Abstract
orologi circadiani sono funzionali in tutti gli organismi sensibili alla luce, consentendo un adattamento al mondo esterno anticipando cambiamenti ambientali giornalieri. Notevoli progressi nella nostra comprensione della stretta connessione tra l'orologio circadiano e la maggior parte degli aspetti della fisiologia è stato fatto nel settore negli ultimi dieci anni. Tuttavia, dipanando la base molecolare che sottende la funzione dell'oscillatore circadiano nell'uomo rimane di massima sfida tecnica. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un approccio sperimentale a lungo termine (2-5 giorni) di registrazione bioluminescenza e la raccolta media deflusso in cellule primarie umane in coltura. A questo scopo, abbiamo trasdotte cellule primarie con un reporter luciferasi lentivirale che è sotto il controllo di un gene promotore core clock, che consente la valutazione parallela della secrezione ormonale e bioluminescenza circadiani. Inoltre, si descrivono le condizioni per interrompere l'orologio circadiano in prcellule umane imary di transfezione siRNA OROLOGIO targeting. I nostri risultati sulla regolazione circadiano della secrezione di insulina da isole pancreatiche umane, e Myokine la secrezione da parte delle cellule muscolari scheletriche umane, sono qui presentati per illustrare l'applicazione di questa metodologia. Queste impostazioni possono essere utilizzati per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e di analizzare il loro impatto funzionale su cellule primarie in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.
Introduction
Il sistema di distribuzione circadiano (dal latino "Circa diem") è emerso in tutti gli organismi sensibili alla luce, come un meccanismo di adattamento alla rotazione della Terra. Nei mammiferi, è organizzato in modo gerarchico, che comprende l'orologio centrale, che si trova nel nucleo soprachiasmatico dell'ipotalamo ventrale e periferico (o slave) oscillatori che sono operativi in diversi organi. Inoltre, queste cellule autonome oscillatori auto-sostenuta sono funzionali in quasi ogni cellula del corpo 1. Segnali fotica rappresentano un segnale di sincronizzazione dominante (Zeitgeber) per i neuroni SCN, mentre segnali neurali e umorali provenienti dal SCN ripristinati gli orologi periferici. Inoltre i ritmi di attività-riposo, che guidano in cicli di alimentazione-digiuno di direzione, sono ulteriori sincronizzatori per orologi periferici 2. Secondo la nostra conoscenza attuale, la composizione molecolare del core clock si riferiscono al trascrizionale e TRADUCEanelli di retroazione zionali, che sono conservati tra gli organismi. Questo comprende gli attivatori trascrizionali Bmal1 e orologio, che insieme attivare la trascrizione dei geni negativi core clock PER and Cry. Alti livelli di PER e proteine CRY inibiscono la propria trascrizione attraverso l'inibizione del complesso / CLOCK BMAL1. Un circuito ausiliario è costituito dai recettori nucleari REV-erbs e specchi, che regolano anche la trascrizione di BMAL1 e CLOCK. Inoltre, gli eventi post-traduzionali tra fosforilazione, sumoylation, acetilazione, O-GlcNAcylation, il degrado e l'ingresso nucleare delle proteine core clock rappresentano un importante livello normativo aggiuntivo che istituisce la 24 ore ciclo di oscillazione 3.
Prove accumulando deriva da studi in modelli di roditori e mette in evidenza il ruolo fondamentale del sistema circadiano nel coordinamento delle funzioni metaboliche ed endocrine 4-5. Un certo numero di large-scala analisi del trascrittoma suggeriscono che l'alimentazione - cicli di digiuno svolgono un ruolo centrale nella sincronizzazione degli oscillatori periferici 6-8. In un accordo con questi studi, analisi metabolomica e lipidomico nei roditori e nell'uomo hanno rivelato che un gran numero di metaboliti oscillare nei tessuti, plasma, e saliva in modo circadiano 9-11. È importante sottolineare che la maggior parte degli ormoni mostrano ritmi circadiani in 5,12-13 sangue. Inoltre, gli orologi circadiani del corrispondente ormone che produce tessuti periferici potrebbero regolare la secrezione dell'ormone a livello locale. Oscillatori circadiani cellule autonome sono stati descritti in roditori e pancreatiche umane isolotto cellule 14-16. Questi oscillatori svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del trascrittoma di isole pancreatiche e la funzione 15,17-18. Inoltre, Myokine secrezione da miotubi scheletrici umani è stato recentemente dimostrato di esibire un ritmo circadiano, che è regolata da oscillato cellula-autonomars operative in queste cellule 19.
