez le nombre d'îlots dans la chute de 10 pi sous le microscope et de cette calculer le nombre total d'îlots dans la suspension d'îlots 1 ml. Ajouter 14 ml de DPBS et centrifuger la suspension cellulaire à une plustemps à 272 xg pendant 5 min.
- Pour îlot cellulaire dissociation, aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de solution de détachement cellulaire pour un maximum de 1000 équivalents d'îlots (IEQ). Placer le tube dans un bain d'eau à 37 ° C et mélanger délicatement les îlots par pipetage de haut en bas plusieurs fois par minute, pendant 6-10 min.
REMARQUE: Pour vérifier la qualité de la digestion, pipeter une baisse de 2 pi de suspension sur une lame de verre et vérifier sous le microscope que toutes les cellules sont bien séparées, et qu'aucun doublets ou amas de cellules sont restées. - Arrêter la réaction en ajoutant 14 ml de milieu CMRL froid avec des suppléments (10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% de pénicilline-streptomycine (P / S), 1% de gentamycine, 1 pyruvate de sodium%). Centrifuger à 425 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et ajouter 15 ml de milieu CMRL au culot cellulaire.
- Remettre en suspension le culot dans un petit volume de milieu CMRL avec des suppléments. Comptez le nombre de cellules au microscope en utilisant un hemocytocompteur, ajuster le volume CMRL afin d'obtenir une concentration cellulaire de 650 ~ 000 cellules / ml.
- Pipeter 3 gouttes séparées de 100 ul de chaque suspension cellulaire dispersée obtenue dans l'étape 1.1.8 dans une boîte de 3,5 cm de pré-revêtu avec la laminine.
NOTE: Les cellules attachent au plat dans environ 24 heures. - Incuber les cellules (figure 1A) dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C dans une chambre humide. Changer le support de la cellule tombe tous les 2-3 jours par aspiration 100 pi de chaque goutte et le remplacer par le même volume de milieu frais.
- Primary Human myoblastes Culture et Différenciation en myotubes
- La biopsie tissulaire, l'isolement des cellules satellites et la culture des myoblastes
Note: Des biopsies musculaires ont été obtenus à partir du groupe d'Etienne Lefai (INSERM, Lyon, France) 19.- Purifier myoblastes squelettiques primaires selon la procédure décrite précédemment 30.
- Différencier pmyoblastes humains rimaires en myotubes
- Prendre une fiole (1 x 10 6 cellules) de myoblastes humains stockés dans de l' azote liquide et décongeler rapidement les cellules en plaçant le flacon pendant 30 secondes à 1 minute dans un bain-marie à 37 ° C sous agitation.
- les cellules pipeter (1 ml) dans 24 ml de milieu de culture composé de HAM F-10 supplémenté avec 20% de FBS, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B
- Centrifugeuse 5 min à 150 x g.
- Éliminer les cellules et remettre en suspension le surnageant avec 15 ml de milieu de croissance frais par 2,5 x 10 5 cellules.
- Plate au moins 2,5 x 10 5 cellules par F75 flacon adhérentes. Maintenir les myoblastes dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Une fois que les cellules atteignent 60-80% de confluence, dissocie les cellules avec trypsine-EDTA 0,05% pendant 1-2 min et les plaque dans 2 ml de milieu de croissance sur adhérentes 3,5 cm des boîtes de Petri.
- Après avoir atteint la confluence, éliminer le milieu de croissance.
- Démarrez le proto de différenciationcol de myoblastes humains dans des myotubes en les cultivant dans 2 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 1 g / L de glucose, 2% de FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicine et 0,2% de l'amphotéricine B (milieu de différenciation) dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer le milieu tous les 2 à 3 jours.
NOTE: Les myotubes sont généralement formées dans les 7-10 jours. - Contrôler la différenciation des cellules des muscles sous le microscope (figure 2A) , en observant la fusion de myoblastes en myotubes 19 polynucléaires.
