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Genetics

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54673
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

Circadian घड़ियों दैनिक पर्यावरण परिवर्तन की आशंका से बाहरी दुनिया के लिए एक अनुकूलन के लिए अनुमति देता है सब प्रकाश के प्रति संवेदनशील जीवों में कार्य कर रहे हैं। circadian घड़ी और शरीर विज्ञान की सबसे पहलुओं के बीच तंग कनेक्शन के बारे में हमारी समझ में काफी प्रगति पिछले एक दशक से अधिक के क्षेत्र में किया गया है। हालांकि, आणविक आधार मानव में circadian थरथरानवाला के समारोह underlies कि unraveling उच्चतम तकनीकी चुनौती का रहता है। यहाँ, हम लंबी अवधि (2-5 दिन) bioluminescence रिकॉर्डिंग और बहिर्वाह मध्यम संग्रह सुसंस्कृत मानव प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। इस प्रयोजन के लिए, हम एक lentiviral luciferase संवाददाता है कि एक कोर घड़ी जीन प्रमोटर, जो हार्मोन के स्राव और circadian bioluminescence की समानांतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है के नियंत्रण के अधीन साथ प्राथमिक कोशिकाओं transduced है। इसके अलावा, हम जनसंपर्क में circadian घड़ी में खलल न डालें के लिए परिस्थितियों का वर्णनsiRNA को निशाना घड़ी परासंक्रमित द्वारा imary मानव कोशिकाओं। मानव अग्नाशय टापू द्वारा इंसुलिन के स्राव के circadian नियमन पर हमारे परिणाम है, और मानव कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं द्वारा myokine स्राव, इस पद्धति के आवेदन को वर्णन करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। ये सेटिंग्स मानव परिधीय घड़ियों के आणविक मेकअप का अध्ययन करने और शारीरिक या pathophysiological शर्तों के तहत प्राथमिक कोशिकाओं पर उनके कार्यात्मक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

Circadian समय प्रणाली (लैटिन "लगभग दिन" से), सभी प्रकाश के प्रति संवेदनशील जीवों में उभरा है पृथ्वी के घूर्णन करने के लिए एक अनुकूली तंत्र के रूप में। स्तनधारियों में, यह एक श्रेणीबद्ध तरीके से आयोजित किया जाता है, उदर हाइपोथेलेमस की suprachiasmatic नाभिक में स्थित है जो केंद्रीय घड़ी, शामिल है, और परिधीय (या गुलाम) oscillators कि विभिन्न अंगों में ऑपरेटिव कर रहे हैं। इसके अलावा, इन सेल स्वायत्त आत्मनिर्भर oscillators शरीर 1 के लगभग हर कोशिका में कार्य कर रहे हैं। रोशनी का संकेत है, SCN न्यूरॉन्स के लिए एक प्रमुख तुल्यकालन क्यू (Zeitgeber) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि SCN से चलाई तंत्रिका और त्रिदोषन संकेतों परिधीय घड़ियां रीसेट। इसके अलावा बाकी गतिविधि लय, कि बारी खिला-उपवास के चक्र में ड्राइव में, परिधीय घड़ियां 2 के लिए आगे synchronizers हैं। हमारी वर्तमान समझ के मुताबिक, कोर घड़ी की आणविक मेकअप ट्रांसक्रिप्शनल और transla पर आधारित हैराष्ट्रीय प्रतिक्रिया छोरों, जो जीवों के बीच संरक्षित कर रहे हैं। इस ट्रांसक्रिप्शनल activators BMAL1 और घड़ी है, जो एक साथ नकारात्मक कोर घड़ी प्रति और रोना जीन का प्रतिलेखन सक्रिय शामिल हैं। प्रति और रोना प्रोटीन का उच्च स्तर BMAL1 / घड़ी परिसर के निषेध के माध्यम से अपने खुद के प्रतिलेखन को बाधित करेगा। एक सहायक पाश परमाणु रिसेप्टर्स REV-erbs और RORs है, जो भी BMAL1 और घड़ी के प्रतिलेखन विनियमित होते हैं। इसके अलावा, फोस्फोराइलेशन, sumoylation, एसिटिलीकरण, हे-GlcNAcylation, क्षरण और कोर घड़ी प्रोटीन के परमाणु प्रविष्टि सहित posttranslational घटनाओं 24 घंटा दोलन चक्र 3 स्थापित करने में एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण नियामक परत का प्रतिनिधित्व करते हैं।

जमते सबूत कृंतक मॉडल में अध्ययन से उपजा है और चयापचय और अंत: स्रावी कार्यों 4-5 के समन्वय में circadian प्रणाली की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला गया। larg के एक नंबरई-पैमाने transcriptome विश्लेषण का सुझाव है कि खिला - उपवास चक्र परिधीय oscillators 6-8 के तुल्यकालन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इन अध्ययनों के साथ एक समझौते में, मूषक और मनुष्यों में metabolomic और lipidomic विश्लेषण से पता चला है कि चयापचयों की एक बड़ी संख्या में एक circadian ढंग 9-11 में ऊतक, प्लाज्मा, और लार में हिलाना। महत्वपूर्ण बात है, सबसे हार्मोन रक्त 5,12-13 में circadian लय दिखा रहे हैं। इसके अलावा, इसी परिधीय ऊतक का निर्माण हार्मोन के circadian घड़ियों स्थानीय स्तर पर हार्मोन के स्राव को विनियमित सकता है। सेल स्वायत्त circadian oscillators कृंतक और मानव अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं 14-16 में वर्णित किया गया है। ये oscillators अग्नाशय आइलेट transcriptome विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और 15,17-18 कार्य करते हैं। इसके अलावा, मानव कंकाल myotubes द्वारा myokine स्राव हाल ही में एक circadian पैटर्न है, जो सेल स्वायत्त oscillato द्वारा विनियमित है प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया हैइन कोशिकाओं को 19 में ऑपरेटिव रु।