- La biopsie tissulaire, l'isolement des cellules satellites et la culture des myoblastes
2. petits ARN interférents (siRNA) Transfection
- siRNA Transfection de cellules d'îlots humains
NOTE: Le protocole de transfection est réalisée dans des gouttes de 100 ul sur le lendemain après dissociation cellulaire (étapes 1.1.1-1.1.10).- Aspirer 100 ul de milieu CMRL de chaque goutte et le remplacer par le même volume de sans sérum milieu essentiel minimal (MEM) 2 havant la transfection par pipetage.
- Préparer un mélange à base de MEM-réactif de transfection et 50 nM d'ARNsi cible (SICLOCK) ou 50 nM de ciblage non siControl selon les instructions du fabricant.
- Pour un plat avec 3 gouttes préparer deux tubes de 1,5 ml avec 200 pi de MEM chacun.
- Ajouter à l'un de ces tubes 4 ul de réactif de transfection.
- Ajouter au second tube 1 pi de la solution de siRNA appropriée du stock (20 uM).
- Agiter ces deux tubes lentement sur l'agitateur orbital pendant 5 min, puis mélanger le contenu des tubes ensemble et agiter pendant 20 min plus.
- Aspirer 100 pi de MEM de chaque goutte et le remplacer par le même volume de mélange de transfection obtenu à l'étape précédente par pipetage.
- Remplacer la solution de transfection avec un milieu CMRL après 4 heures d'incubation à 37 ° C. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.3 le jour suivant pour la cellule re-transfection.
- siRNA Transfection des myotubes humaines
- Avant la transfection, remplacer le milieu (voir l'étape 1.2.2.8) avec 2 ml de milieu de différenciation frais par 3,5 cm boîte de Pétri.
- Dans un tube de 1,5 ml stérile, de préparer un mélange de 20 nM de siRNA (siControl ou SICLOCK), ce qui correspond à 2,4 ul d'une solution 20 uM d'ARNsi, et 12 pi de réactif de transfection dilué dans 100 ul de milieu de différenciation. Incuber la solution à température ambiante pendant 15 min sous agitation douce.
- Cellules transfecter avec 114,4 pi du mélange siRNA par 3,5 cm de Pétri cellules plat et placer dans un incubateur de culture de tissus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures.
3. continue à long terme circadien bioluminescence Enregistrement réalisé en parallèle avec l'évaluation de la sécrétion d'hormones dans les cellules vivantes primaires humaines
- Présentation de circadiens Reporters bioluminescence dans des cellules primaires humaines parLentiviral transduction
NOTE: Toutes les procédures avec des particules lentiviraux doivent être effectuées dans un niveau de biosécurité 2 installation de prendre des précautions supplémentaires pour le travail avec des agents qui présentent un risque potentiel modéré pour le personnel et l'environnement.- Préparer des particules de lentivirus reporter par co-transfection du vecteur d'intérêt pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc ou pLV156-Per2-dLuc (appelé Bmal1-luc et Per2-luc, respectivement) plasmide 31 avec les vecteurs lentiviraux pMD2G et psPAX dans des cellules 293T en utilisant la méthode de polyéthylènimine (pour la procédure détaillée , voir référence 16).
- Titrer les particules lentiviraux obtenus (détails sur le titrage peuvent être obtenus à http://lentilab.unige.ch/). Pour d' autres expériences, utiliser les lentivirus avec des titres allant de 10 4 à 10 5 unités de transduction [TU / ul].
- La place des plats avec des cellules d'îlots humains ou myoblastes humains (à 30-50% de confluence) à l'intérieur de la cabine à flux laminaireet et remplacer le milieu avec 2 ml de milieu frais supplémenté CMRL (voir étape 1.1.7) ou milieu de croissance (voir l'étape 1.2.2.2), respectivement.
- Calculer la multiplicité d'infection (MOI) ( à savoir les particules infectieuses (unités de transduction) / nombre de cellules).
- Transduire la culture de cellules primaires en pipetant une solution lentivirus à l'antenne afin d'obtenir une MOI = 3 (par exemple, pour 65 000 cellules attachées ajoute 3 ul de la solution de virus avec un titre de 6,5 x 10 4-100 goutte ul de milieu).
- Incuber une nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Changer le milieu le lendemain.
REMARQUE: transduire des cellules d'îlots humains au moins 4 jours avant l'enregistrement de bioluminescence afin d'obtenir une expression suffisante de la construction de rapporteur. Myoblastes sont transduits au cours de la phase d'expansion, puis cultivées jusqu'à la confluence, puis différenciées en myotubes.
- In Vitro Synchronisation des cellules primaires humaines
- <li> Ajouter 10 uM de adénylcyclase activateur dans 2 ml de milieu par 3,5 cm de Pétri plat contenant les cellules primaires précédemment transduites à l'étape 3.1.5.
- Incuber pendant 60 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
- Changer le milieu contenant l'activateur de l'adényl cyclase avec 2,5 ml du milieu d'enregistrement contenant 100 pM de luciférine.
Remarque: Pour des cellules d'îlots humains utilisent CMRL supplémenté avec 10% de FBS, 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% de gentamycine; pour les myotubes humains utilisent le rouge de phénol - DMEM exempt de 1 g / L de glucose supplémenté avec 2% de FBS, 2% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B
4. Évaluation parallèle de Circadian bioluminescence Enregistrement et Hormone Profils Sécrétion dans les cellules Synchronized humain sécrétoire primaire
- Configuration à long terme de périfusion Constant et bioluminescence Enregistrement pour les cellules primaires humaines.
NOTE: Lorsque les aboutissants de travailide la hotte à flux laminaire, nettoyer toutes les surfaces de contact et de limiter l'exposition des cultures ou du milieu à l'air pour éviter toute contamination.- Pour préparer le milieu de périfusion, ajouter 100 pM de luciférine dans le milieu.
Remarque: Pour des cellules d'îlots humains utilisent CMRL supplémenté avec 10% de FBS, 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% de gentamycine; pour les myotubes humains utilisent le rouge de phénol - DMEM exempt de 1 g / L de glucose supplémenté avec 2% de FBS, 2% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B - A l'intérieur de l'armoire à flux laminaire, ouvrir les 3,5 cm plats contenant les cultures transduites, transfectées et synchronisés primaires cellulaires (cellules ou îlots myotubes) comme décrit ci-dessus. Insérer bouchons métalliques stériles (développés en interne) (figure 1B2) dans les plats cm 3.5 qui sont équipées avec du silicone afflux / tubes d'efflux de liaison (Figure 1B1 / B5).
- Placez les plats sur la plate-forme de mesure dans le 37 ° C light étanche incubateur. Fixer les plats à la plate - forme en utilisant un adaptateur vissable (figure 1B3). Insérez les tubes afflux / efflux du système perifusion dans les tubes de silicone appropriés du bouchon (Figure 1B1 / B5) et régler la vitesse de la pompe à un débit de ~ 0,5 ml de milieu par 1 h.
- Ouvrez le logiciel Drip-biolumicorder développé en interne qui enregistre les signaux provenant du tube photomultiplicateur (PMT) détecteur. Choisissez le répertoire où les données seront stockées et commencent bioluminescence continue l'enregistrement de chaque plat en cliquant sur le bouton «Démarrer».
REMARQUE: Vous pouvez également le logiciel Drip-biolumicorder, d' autres programmes (par exemple LumiCycle), peuvent être utilisés pour enregistrer des signaux provenant du détecteur PMT. - Placez 6 puits des plaques de culture de tissus stériles dans la zone de collecte sur la glace.
- Ouvrez le logiciel de commande qui commande la synchronisation du commutateur automatique entre les puits de collecte. Mettre en place le temps window de milieu collection (s). Commencez la collecte du milieu d'écoulement toutes les 4 h (14,400 sec; ~ 2 ml par point de temps) en cliquant sur l'icône "run".
- Transfert et mesurer le moyen de sortie de chaque collection bien dans 2 ml tubes stériles par pipetage. Maintenir les tubes dans un congélateur à -20 ° C avant de commencer l'étape suivante. Répétez les étapes 4.1.5-4.1.6 toutes les 24 h.