विवो में मानव में circadian लय के अध्ययन के लिए कई दृष्टिकोण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा मेलाटोनिन या कोर्टिसोल के स्तर के साथ ही वक्ष त्वचा की सतह के तापमान (संदर्भ 3,20 में समीक्षा) अंतर्जात circadian घड़ियों का आकलन करने के लिए अध्ययन किया गया है। हालांकि इन तरीकों विवो में प्रणालीगत circadian दोलनों का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, वे विभिन्न अंगों और ऊतकों में मुक्त चल स्वायत्त circadian लय का एक विश्वसनीय आकलन उपलब्ध कराने से दूर हैं। फिर भी, प्रणालीगत विनियमन से इस तरह के विच्छेदन इन कोशिकाओं के समारोह पर intracellular आणविक घड़ियों के विशिष्ट प्रभाव को समझने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हो सकता है। इसलिए, अमर या प्राथमिक सुसंस्कृत इन विट्रो में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं में मानव घड़ियों के अध्ययन के लिए विश्वसनीय तरीकों को विकसित करने के लिए एक पर्याप्त प्रयास शुरू किया गया है। महत्वपूर्ण बात है, यह दिखा दिया है किघड़ी सुसंस्कृत प्राथमिक त्वचा fibroblast कोशिकाओं में मापा विशेषताओं बारीकी से पूरे जीव 21 के व्यक्तिगत घड़ी गुण दर्शाते हैं। फ्लोरोसेंट और bioluminescent circadian संवाददाताओं के विकास के बहुत इस दृष्टिकोण 22-27 उन्नत है। इसके अलावा, अध्ययन प्राथमिक सेल घड़ियों है कि अलग अलग परिधीय अंगों से निकाली गई है मानव ऊतक विशेष घड़ियों 3,5,16,19-20,28 की आणविक संपत्तियों की जांच के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, इन विट्रो सिंक्रनाइज़ प्राथमिक explants या कोशिकाओं में circadian घड़ियों के मूल्यांकन, bioluminescent संवाददाताओं का उपयोग करके, मानव परिधीय घड़ियों के आणविक मेकअप और अंग समारोह पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बेहद उपयोगी विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

इस अनुच्छेद में, हम स्वायत्त सेलुलर घड़ी के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो में सिंक्रनाइज़ मानव प्राथमिक आइलेट और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में circadian जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करेंगेइन कोशिकाओं के स्रावी समारोह पर व्यवधान।

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Protocol

आचार बयान: इस प्रोटोकॉल में शामिल जोड़तोड़ जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पताल की आचार समिति द्वारा और नैतिक समिति सूद ईएसटी चतुर्थ (एग्रीमेंट 12/111) 19 से अनुमोदित किया गया। मानव टापू के रूप में संदर्भ के 16,18 में हमारे द्वारा वर्णित है, या एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त जिनेवा के विश्वविद्यालय अस्पताल (स्विट्जरलैंड) में आइलेट ट्रांसप्लांटेशन सेंटर में मस्तिष्क मृत बहु अंग दाताओं की pancreases से अलग थे।

1. प्राथमिक सेल संस्कृति की तैयारी

  1. मानव अग्नाशय आइलेट अलगाव, हदबंदी और संस्कृति
    नोट: कोट हर ट्यूब, प्लास्टिक टिप या कनॉट मेडिकल रिसर्च लैबोरेटरीज (CMRL) के क्रम में प्लास्टिक सतह है, जो सेल सामग्री का एक महत्वपूर्ण नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के लिए चिपके से टापू या आइलेट कोशिकाओं को रोकने के लिए माध्यम के साथ पिपेट।
    1. एक दिन पहले सेल हदबंदी laminin-5-अमीर बाह्य मैट्रिक्स के 1 मिलीलीटर जोड़ने आइलेट (descri के रूप में 804G कोशिकाओं से व्युत्पन्नसंदर्भ 29) के अनुसार 3.5 सेमी डिश में बिस्तर। चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, मैट्रिक्स aspirate और पकवान बाँझ द्वि-distillated पानी के साथ 3 बार धोएं। डिश 5 मिनट के लिए लामिना का प्रवाह कैबिनेट के तहत सूखे की अनुमति दें।
    2. लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर, 15 मिलीलीटर ट्यूब (ओं) में CMRL मध्यम के साथ प्राप्त टापू वितरित। 5 मिनट के लिए 272 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और फिर बाँझ Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा के 1 मिलीलीटर (DPBS) में गोली resuspend कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म। 5 मिनट के लिए 272 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और DPBS के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
    5. एक नया 3.5 सेमी डिश में टापू, pipet 1 मिलीलीटर आइलेट निलंबन से 10 μl की कुल संख्या गिनने के लिए। माइक्रोस्कोप के तहत 10 μl बूंद में टापू की संख्या की गणना और इस से 1 मिलीलीटर आइलेट निलंबन में टापू की कुल संख्या की गणना। DPBS के 14 मिलीलीटर जोड़ें और सेल निलंबन अपकेंद्रित्र एक और5 मिनट के लिए 272 XG पर समय।
    6. आइलेट सेल हदबंदी के लिए, सतह पर तैरनेवाला aspirate और 1,000 आइलेट समकक्ष (IEQ) की एक अधिकतम के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब रखें और धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और हर मिनट में कई बार नीचे टापू मिश्रण 6-10 मिनट के दौरान।
      नोट: पाचन गुणवत्ता की जांच करने के लिए, एक गिलास स्लाइड पर निलंबन की एक बूंद 2 μl pipet और माइक्रोस्कोप है कि सभी कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं के तहत जांच, और है कि कोई दोहरी या सेल झुरमुटों बने हुए हैं।
    7. की खुराक (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), के 1% के साथ ठंड CMRL के 14 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो एल alanyl-एल glutamine dipeptide, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 1% gentamycin, 1 % सोडियम पाइरूवेट)। 5 मिनट के लिए 425 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल गोली CMRL माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. पूरक आहार के साथ CMRL की एक छोटी मात्रा में गोली Resuspend। एक hemocyto का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की संख्या की गणनामीटर, आदेश ~ 650, 000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने में CMRL मात्रा समायोजित करें।
    9. Pipet 3 3.5 सेमी पकवान laminin साथ पूर्व में लिपटे में कदम 1.1.8 में प्राप्त छितरी सेल निलंबन से 100 μl प्रत्येक की बूंदों अलग कर दिया।
      नोट: प्रकोष्ठों के बारे में 24 घंटे में डिश को देते हैं।
    10. एक नम कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) सेते हैं। प्रत्येक बूंद से 100 μl श्वास और ताजा माध्यम का एक ही मात्रा के साथ जगह से परिवर्तन सेल के माध्यम के हर 2-3 दिन चला जाता है।
  2. मानव प्राथमिक Myoblast संस्कृति और भेदभाव myotubes में
    1. ऊतक बायोप्सी, उपग्रह सेल अलगाव और myoblast संस्कृति
      नोट: मांसपेशी बायोप्सी एटीन Lefai (INSERM, ल्यों, फ्रांस), 19 के समूह से प्राप्त किया गया।
      1. पहले से वर्णित प्रक्रिया के अनुसार 30 प्राथमिक कंकाल myoblasts शुद्ध।
    2. फर्क पीmyotubes में rimary मानव myoblasts
      1. तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत मानव myoblasts की एक शीशी (1 x 10 6 कोशिकाओं) ले लो और आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 30 सेकंड के 1 मिनट के लिए शीशी डालने से जल्दी कोशिकाओं पिघलना।
      2. Pipet कोशिकाओं (1 मिलीलीटर) से बना मध्यम विकास के 24 मिलीलीटर में HAM F-10 20% FBS, 1% पी / एस, 0.5% और 0.2% gentamycin amphotericin बी के साथ पूरक
      3. 150 x जी अपकेंद्रित्र 5 मिनट।
      4. 2.5 x 10 5 कोशिकाओं प्रति ताजा मध्यम विकास के 15 मिलीलीटर के साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें।
      5. प्लेट कम से कम 2.5 x 10 5 प्रति पक्षपाती F75 कुप्पी कोशिकाओं। सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में myoblasts रखें और 5%।
      6. एक बार कोशिकाओं 60-80% confluency तक पहुँचने, 1-2 मिनट के लिए trypsin EDTA के 0.05% के साथ कोशिकाओं को अलग कर देना और उन्हें पक्षपाती 3.5 सेमी पेट्री डिश पर मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर में थाली।
      7. संगम तक पहुँचने के बाद, मध्यम विकास को हटा दें।
      8. भेदभाव आद्य शुरूउन में संवर्धन द्वारा myotubes में मानव myoblasts के कर्नल 2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 1 जी / ग्लूकोज के एल, 2% FBS, 1% पी / एस, 0.5% gentamycin और 0.2% amphotericin बी (भेदभाव माध्यम) युक्त मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक सेल इनक्यूबेटर में। मध्यम बदलें हर 2 से 3 दिनों के लिए।
        नोट: myotubes आमतौर पर 7-10 दिनों के भीतर का गठन कर रहे हैं।
      9. Polynucleated myotubes 19 में myoblasts के विलय को देख कर माइक्रोस्कोप (2A चित्रा) के तहत पेशी सेल भेदभाव की जाँच करें।