- Arrêtez l'enregistrement de bioluminescence et le débit moyen en cliquant sur l'icône «stop» sur le logiciel correspondant. Retirez les bouchons métalliques et aspirer le milieu résiduel de la vaisselle.
- Afin de normaliser les valeurs de protéines sécrétées obtenues dans des expériences différentes, soit d' extraire l' ADN ( la normalisation par la teneur en ADN génomique pour les myotubes 19) ou ajouter 1 ml de tampon de lyse acide-éthanol ( la normalisation par la teneur totale en hormone à des cellules d'îlots 18) à la vaisselle.
- Pour préparer le milieu de périfusion, ajouter 100 pM de luciférine dans le milieu.
5. Mesurer les niveaux hormonaux et Islet MYOKINE dans le OutflowMoyen Obtenu par périfusion continu de cellules endocrines primaires humaines
- Insuline
- Quantifier les niveaux d'insuline basale dans le milieu d'écoulement de points de temps recueillies en utilisant une insuline enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit humain en suivant les instructions du fabricant.
- Normaliser les données sur le volume total du fluide recueilli dans chaque puits et la teneur en insuline totale, extraite à partir des cellules traitées à l' acide de l' éthanol , à la fin de l'expérience (étape 4.1.9) 18.
- Interleukine-6 (IL-6)
- Quantifier basale d'IL-6 dans le milieu d'écoulement de points de temps recueillies en utilisant un kit IL-6 humaine ELISA suivant les instructions du fabricant.
- Normaliser les données sur le volume total du fluide recueilli dans chaque puits et la teneur en ADN génomique, à la fin de l'expérience (étape 4.1.9).
6. circadiens Analyses Dataset pour Bioluminescence et Hormone Profils Sécrétion
- L'analyse par bioluminescence
- Analyser le profil de bioluminescence en utilisant le logiciel fourni 19.
- L'analyse du cycle JTK
- Analyser les profils de sécrétion d'hormones et d'enregistrement des résultats de bioluminescence en utilisant l'algorithme de 32 JTK_CYCLE.
- Régler la largeur de la période circadienne à 20-24 h.
NOTE: Dans le cas où les conditions expérimentales ont été enregistrées en parallèle, une analyse statistique apparié peut être effectuée pour comparer les expériences.
- Analyse CosinorJ
- Vous pouvez également analyser la sécrétion de l' hormone et les profils de bioluminescence circadiens en utilisant le logiciel CosinorJ 28.
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Representative Results
Évaluation de l'Islet Hormone Sécrétion avec Parallel Circadian bioluminescence Enregistrement à partir de cellules Perifused îlots humains
Après avoir fourni une première caractérisation moléculaire de l'horloge circadienne, fonctionnant dans des cellules d'îlots humains 16, nous avons pour but d'étudier l'impact de la perturbation de l' horloge sur la fonction des îlots et la transcription 18. Nous mettons en place un système efficace SICLOCK protocole de transfection dans des cellules dispersées d'îlots humains (voir Protocole pour les détails), ce qui a donné lieu à plus de 80% knockdown de CLOCK ARNm, et l' horloge efficace ablation tel que mesuré par bioluminescence circadien profilage 18. Glucose induite par la sécrétion d'insuline (GSIS) L'analyse a révélé significativement réduit basale et stimulée la sécrétion d'insuline à une telle perturbation de l'horloge (non représentée). Pour évaluer la sécrétion d'hormones par les cellules d'îlots humains autour de l'horloge, un continSystème de périfusion ues est relié à un luminomètre (représenté sur la figure 1B). Les cellules des îlots humains, portant une fonctionnelle (siControl) ou dysfonctionnel (SICLOCK) oscillateur ont été transduites avec des particules lentiviraux Bmal1-luc. Les cellules ont ensuite été synchronisées avec une impulsion d'activateur adénylcyclase suivie d' une analyse parallèle de la bioluminescence circadien et la sécrétion d' insuline dans le milieu d'écoulement pendant 48 h (Figure 1 C, D 18). Ces expériences suggèrent que sous concentration constante physiologique de glucose (5,6 mM de glucose), la sécrétion d' insuline par les cellules in vitro d'îlots humains synchronisés présente un profil circadien, qui est perturbé dans les échantillons portant SICLOCK (Figure 1D).