2. छोटे दखल शाही सेना (siRNA) अभिकर्मक

  1. मानव आइलेट कोशिकाओं की siRNA अभिकर्मक
    नोट: अभिकर्मक प्रोटोकॉल सेल हदबंदी के बाद अगले दिन पर 100 μl (कदम 1.1.1-1.1.10) की बूंदों में किया जाता है।
    1. प्रत्येक बूंद से CMRL माध्यम की महाप्राण 100 μl और सीरम मुक्त मिनिमल आवश्यक मध्यम (सदस्य) 2 घंटा का एक ही मात्रा के साथ बदलेंpipetting द्वारा अभिकर्मक से पहले।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक के एक सदस्य आधारित मिश्रण और लक्ष्य siRNA (siClock) या 50 एनएम से 50 एनएम तैयार निर्माता के निर्देशों के अनुसार गैर-लक्ष्य siControl।
      1. 3 बूंदों के साथ एक डिश के लिए सदस्य प्रत्येक के 200 μl के साथ दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार करते हैं।
      2. इन ट्यूबों अभिकर्मक अभिकर्मक के 4 μl में से एक में जोड़े।
      3. उचित siRNA शेयर समाधान (20 माइक्रोन) के दूसरे ट्यूब 1 μl जोड़ें।
      4. 5 मिनट के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन पर धीरे-धीरे इन दो नलियों आंदोलन और फिर एक साथ ट्यूब की सामग्री मिश्रण है और 20 से अधिक मिनट के लिए आंदोलन।
    3. महाप्राण 100 प्रत्येक बूंद से सदस्य के μl और pipetting द्वारा पिछले चरण में प्राप्त अभिकर्मक मिश्रण का एक ही मात्रा के साथ बदलें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 4 घंटे के बाद CMRL माध्यम के साथ अभिकर्मक समाधान बदलें। दोहराएँ कदम 2.1.1-2.1.3 सेल फिर से अभिकर्मक के लिए अगले दिन।
  2. मानव myotubes की siRNA अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक पहले, मध्यम (कदम 1.2.2.8 देखें) प्रति 3.5 सेमी पेट्री डिश ताजा भेदभाव माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    2. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, 20 एनएम siRNA (siControl या siClock) है, जो एक 20 माइक्रोन siRNA समाधान के 2.4 μl, और भेदभाव माध्यम के 100 μl में पतला अभिकर्मक अभिकर्मक के 12 μl से मेल खाती का एक मिश्रण तैयार करें। कोमल आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में प्रति 3.5 सेमी पेट्री डिश और जगह कोशिकाओं siRNA मिश्रण के 114.4 μl और 5% से 24 घंटे के लिए सीओ 2 के साथ Transfect कोशिकाओं।

3. लगातार लंबी अवधि के Circadian Bioluminescence रिकॉर्डिंग जीवित मानव प्राथमिक कोशिकाओं में हार्मोन के स्राव के आकलन के साथ समानांतर में किया

  1. द्वारा मानव प्राथमिक कोशिकाओं में Circadian Bioluminescence रिपोर्टर का परिचयlentiviral पारगमन
    नोट: lentiviral कणों के साथ सभी प्रक्रियाओं एजेंटों कि कर्मियों और पर्यावरण के लिए एक मध्यम संभावित खतरा पैदा साथ काम करने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतने के लिए एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में किया जाना चाहिए।
    1. द्वारा संवाददाता lentiviral कणों तैयार सह transfecting ब्याज pLenti6.4 के वेक्टर / R4R2 / वी 5-गंतव्य / Bmal1 ल्यूक या pLV156-Per2-dLuc (बुलाया Bmal1 ल्यूक और Per2 ल्यूक, क्रमश) lentiviral वैक्टर pMD2G साथ प्लाज्मिड 31 और पॉलीएथिलएमीन विधि का उपयोग 293T कोशिकाओं में psPAX (विस्तृत प्रक्रिया के लिए संदर्भ 16 देखें)।
    2. प्राप्त lentiviral कणों titrate (अनुमापन पर विवरण http://lentilab.unige.ch/ पर प्राप्त किया जा सकता है)। आगे के प्रयोगों के लिए, titers 10 4 से लेकर 10 5 transducing इकाइयों [टीयू / μl] के साथ lentiviruses का उपयोग करें।
    3. मानव आइलेट कोशिकाओं या (30-50% confluency पर) मानव myoblasts लामिना का प्रवाह केबिन के अंदर के साथ प्लेस व्यंजनएट और ताजा पूरक CMRL मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ मध्यम जगह या मध्यम विकास (कदम 1.2.2.2 देखें) क्रमश: (कदम 1.1.7 देखें)।
    4. संक्रमण की बहुलता (MOI) (यानी संक्रामक कणों (इकाइयों transducing) कोशिकाओं की / संख्या) की गणना।
    5. आदेश में एक MOI = 3 प्राप्त करने के लिए डिश के लिए lentivirus समाधान pipetting द्वारा प्राथमिक सेल संस्कृति transduce (उदाहरण के लिए, 65,000 के लिए संलग्न कोशिकाओं वायरस समाधान के 3 μl 6.5 x 10 4 से 100 μl मध्यम बूंद के अनुमापांक के साथ जोड़ने के लिए)।
    6. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं। अगले दिन मध्यम बदलें।
      नोट: आदेश संवाददाता का निर्माण के लिए पर्याप्त अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए मानव आइलेट कोशिकाओं को कम से कम 4 दिनों bioluminescence रिकॉर्डिंग से पहले transduce। Myoblasts विस्तार के चरण के दौरान transduced कर रहे हैं, तो संगम हो, और बाद में myotubes में विभेदित।
  2. मानव प्राथमिक कोशिकाओं की इन विट्रो तुल्यकालन में
      <li> प्रति 3.5 सेमी पेट्री डिश प्राथमिक कोशिकाओं में पहले कदम 3.1.5 में transduced युक्त मध्यम के 2 मिलीलीटर में adenylyl साइक्लेज उत्प्रेरक के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    1. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. रिकॉर्डिंग 100 माइक्रोन के luciferin युक्त मध्यम के 2.5 मिलीलीटर के साथ adenylyl साइक्लेज उत्प्रेरक युक्त मध्यम बदलें।
      नोट: के लिए मानव आइलेट कोशिकाओं का उपयोग CMRL 10% FBS के साथ पूरक, 1% एल alanyl-एल glutamine dipeptide, 1% पी / एस, 1% gentamycin; के लिए मानव myotubes लाल फिनोल का उपयोग करें - 1 जी के साथ मुक्त DMEM / एल ग्लूकोज 2% FBS, साथ पूरक 2% एल alanyl-एल glutamine dipeptide, 1% पी / एस, 0.5% और 0.2% gentamycin amphotericin बी

सिंक्रनाइज़ मानव स्रावी प्राथमिक कोशिकाओं में circadian Bioluminescence रिकॉर्डिंग और हार्मोन के स्राव प्रोफाइल की 4. समानांतर आकलन

  1. मानव प्राथमिक कोशिकाओं के लिए लंबे समय तक लगातार Perifusion और Bioluminescence रिकॉर्डिंग की स्थापना।
    नोट: जब काम बहिष्कारलामिना का प्रवाह कैबिनेट, स्वच्छ सभी संपर्क सतहों आईडीई और संक्रमण से बचने के लिए हवा के लिए संस्कृतियों या माध्यम के निवेश की सीमा।
    1. perifusion मध्यम तैयार करते हैं, मध्यम करने के लिए luciferin के 100 सुक्ष्ममापी जोड़ें।
      नोट: के लिए मानव आइलेट कोशिकाओं का उपयोग CMRL 10% FBS के साथ पूरक, 1% एल alanyl-एल glutamine dipeptide, 1% पी / एस, 1% gentamycin; के लिए मानव myotubes लाल फिनोल का उपयोग करें - 1 जी के साथ मुक्त DMEM / एल ग्लूकोज 2% FBS, साथ पूरक 2% एल alanyl-एल glutamine dipeptide, 1% पी / एस, 0.5% और 0.2% gentamycin amphotericin बी
    2. लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर, जैसा कि ऊपर वर्णित transduced ट्रांसफ़ेक्ट और सिंक्रनाइज़ प्राथमिक सेल संस्कृतियों (आइलेट कोशिकाओं या myotubes) युक्त 3.5 सेमी व्यंजन खुला। 3.5 सेमी व्यंजन है कि सिलिकॉन तांता / तपका को जोड़ने ट्यूब (चित्रा 1B1 / बी 5) के साथ लैस कर रहे हैं में बाँझ धातु कैप्स (घर में विकसित) (चित्रा 1B2) डालें।
    3. माप मंच पर व्यंजन 37 डिग्री सेल्सियस एल में जगहight तंग इनक्यूबेटर। एक screwable एडाप्टर (चित्रा 1B3) का उपयोग करके मंच करने के लिए बर्तन को ठीक करें। टोपी (चित्रा 1B1 / बी 5) के उचित सिलिकॉन ट्यूब में perifusion प्रणाली का तांता / तपका नलियों डालें और 1 घंटा प्रति मध्यम के 0.5 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर पंप की गति निर्धारित ~।
    4. घर में विकसित ड्रिप-biolumicorder सॉफ्टवेयर है कि photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) डिटेक्टर से संकेत रिकॉर्ड खोलें। निर्देशिका जहां डाटा संग्रहित किया जाएगा और सतत bioluminescence "शुरू" आइकन पर क्लिक करके प्रत्येक पकवान से रिकॉर्डिंग शुरू चुना है।
      नोट: वैकल्पिक ड्रिप-biolumicorder सॉफ्टवेयर करने के लिए, अन्य कार्यक्रमों (जैसे LumiCycle), पीएमटी डिटेक्टर से संकेत रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    5. बर्फ पर संग्रह बॉक्स में बाँझ 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें रखें।
    6. नियंत्रण सॉफ्टवेयर है कि संग्रह कुओं के बीच स्वचालित स्विच के समय को नियंत्रित करता खोलें। समय डब्ल्यू सेट अपमध्यम संग्रह (एसईसी) के indow। बहिर्वाह माध्यम के संग्रह शुरू हर 4 घंटा (14,400 सेकंड; ~ 2 प्रति समय बिंदु एमएल) "रन" आइकन पर क्लिक करके।
    7. pipetting द्वारा बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूबों में अच्छी तरह से एक संग्रह से स्थानांतरण और बहिर्वाह मध्यम उपाय। अगले कदम के शुरू करने से पहले एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूबों रखें। दोहराएँ कदम 4.1.5-4.1.6 हर 24 घंटा।
    8. bioluminescence रिकॉर्डिंग और इसी सॉफ्टवेयर पर "रोक" आइकन पर क्लिक करके मध्यम प्रवाह बंद करो। धातु टोपी निकालें और व्यंजन से अवशिष्ट मध्यम aspirate।
    9. क्रम में विभिन्न प्रयोगों में प्राप्त स्रावित प्रोटीन मूल्यों को सामान्य करने के लिए, या तो निकालने डीएनए (myotubes 19 के लिए जीनोमिक डीएनए सामग्री द्वारा सामान्यीकरण), या करने के लिए (आइलेट कोशिकाओं 18 के लिए कुल हार्मोन सामग्री द्वारा सामान्यीकरण) सेल एसिड इथेनॉल बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने में व्यंजन।

5. मापने आइलेट हार्मोन और Myokine बहिर्वाह में स्तरमध्यम मानव प्राथमिक endocrine कोशिकाओं की सतत Perifusion द्वारा प्राप्त की