Étudier Myokine Sécrétion par Skeletal Human myotubes Synchronized in vitro en présence ou absence d'horloge fonctionnelle
33, nous avons pour but de caractériser les rythmes circadiens dans le primaire squelettique humain myotubes et à étudier leur rôle dans la fonction de myotubes 19. A cet effet, la perturbation de l'horloge circadienne dans les myotubes du squelette a été obtenue par transfection de siRNA ciblant CLOCK. Circadiens essais bioluminescence reporters avec Bmal1-luc et les journalistes Per2-luc ont révélé que les myotubes squelettiques humaines, synchronisées in vitro, présentent un rythme circadien auto-entretenue, qui a été confirmé par endogène expression de transcription d'horloge de base (figure 2B; 19). Cette horloge endogène a été interrompu de manière efficace en présence de siRNA ciblant CLOCK (figure 2B). En outre, la sécrétion basale de l' IL-6 (figure 2C), l' interleukine-8 (IL-8) ,et la protéine chimiotactique monocytaire 1 (MCP-1) (non représenté) par myotubes squelettiques synchronisés, évalués par le système de perifusion décrit ici (figure 1B) et l' analyse multiplex ultérieure Myokine à grande échelle (non représenté), présente un profil circadien, qui est dérégulée fortement sur la perturbation de l' horloge (figure 2C 19).
Figure 1: Évaluation de la sécrétion de l' hormone avec Parallel Circadian bioluminescence Enregistrement à partir de cellules Perifused îlots humains (A) de l' image représentant des cellules d'îlots humains attachés un jour après l' îlot de dissociation.. (B) Représentation schématique du système de périfusion fait maison qui comprend un flacon avec le milieu de périfusion, une pompe, une plate - forme de mesure équipé d'un photomultiplicateur (PMT) à l' intérieur de l'incubateur étanche à la lumièreUn dispositif de luminomètre, contrôlé par le logiciel d'enregistrement, et un collecteur d'échantillon semi-automatique. Insérer: tube (B1) Afflux de connexion; (B2) de capuchon métallique pour le plat de 3,5 cm de Pétri; (B3) adaptateur vissable qui fixe le cap de la plate - forme de mesure (B4); tube (B5) efflux de connexion; (B6) commandé automatiquement distributeur moyen. (C) des cellules des îlots pancréatiques humaines ont été transfectées avec le siRNA soit brouillé (siControl) ou siRNA CLOCK ciblage (SICLOCK) et transduction avec le journaliste Bmal1-luc. Les cellules ont été constamment perifused avec un milieu de culture contenant 5,6 mM de glucose. bioluminescence Circadian a été enregistrée suite la synchronisation par une impulsion d'activateur adénylcyclase. (D) Les niveaux d'insuline ont été évalués par ELISA dans les échantillons d'écoulement recueillies toutes les 4 heures pendant 48 heures. Application de l' algorithme de JTK_CYCLE 32 confirmé que , dans la presence d'une horloge fonctionnelle (siControl), le profil moyen de l' insuline est sécrétée circadienne dans les 48 heures, avec une longueur de période de 24,19 ± 0,89 h (** p = 0,009, n = 7 donneurs). Ce profil circadien a été perdu lors de la perturbation de l' horloge (SICLOCK). Les données sont présentées en tant que% de l' hormone sécrétée à partir du contenu de l' hormone totale (moyenne ± SEM) pour n = 7 donateurs (un réplicats pour chaque donneur) .Cet chiffre a été modifié par la référence 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Basal IL-6 Sécrétion par Skeletal myotubes humaines est fortement inhibée en l'absence d'une horloge circadienne fonctionnelle myoblastes ont été transduites avec des particules lentivirauxcontenant le transgène Bmal1-luc, différenciées en myotubes, et transfectées avec soit siControl ou SICLOCK siRNA. 