  1. इंसुलिन
    1. एक मानव इंसुलिन एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट निर्माता के निर्देशों का पालन का उपयोग करके एकत्र समय अंक से बहिर्वाह माध्यम में बेसल इंसुलिन का स्तर यों।
    2. प्रत्येक कुएं में और कुल इंसुलिन सामग्री एकत्र करने के लिए माध्यम की पूर्ण मात्रा प्रयोग (कदम 4.1.9), 18 के अंत में एसिड इथेनॉल इलाज कोशिकाओं से निकाले करने के लिए डेटा मानक के अनुसार।
  2. इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6)
    1. मात्रा ठहराना बेसल आईएल -6 निर्माता के निर्देशों के बाद एक मानव आईएल -6 एलिसा किट का उपयोग करके एकत्र समय अंक से बहिर्वाह माध्यम में स्तरों।
    2. प्रत्येक कुएं में और प्रयोग (कदम 4.1.9) के अंत में जीनोमिक डीएनए सामग्री एकत्र करने के लिए माध्यम की पूर्ण मात्रा करने के लिए डेटा मानक के अनुसार।

Biolumines के लिए 6. Circadian डेटासेट विश्लेषणcence और हार्मोन के स्राव प्रोफाइल

  1. bioluminescence विश्लेषण
    1. प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 19 bioluminescence प्रोफ़ाइल का विश्लेषण।
  2. JTK-चक्र विश्लेषण
    1. JTK_CYCLE एल्गोरिथ्म 32 का उपयोग करके हार्मोन के स्राव प्रोफाइल और bioluminescence रिकॉर्डिंग परिणामों का विश्लेषण।
    2. 20-24 घंटा पर circadian अवधि चौड़ाई सेट करें।
      नोट: मामले में प्रयोगात्मक शर्तों समानांतर में दर्ज किए गए, एक बनती सांख्यिकीय विश्लेषण प्रयोगों तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
  3. CosinorJ विश्लेषण
    1. वैकल्पिक रूप से, हार्मोन के स्राव और circadian bioluminescence प्रोफाइल CosinorJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 28 का विश्लेषण।

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Representative Results

Perifused मानव आइलेट कोशिकाओं से समानांतर Circadian Bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ आइलेट हार्मोन के स्राव का आकलन

Circadian घड़ी के लिए पहली बार एक आणविक लक्षण वर्णन प्रदान करने के बाद, मानव आइलेट कोशिकाओं 16 में ऑपरेटिव, हम आइलेट समारोह और प्रतिलेखन 18 पर घड़ी व्यवधान के प्रभाव का अध्ययन करने के उद्देश्य से। के रूप में circadian bioluminescence की रूपरेखा 18 से मापा हम बिखरे मानव आइलेट कोशिकाओं में एक कुशल siClock अभिकर्मक प्रोटोकॉल (विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें) है, जो घड़ी mRNA की 80% से अधिक पछाड़ना में हुई, और कुशल घड़ी पृथक में स्थापित की। ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन के स्राव (GSIS) विश्लेषण काफी बेसल कम और ऐसी घड़ी व्यवधान पर इंसुलिन के स्राव को प्रेरित पता चला (नहीं दिखाया गया है)। मानव आइलेट कोशिकाओं द्वारा हार्मोन के स्राव का आकलन करने के दिन-रात, एक Continuous perifusion प्रणाली एक luminometer (चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) से जुड़ा था। मानव कोशिकाओं आइलेट, असर एक कार्यात्मक (siControl) या बेकार (siClock) थरथरानवाला Bmal1 ल्यूक lentiviral कणों के साथ transduced थे। कोशिकाओं बाद adenylyl साइक्लेज उत्प्रेरक की एक नाड़ी 48 घंटा (चित्रा 1 सी, डी 18) के दौरान circadian bioluminescence और बहिर्वाह माध्यम में इंसुलिन के स्राव के समानांतर विश्लेषण द्वारा पीछा के साथ सिंक्रनाइज़ कर रहे थे। इन प्रयोगों का सुझाव है कि लगातार शारीरिक ग्लूकोज एकाग्रता (5.6 मिमी ग्लूकोज), इन विट्रो सिंक्रनाइज़ मानव आइलेट कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन के स्राव के तहत एक circadian प्रोफ़ाइल, जो siClock असर नमूने (चित्रा -1) में बाधित है दर्शाती है।

उपस्थिति या कार्यात्मक घड़ी के अभाव में Myokine स्राव के अध्ययन के लिए इन विट्रो में मानव कंकाल myotubes सिंक्रनाइज़ द्वारा

33 में ग्लूकोज चयापचय के नियमन में कंकाल की मांसपेशी घड़ी की संभावित भूमिका को देखते हुए, हम प्राथमिक मानव कंकाल में circadian लय निस्र्पक के उद्देश्य से myotubes और myotube समारोह 19 में उनकी भूमिका की जांच कर रही है। यह अंत करने के लिए, कंकाल myotubes में circadian घड़ी के विघटन siRNA को निशाना घड़ी परासंक्रमित द्वारा हासिल की थी। Bmal1 ल्यूक और Per2 ल्यूक पत्रकारों के साथ circadian bioluminescence रिपोर्टर assays से पता चला है कि मानव कंकाल myotubes, इन विट्रो में सिंक्रनाइज़, एक आत्मनिर्भर circadian ताल है, जो आगे अंतर्जात कोर घड़ी प्रतिलिपि अभिव्यक्ति द्वारा पुष्टि की गई है (चित्रा 2 बी, 19) दिखा रहे हैं। इस अंतर्जात घड़ी कुशलता siRNA को निशाना घड़ी की उपस्थिति (चित्रा 2 बी) में बाधित किया गया था। इसके अलावा, आईएल -6 (चित्रा 2 सी) के बेसल स्राव, इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8)और Monocyte कीमोटैक्टिक प्रोटीन 1 (एमसीपी-1) (नहीं दिखाया गया है) सिंक्रनाइज़ कंकाल myotubes, यहाँ वर्णित perifusion प्रणाली (चित्रा 1 बी) और बाद में बड़े पैमाने पर myokine मल्टीप्लेक्स विश्लेषण (नहीं दिखाया गया है), के द्वारा मूल्यांकन द्वारा एक circadian प्रोफ़ाइल दर्शाती है, जो दृढ़ता से घड़ी व्यवधान (चित्रा -2 सी 19) पर dysregulated।

आकृति 1
चित्रा 1: Perifused मानव आइलेट कोशिकाओं से समानांतर Circadian Bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ हार्मोन के स्राव का आकलन (ए) संलग्न मानव आइलेट कोशिकाओं आइलेट हदबंदी के बाद एक दिन के प्रतिनिधि तस्वीर।। (बी) के घर में बने perifusion प्रणाली है कि perifusion माध्यम के साथ एक बोतल, एक पंप, एक माप एक photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) प्रकाश तंग इनक्यूबेटर के भीतर के साथ सुसज्जित मंच में शामिल की योजनाबद्ध प्रस्तुति, एक luminometer डिवाइस, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित है, और एक semiautomatic नमूना कलेक्टर। सम्मिलित करें: (बी 1) बाढ़ जोड़ने ट्यूब; (बी 2) 3.5 सेमी पेट्री डिश के लिए धातु टोपी; (बी 3) screwable एडाप्टर है कि माप मंच (बी 4) को टोपी देता है; (बी 5) तपका जोड़ने ट्यूब; (बी -6) स्वचालित रूप से मध्यम वितरक को नियंत्रित किया। (सी) मानव आइलेट कोशिकाओं या तो तले siRNA (siControl) या siRNA को निशाना घड़ी (siClock) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और Bmal1 ल्यूक पत्रकार के साथ transduced थे। कोशिकाओं को लगातार 5.6 मिमी ग्लूकोज युक्त मध्यम संस्कृति के साथ perifused थे। Circadian bioluminescence एक adenylyl साइक्लेज उत्प्रेरक नाड़ी द्वारा तुल्यकालन के बाद दर्ज किया गया था। (डी) इंसुलिन के स्तर को 48 घंटे के दौरान हर 4 घंटा एकत्र बहिर्वाह नमूनों में एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया। JTK_CYCLE एल्गोरिथ्म 32 के आवेदन की पुष्टि की है कि पी मेंएक कार्यात्मक घड़ी (siControl), स्रावित इंसुलिन की औसत प्रोफ़ाइल के resence 24.19 ± 0.89 घंटे की अवधि की लंबाई के साथ 48 घंटे के भीतर circadian था, (** पी = 0.009, n = 7 दाताओं)। इस circadian घड़ी प्रोफ़ाइल व्यवधान (siClock) पर खो गया था। डेटा कुल हार्मोन सामग्री से स्रावित हार्मोन के% के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (मतलब ± SEM) के लिए एन = 7 दाताओं (प्रत्येक दाता के लिए एक दोहराने) .इस आंकड़ा संदर्भ में 18 से संशोधित किया गया है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।

चित्र 2
चित्रा 2:। बेसल आईएल -6 स्राव मानव कंकाल myotubes से दृढ़ता से एक कार्यात्मक circadian घड़ी के अभाव में हिचकते है myoblasts lentiviral कणों के साथ transduced थेBmal1 ल्यूक ट्रांस्जीन, myotubes में भेदभाव, और या तो siControl या siClock siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। 24 घंटा अभिकर्मक के बाद, myotubes एक adenylyl साइक्लेज उत्प्रेरक नाड़ी के साथ सिंक्रनाइज़ और समानांतर bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ निरंतर perifusion के अधीन थे। (ए) प्रतिनिधि चित्रों के 20% से 2% मध्यम युक्त myotubes भेदभाव प्रेरित करने के लिए एफबीएस से स्विच अगले दिन 0 (D0) और D7 पर ले जाया गया। भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, मानव myoblasts पुनर्भिविन्यासित कर रहे हैं, लम्बी हो गई और एक plurinuclated संकोश के लिए फार्म एक साथ फ्यूज। (बी) siControl की Bmal1 ल्यूक bioluminescence प्रोफाइल -transfected myotubes (काला लाइन) और siClock -transfected myotubes (ग्रे लाइन)। Bmal1 ल्यूक दोलन प्रोफाइल तीन स्वतंत्र प्रयोगों (प्रयोग के प्रति एक दाता) में दर्ज किए गए। (सी) प्रतिनिधि बेसल आईएल -6 स्रावउपस्थिति या एक कार्यात्मक घड़ी के अभाव में प्रोफ़ाइल। perifusion बहिर्वाह मध्यम 48 घंटे के दौरान 4 घंटा के अंतराल में एकत्र किया गया था (0-4 0 घंटा और 4 घंटा के बीच आईएल -6 के संचय से मेल खाती है)। मध्यम में आईएल -6 का स्तर तीन स्वतंत्र प्रयोगों से दो तकनीकी डुप्लिकेट में एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया। परिणाम बेसल आईएल -6 का स्तर कुल डीएनए सामग्री के लिए सामान्यीकृत प्रतिनिधित्व करते हैं। आईएल -6 स्राव circadian घड़ी व्यवधान पर 69.30 ± 10.61% की औसत पर कम हो गया था (SEM ± मतलब है, एन = 3; * पी <0.05, बनती टी परीक्षण)। यह आंकड़ा संदर्भ 19 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रयोगात्मक यहाँ वर्णित सेटिंग्स, सुसंस्कृत मानव प्राथमिक कोशिकाओं में circadian bioluminescence पत्रकारों के lentiviral वितरण से बना रहे हैं बाद में इन विट्रो तुल्यकालन और कई दिनों के लिए bioluminescence की सतत रिकॉर्डिंग, और एक ही कोशिकाओं द्वारा हार्मोन के स्राव के समानांतर विश्लेषण द्वारा पीछा किया। वे आणविक तंत्र और मानव प्राथमिक कोशिकाओं में circadian घड़ियों के कार्यात्मक पहलुओं की खोज के लिए एक कुशल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं।

दाता सामग्री की गुणवत्ता व्यवहार्य प्राथमिक ऊतक संस्कृतियों की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। मानव टापू की गुणवत्ता में प्रयोग शुरू करने से पहले हर बार मूल्यांकन किया जाना चाहिए। अनुमान पवित्रता या / और 70% करने के लिए अवर व्यवहार्यता के साथ आइलेट्स इन प्रयोगों के लिए सिफारिश नहीं कर रहे। आइलेट कोशिकाओं अलग संस्कृतियों, जो अपने अस्तित्व और समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता में संपर्कों को फिर से स्थापित करने के लिए करते हैं। चूंकि आइलेट कोशिकाओं घन में पैदा नहीं करतेlture, वे एक उच्च घनत्व है, जो कोशिकाओं पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ संपर्क स्थापित करने के लिए अनुमति देता है पर चढ़ाया जाना चाहिए। यह एक छोटी मात्रा की बूंदों में चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा हासिल की है। महत्वपूर्ण बात है, कोशिका मृत्यु कम घनत्व आइलेट सेल संस्कृतियों में अधिक है। ध्यान दें कि मध्यम प्रतिस्थापन क्रम में सेल सुखाने से बचने के लिए तुरंत किया जाना चाहिए।

Myoblasts, 60% संगम पर अधिमानतः passaged किया जाना चाहिए के बाद से एक उच्च घनत्व myoblast भेदभाव उत्पन्न हो सकता है। trypsinization के बाद, myoblasts ध्यान से resuspended और सेल समूहों से बचने के लिए तितर-बितर किया जाना चाहिए।