24 heures après la transfection, les myotubes ont été synchronisée avec une impulsion d'activateur adénylcyclase et soumis à perifusion continu avec enregistrement bioluminescence parallèle. (A) des images représentatives ont été prises au jour 0 (J0) et D7 après le passage de 20% à 2% de SVF contenant du milieu pour induire la différenciation des myotubes. Pendant le processus de différenciation, myoblastes humains sont réorientés, deviennent allongées et fusionnent pour former un syncytium plurinuclated. (B) profils de bioluminescence Bmal1-luc de siControl transfectées myotubes (ligne noire) et SICLOCK transfectées myotubes (ligne grise). Profils d'oscillation Bmal1-luc ont été enregistrées dans trois expériences indépendantes (un donneur par expérience). (C) basale Représentant La sécrétion d'IL-6le profil en présence ou en l'absence d'une horloge fonctionnelle. Le milieu périfusion d'écoulement a été recueilli dans des intervalles de 4 heures pendant 48 heures (0-4 correspond à l'accumulation de l'IL-6 entre 0 h et 4 h). IL-6 dans le milieu ont été évalués par ELISA en deux exemplaires techniques de trois expériences indépendantes. Les résultats représentent de base d'IL-6 normalisé par rapport à la teneur en ADN total. La sécrétion d'IL-6 a été réduite en moyenne de 69,30 ± 10,61% à la perturbation du rythme circadien horloge (moyenne ± SEM, n = 3; * P <0,05, t apparié test). Ce chiffre a été modifié par la référence 19. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les paramètres expérimentaux décrits ici sont composés de livraison lentiviral de reporters de bioluminescence circadiens dans des cellules primaires humaines en culture, suivie par une synchronisation ultérieure in vitro et l' enregistrement continu de bioluminescence pendant plusieurs jours, et l' analyse parallèle de la sécrétion d' hormones par les mêmes cellules. Ils représentent une approche efficace pour explorer les mécanismes moléculaires et les aspects fonctionnels des horloges circadiennes dans les cellules primaires humaines.
La qualité du matériau donneur est une question importante pour la préparation des cultures de tissus primaires viables. La qualité des îlots humains doit être évaluée chaque fois avant de commencer l'expérience. Ilots avec pureté estimée et / ou la viabilité inférieure à 70% ne sont pas recommandés pour ces expériences. les cellules des îlots ont tendance à ré-établir des contacts dans des cultures dissociées, qui joue un rôle important dans leur survie et leur fonction. Etant donné que les cellules des îlots pancréatiques ne prolifèrent pas en culture, ils doivent être étalées à une densité élevée, qui permet aux cellules d'établir des contacts avec les cellules voisines. Ceci est réalisé par étalement des cellules dans des gouttelettes d'un petit volume. Surtout, la mort cellulaire est plus élevée dans les cultures de cellules d'îlots à faible densité. Notez que le remplacement moyen doit être effectué sans délai afin d'éviter le séchage des cellules.
Les myoblastes doivent être repiquées de préférence à 60% de confluence, car une densité plus élevée peut induire la différenciation des myoblastes. Après trypsinisation, myoblastes doivent être soigneusement remis en suspension et dispersées pour éviter des amas de cellules.
La contamination bactérienne ou fongique des cellules primaires devrait être exclu au microscope avant de commencer le dosage de périfusion. Le milieu de culture peut être complétée par des substances antifongiques. En outre, le tube de perifusion doit être rincé par l'alcool iode désinfection / eau stérile et les bouchons métalliques doivent être stérilisés par autoclavage. Ces étapes sont recommandées entre chaque eXperiment.