प्राथमिक कोशिकाओं के बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण perifusion परख शुरू करने से पहले microscopically बाहर रखा जाना चाहिए। संस्कृति के माध्यम रोधी पदार्थों के साथ पूरक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, perifusion ट्यूबिंग शराब आयोडीन कीटाणुशोधन / बाँझ पानी और धातु कैप्स द्वारा rinsed होना चाहिए autoclaving द्वारा निष्फल होना चाहिए। ये कदम प्रत्येक ई के बीच सिफारिश कर रहे हैंxperiment।

कुशल bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए, संवाददाता lentivirus तैयारी की गुणवत्ता bioluminescent संकेत की तीव्रता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। समस्या निवारण सहित lentivirus उत्पादन का ब्यौरा http://lentilab.unige.ch/ पर पाया जा सकता है। lentivirus उत्पादन के लिए अभिकर्मक प्लाज्मिड पहले, 293T कोशिकाओं 30-50% संगम पर चढ़ाया जाना चाहिए। यह अत्यधिक अभिकर्मक दक्षता के लिए एक नियंत्रण सीएमवी-GFP या एक वैकल्पिक फ्लोरोसेंट lentivector का उपयोग करके उदाहरण के लिए, एक समानांतर डिश में प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। प्रत्येक वायरस तैयारी के लिए वायरस अनुमापांक स्थापित किया जाना चाहिए।

वर्णित प्रयोगों आम तौर पर लंबे समय से स्थायी कर रहे हैं (48 घंटा या अधिक), यह इस समय अवधि के दौरान स्थिर मुंह बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है। siRNA की एकाग्रता siRNA अभिकर्मक प्रोटोकॉल के अनुसार सेल confluency के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जाना चाहिए। जीन मुंह बंद करने की क्षमता experime के अंत में परीक्षण किया जाना चाहिएNT RT-qPCR द्वारा या पश्चिमी सोख्ता द्वारा।

perifusion के दौरान, प्रवाह की दर समय पूरी तरह से थाली में मध्यम का आदान-प्रदान करने के लिए आवश्यक निर्धारित करता है, लेकिन यह भी प्राथमिक सेल संस्कृति पर एक यांत्रिक प्रभाव पड़ता है। दरअसल, एक दर है, जो बहुत कम है पर प्रवाह की स्थापना, डिश में मध्यम की एक पूरी आदान प्रदान के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी, और विधि की संवेदनशीलता कम हो जाएगा। इसके विपरीत, एक उच्च गति के प्रवाह की दर कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। हमारे हाथ में, दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए इष्टतम गति 1 घंटा प्रति बहिर्वाह माध्यम की 0.5 मिलीलीटर इकट्ठा करने के लिए अनुमति दे दी।

महत्वपूर्ण बात है, बहिर्वाह माध्यम में पदार्थों के एक औसत दर्जे एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, स्रावित कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में perifused डिश में मौजूद होना चाहिए। secreted पदार्थ का पता लगाने के लिए विधि का पालन करें (एलिसा या अन्य) विशेष रूप से बहुत कम मात्रा में स्रावित पदार्थों के लिए काफी संवेदनशील होना चाहिए। उच्चतर सेल घनत्व पर काबू पाने के लिए सिफारिश की जा सकती हैइस समस्या को जब संभव। वैकल्पिक रूप से, बहिर्वाह माध्यम के रूप में संदर्भ 19 में विवरण में हमारे द्वारा वर्णित है, डायलिसिस द्वारा या केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ ध्यान केंद्रित किया जा सकता है।

मानव अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं में और प्राथमिक myotubes में साथ में ले ली हमारे प्रयोगों पहली बार सम्मोहक सबूत के लिए प्रदान करते हैं कि ये मानव कोशिकाओं उच्च आयाम सेल स्वायत्त circadian घड़ियों 18-19 के पास है। एक luminometer डिवाइस (चित्रा 1 बी) हम दिखा दिया है कि इन घड़ियों अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं द्वारा बेसल इंसुलिन के स्राव के circadian विनियमन (चित्रा -1) में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, के साथ और कंकाल myotubes द्वारा बेसल IL6 स्राव के संयुक्त यहाँ वर्णित perifusion प्रणाली को रोजगार (चित्रा -2)। इसके अलावा, दोनों प्रायोगिक प्रणाली में कोर घड़ी जीन घड़ी नीचे दस्तक द्वारा, हम बताते हैं कि एक कार्यात्मक circadian थरथरानवाला उचित लयबद्ध इंसुलिन और आईएल -6 स्राव के लिए आवश्यक हैमानव आइलेट और कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं में क्रमश: (आंकड़े 1 सी, डी और 2 बी, सी) द्वारा। हमारे परिणाम उचित इंसुलिन के स्राव के लिए मानव आइलेट घड़ी की एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत मिलता है, और कृंतक आनुवंशिक मॉडल 15,17 में प्रदर्शन काम करता है के साथ अच्छे समझौते में हैं। जीवों दैनिक पर्यावरण परिवर्तन की आशा के बजाय उन पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देने में circadian घड़ी की प्रमुख भूमिका को देखते हुए, बेसल इंसुलिन और myokine स्राव के circadian विनियमन इस तरह के एक अग्रिम व्यवस्था है कि बाकी के लिए अग्नाशय आइलेट और कंकाल की मांसपेशी स्रावी गतिविधियों का समन्वय प्रतिनिधित्व हो सकता है पूरे शरीर की गतिविधि चक्र।

यहां प्रस्तावित पद्धति आसानी से एक ही ऊतकों से अतिरिक्त हार्मोन के स्राव का अध्ययन करने के क्रम में संशोधित किया जा सकता है। हम पहले से ही कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं द्वारा स्रावित myokines के एक अतिरिक्त बड़े पैनल का विश्लेषण किया है, मल्टीप्लेक्स मानव myokine सरणियों 19 का उपयोग कर, और हम आकलन की प्रक्रिया में हैंग्लूकागन एलिसा किट का उपयोग मानव आइलेट कोशिकाओं द्वारा ग्लूकागन स्राव आईएनजी (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, इन प्रयोगात्मक शर्तों अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के प्राथमिक adipocytes के लिए, adipokine स्राव, थायराइड हार्मोन के स्राव, अध्ययन incretins स्राव, आदि के लिए इस प्रणाली का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण आवेदन करने के लिए हो सकता है के लिए प्राथमिक एन्तेरोच्य्तेस के अध्ययन के लिए प्राथमिक thyrocytes के अध्ययन के लिए सेलुलर circadian घड़ी समारोह और स्राव पर शारीरिक और / या औषधीय यौगिकों के प्रभाव का पता लगाने। ब्याज की यौगिक (उच्च ग्लूकोज या मुक्त फैटी एसिड के विभिन्न स्तरों की उपस्थिति में मानव आइलेट कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन के स्राव का अध्ययन उदाहरण के लिए) पूरे प्रयोग के दौरान लगातार लागू किया जा सकता है, या यौगिक circadian की एक चुना चरण में जोड़ा जा सकता है चक्र।