Efficace pour l'enregistrement de la bioluminescence, la qualité de la préparation d'un lentivirus rapporteur devrait être déterminée par l'intensité du signal de bioluminescence. Les détails de la production lentivirus y compris le dépannage peut être trouvé à http://lentilab.unige.ch/. Préalablement à la transfection de plasmides pour la production de lentivirus, les cellules 293T doivent être étalées à raison de 30 à 50% de confluence. Il est fortement recommandé d'effectuer un contrôle de l'efficacité de transfection dans un plat en parallèle, par exemple en utilisant CMV-GFP ou un lentivector fluorescente alternative. Pour chaque préparation de virus le titre de virus devrait être établi.
Comme les expériences décrites sont généralement de longue durée (48 heures ou plus), il est crucial d'avoir silençage stable durant cette période. La concentration de l'ARNsi doit être optimisée, ainsi que la confluence des cellules selon le protocole de réactif ARNsi. Efficacité du silençage génique doit être testé à la fin de la experiment par RT-qPCR ou par Western blot.
Au cours de périfusion, le débit détermine le temps nécessaire pour échanger complètement le milieu dans le plat mais a également un impact mécanique sur la culture cellulaire primaire. En effet, la mise en place du flux à un taux qui est trop faible, ne permettra pas d'un échange complet de milieu dans le plat, et va diminuer la sensibilité de la méthode. Au contraire, une vitesse d'écoulement à grande vitesse peut endommager les cellules. Dans nos mains, la vitesse optimale pour les deux types cellulaires ne permet de recueillir 0,5 ml du milieu d'écoulement par 1 h.
Il est important, pour obtenir une concentration mesurable de substances présentes dans le milieu d'écoulement, un nombre suffisant de cellules sécrétant doit être présent dans le plat perifused. Le procédé suivi pour la détection de la substance sécrétée (ELISA ou autre) doit être suffisamment sensible, en particulier pour des substances sécrétées à des concentrations très faibles. densité cellulaire plus élevée pourrait être recommandé pour surmonterce problème lorsque cela est possible. En variante, le moyen de sortie peut être concentré par dialyse ou avec des filtres centrifuges, tels que décrits par nous dans les détails , en référence 19.
Pris ensemble nos expériences dans les cellules des îlots pancréatiques humains et dans les myotubes primaires fournissent pour la première fois des preuves convaincantes que ces cellules humaines possèdent des horloges circadiennes de haute amplitude de cellules autonomes 18-19. En utilisant le système de périfusion décrit ici combiné avec un dispositif de luminomètre (figure 1B) , nous avons démontré que ces horloges jouent un rôle important dans la régulation du rythme circadien de la sécrétion d' insuline basale par des cellules d' îlots pancréatiques (Figure 1D) et de base IL6 sécrétion par les myotubes squelettiques (figure 2C). En outre, en faisant tomber le gène horloge d'horloge de base dans les deux systèmes expérimentaux, nous montrons qu'un oscillateur circadien fonctionnelle est nécessaire pour l' insuline rythmique appropriée et la sécrétion d' IL-6par îlots humains et les cellules des muscles squelettiques, respectivement (Figures 1C, D et 2B, C). Nos résultats indiquent un rôle critique de l'horloge d'îlots humains pour la sécrétion d'insuline appropriée, et sont en bon accord avec les travaux effectués dans les modèles génétiques rongeurs 15,17. Étant donné le rôle majeur de l'horloge circadienne pour permettre aux organismes d'anticiper les changements environnementaux quotidiens plutôt que de réagir à eux, régulation circadienne de l'insuline basale et la sécrétion Myokine pourrait représenter un tel mécanisme d'anticipation qui coordonne les îlots pancréatiques et le muscle squelettique des activités sécrétoires du REST l'activité du cycle de l'ensemble du corps.