इस तकनीक इन विट्रो अध्ययन की सीमाएं हैं और circadian ताल नियमित की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं करताएक पूरे शरीर स्तर पर आबादी। एक ही समय में, यह नियंत्रित परिस्थितियों में सेलुलर चयापचय पर एक स्वायत्त घड़ी की भूमिका में भेद करने में मदद करता है। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों विट्रो तुल्यकालन 17 में निम्न कोशिकाओं या explants में स्राव गतिविधि का स्नैपशॉट माप के आधार पर कर रहे हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक अनूठा तरीका एक ही सेल संस्कृति के भीतर circadian ताल और स्रावी गतिविधि का एक सुसंगत और निरंतर विश्लेषण की अनुमति का प्रतिनिधित्व करता है। वैकल्पिक रूप से, इस पद्धति, गैर circadian bioluminescent संवाददाताओं के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए सेल स्राव के साथ संयोजन के रूप में, साथ ही सेल समारोह पर perifusion माध्यम से जोड़ा विभिन्न पदार्थों के प्रभाव का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) कुशल lentivirus तैयारी, 2) siRNA और पत्रकार के साथ कुशल सेल अभिकर्मक पारगमन वैक्टर; 3) निरंतर मध्यम बहिर्वाह संग्रह और 4) सुनिश्चित कर रही है कि सीई के लिए पर्याप्त संख्याlls आदेश हार्मोन या एकत्र बहिर्वाह माध्यम में साइटोकिन्स के औसत दर्जे का स्तर प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है (निवारण ऊपर देखें)।

मनुष्य 3-4,28,34-35 में circadian घड़ी perturbations और चयापचय रोगों और कैंसर के बीच लिंक पर हाल ही में सबूत, प्राथमिक संस्कृतियों में मानव परिधीय घड़ी गुणों का अध्ययन संभावित घड़ी कनेक्शन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण और अद्वितीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकते ध्यान में रखते हुए इन रोगों के लिए। इस प्रकार, कार्यात्मक मानव अग्नाशय आइलेट और कंकाल की मांसपेशी घड़ी और इंसुलिन और myokines के बेसल स्राव के बीच संबंधों के अस्तित्व के बारे में हमारी खोज, मोटापा और टाइप 2 मधुमेह 18-19 के रूप में पुराने रोगों के विकास को समझने के लिए संभावित परिणाम भुगतने सकता है और इन रोगों के उपचार में नए रास्ते पर ले जायेगा। महत्वपूर्ण बात है, इन विट्रो मूल्यांकन थरथरानवाला विशेषताओं के बीच स्थापित सहसंबंध और के कारण इन विवो 36, रोगों की एक बानगी के रूप में मानव circadian घड़ी गुणों का निहितार्थ, उच्चतम और तत्काल नैदानिक प्रासंगिकता 20 की है।

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Acknowledgments

हम जिनेवा विश्वविद्यालय से हमारे सहयोगियों के लिए आभारी हैं: इस काम पर रचनात्मक टिप्पणियों के लिए जैक्स फिलिप, Ueli Schibler perifusion प्रणाली के विकास के साथ और वैज्ञानिक प्रेरणा के लिए अमूल्य मदद के लिए, के लिए कल्पना होने के डिजाइन, निर्माण और के कमीशन आन्द्रे Liani छिड़काव प्रणाली, perifusion प्रणाली और ड्रिप-biolumicorder सॉफ्टवेयर के विकास में सहायता के लिए Lesa-टेक्नोलॉजी लिमिटेड कंपनी, जॉर्ज Severi perifusion प्रयोगों के साथ सहायता के लिए, उर्सुला Loizides-मैनगोल्ड के लिए गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने, और lentivirus की तैयारी के लिए ऐनी-Marie Makhlouf ; एटीन Lefai, स्टेफ़नी Chanon और मानव प्राथमिक myoblasts की तैयारी के लिए हुबर्ट विडाल (INSERM, लियॉन) के लिए; और मानव टापू प्रदान करने के लिए डोमेनिको बॉस्को और थियरी Berney (मानव आइलेट ट्रांसप्लांटेशन Center, जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पताल) के लिए। यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान सं द्वारा वित्त पोषित किया गया 31003A_146475 / 1, सीnergia स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान सं CRSII3-154405, Fondation Romande डालना ला Recherche सुर Diabete, बो Hjelt फाउंडेशन, Fondation अर्न्स्ट एट लूसी Schmidheiny, और सोसाइटी Académique de Genève (सीडी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesium Invitrogen 14190-094
HAM F-10 Invitrogen 41550-021 For myoblasts culture
FBS Invitrogen 10270 Supplement to culture medium
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781-100 Supplement to culture medium
Gentamycin Axon  A1492.0001 Supplement to culture medium
Fungizone Invitrogen 15290-026 Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax  Invitrogen 21885-025 For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax Invitrogen 11880-028 Recording medium for LumiCycle
Glutamax Invitrogen 35050-028 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRL Gibco 21530-027 Culture medium for islet cells
Sodium Pyruvate Gibco 11360-039 Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube Falcon 352096
F75 flask BD Falcon 353136
3.5 cm Petri dish  BD Falcon 353001
Foskolin Sigma F6886 Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
Luciferin Prolume LTD 260150 Supplement to recording medium
OptiMEM  Invitrogen 51985-026 Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagent Invitrogen 13778-150 Transfection reagent
HiPerFect reagent Qiagen 301705 Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool  Dharmacon L-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) Dharmacon D-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit  Qiagen 69504 For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit  Qiagen 74104 For myotubes RNA extraction
QIAshredder  Qiagen 79654 For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubes Axygen 311-10-051 To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 Well BD Falcon  353046 To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit  Qiagen 74034 For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit  eBioscience 88-7066-22
Human Insulin Kit Mercodia Mercodia 10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a. Acros organics 124630010 Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%) Fluka Analytical 02860-1L Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for Research Prodo Laboratories
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R
Water bath VWR 1112A  at 37 °C
Tissu culture hood Faster  SafeFastElite
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i 5% CO2 at 37 °C
Shaker Heidolph Instruments Unimax 1010 For agitation of the siRNA mix
LumiCycle Actimetrics
LumiCycle software Actimetrics
CosinorJ software EPFL Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX  ERC GmbH Control software that controls the timing of the automated switch

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References

  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).

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आनुवंशिकी अंक 117 मानव अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं मानव कंकाल प्राथमिक myotubes circadian bioluminescence lentiviral पारगमन, निरंतर perifusion
मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन
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Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., … More

Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (117), e54673, doi:10.3791/54673 (2016).

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