La méthodologie proposée ici peut être facilement modifié afin d'étudier plus la sécrétion de l'hormone à partir des mêmes tissus. Nous avons déjà analysé un grand panneau supplémentaire de myokines sécrétées par les cellules musculaires squelettiques, en utilisant des réseaux de multiplexage MYOKINE humains 19, et nous sommes en train d'évaluerment la sécrétion de glucagon par les cellules d'îlots humains en utilisant le kit ELISA glucagon (données non présentées). De plus, ces conditions expérimentales peuvent être optimisées pour d' autres types de cellules, par les adipocytes exemple de base, pour l' étude adipokine sécrétion thyrocytes primaire pour l' étude de la sécrétion de l' hormone de la thyroïde, les entérocytes primaires pour l' étude incrétines la sécrétion, etc. Une autre application importante de ce système pourrait consister à explorer l'impact des composés physiologiques et / ou pharmacologiques sur la fonction horloge circadienne cellulaire et la sécrétion. Le composé d'intérêt peut être appliqué de manière continue tout au long de l'ensemble de l'expérience (par exemple, l'étude de la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots humains en présence de glucose élevé ou différents niveaux d'acides gras libres), ou le composé peut être ajouté à une phase choisie du rythme circadien cycle.
Cette technique présente les limites d'une étude in vitro et ne représente pas la complexité du rythme circadien réglelation au niveau du corps entier. En même temps, il permet de distinguer le rôle d'une horloge autonome sur le métabolisme cellulaire dans des conditions contrôlées. Actuellement les méthodes disponibles sont basées sur des mesures de capture instantanée de l' activité de sécrétion dans les cellules ou les explants suivantes en synchronisation in vitro 17. Le protocole décrit ici représente une méthode unique, permettant une analyse concordante et continue du rythme circadien et de l'activité sécrétoire au sein de la même culture cellulaire. En variante, cette méthode pourrait être appliquée pour étudier la cinétique de la presse bioluminescents non circadiens, en liaison avec la sécrétion de la cellule, ainsi que pour détecter les effets des différentes substances ajoutées au milieu de périfusion sur la fonction cellulaire. Les étapes critiques dans le protocole sont les suivants: 1) la préparation lentivirus efficace, 2) la transfection cellulaire efficace avec le siRNA et reporter les vecteurs transduction; 3) la collecte d'écoulement moyen constant et 4) faire en sorte qu'un nombre suffisant de CElls est utilisé afin d'obtenir des niveaux mesurables d'hormones ou cytokines dans le milieu d'écoulement recueilli (voir le dépannage ci-dessus).
Compte tenu des récentes preuves sur le lien entre les perturbations de l' horloge circadienne et les maladies métaboliques et du cancer chez l' homme 3-4,28,34-35, l' étude des propriétés d'horloge périphérique humain dans des cultures primaires peuvent représenter une approche unique et importante pour la compréhension de la connexion d'horloge potentiel à ces maladies. Ainsi, notre découverte de l'existence de liens entre l' îlot fonctionnelle pancréatique humaine et squelettique horloge musculaire et la sécrétion basale d'insuline et myokines, pourrait supporter les conséquences potentielles pour la compréhension du développement de maladies chroniques, telles que 2 diabète d'obésité et de type 18-19 et apportera de nouvelles voies dans le traitement de ces maladies. Il est important, en raison de la corrélation établie entre les caractéristiques de l' oscillateur évaluée in vitro et in vivo 36, implication des propriétés d'horloge circadiens humains comme une caractéristique des maladies, est de la plus haute et la pertinence clinique immédiate 20.
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Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à nos collègues de l'Université de Genève: Jacques Philippe pour des commentaires constructifs sur ce travail, Ueli Schibler pour une aide précieuse au développement du système de perifusion et d'inspiration scientifique, André Liani pour avoir conçu la conception, la fabrication et la mise en service de le système de perfusion, société Lesa-Technology LTD pour l'assistance dans le système perifusion et le développement de logiciels Drip-biolumicorder, George Severi d'assistance avec les expériences de périfusion, Ursula Loizides-Mangold pour la lecture critique du manuscrit, et Anne-Marie Makhlouf pour les préparations de lentivirus ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon et Hubert Vidal (INSERM, Lyon) pour la préparation de myoblastes primaires humains; et Domenico Bosco et Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Hôpital Universitaire de Genève) pour fournir des îlots humains. Ce travail a été financé par le n ° national suisse Science Foundation Grant 31003A_146475 / 1, le Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande verser Diabète de la Recherche, Fondation Bo Hjelt, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, et la Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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