Diversi approcci per studiare ritmi circadiani nell'uomo in vivo sono stati ampiamente utilizzati. Per esempio, la melatonina plasma o livelli di cortisolo, così come la temperatura superficiale della pelle del torace (rivisto in riferimenti 3,20) sono stati studiati per valutare gli orologi circadiani endogeni. Anche se questi metodi consentono lo studio delle oscillazioni circadiani sistemica in vivo, sono lungi dal fornire una valutazione affidabile dei ritmi circadiani autonome free-running in diversi organi e tessuti. Tuttavia, tale dissezione dalla regolazione sistemica sarebbe uno strumento indispensabile per comprendere l'effetto specifico di orologi molecolari intracellulari sulla funzione di queste cellule. Di conseguenza, un notevole sforzo è stato intrapreso per sviluppare approcci affidabili per lo studio orologi umane in cellule in coltura immortalizzate o primari sincronizzati in vitro. Importante, è stato dimostrato checaratteristiche di clock misurata in cellule primarie di fibroblasti cutanei riflettono da vicino le singole proprietà di clock di tutto l'organismo 21. Lo sviluppo di giornalisti circadiani fluorescenti e bioluminescenti è notevolmente avanzato questo approccio 22-27. Inoltre, studiando gli orologi cellulari primarie che sono derivati da diversi organi periferici consente per lo studio delle proprietà molecolari di orologi specifici tessuti umani 3,5,16,19-20,28. Quindi, la valutazione di orologi circadiani in espianti primari sincronizzati in vitro o cellule, utilizzando reporter bioluminescenti, rappresenta un metodo molto utile per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e il loro impatto sulla funzione degli organi.
In questo articolo, vi presenteremo protocolli dettagliati per valutare l'espressione genica circadiani nelle cellule delle isole primaria e muscolo scheletrico umano sincronizzati in vitro, così come l'impatto di orologio cellulare autonomainterruzione sulla funzione secretoria di queste cellule.
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Protocol
Dichiarazione etica: Manipolazioni incluse in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico del Policlinico Universitario di Ginevra e dal Comitato Etico SUD EST IV (Accordo 12/111) 19. Isole umane sono state isolate dal pancreas di morte cerebrale donatori multiorgano nel trapianto Centro Isolotto presso l'Ospedale Universitario di Ginevra (Svizzera), come descritto da noi in riferimenti 16,18, o ottenuti da una fonte commerciale.
1. Preparazione di colture primarie
- Delle isole pancreatiche umane isolamento, dissociazione e la cultura
NOTA: Cappotto ogni tubo, punta di plastica o pipetta con Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) media al fine di prevenire o isolotti isolotto cellule di attaccarsi alla superficie di plastica, che può portare a una significativa perdita di materiale cellulare.- Un giorno prima isolotto dissociazione delle cellule aggiungere 1 ml di matrice extracellulare ricca laminina-5-(derivato da 804G cellule come descriletto in riferimento 29) per 3,5 centimetri piatto. Prima di placcatura cellule, aspirare la matrice e lavare il piatto 3 volte con acqua bi-distillata sterile. Lasciare che il piatto ad asciugare sotto la cappa a flusso laminare per 5 min.
- All'interno della cappa a flusso laminare, distribuire le isolette ottenuti con medie CMRL in 15 ml di tubo (s). Centrifugare a 272 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile di Dulbecco (DPBS) pre-riscaldato a 37 ° C senza calcio e magnesio. Centrifugare a 272 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di DPBS.
- Per contare il numero totale di isolotti, pipetta 10 ml di sospensione isolotto 1 ml in un nuovo piatto 3,5 centimetri. Contare il numero di isole nella goccia 10 microlitri al microscopio e da questa calcolare il numero totale di isolotti nella sospensione isolotto 1 ml. Aggiungere 14 ml di DPBS e centrifugare la sospensione cellulare un'altratempo a 272 xg per 5 min.
- Per la dissociazione delle cellule insulari, aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di soluzione il distacco delle cellule per un massimo di 1.000 equivalenti di isole (IEQ). Porre il tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C e mescolare delicatamente gli isolotti pipettando su e giù parecchie volte ogni minuto, durante 6-10 min.
NOTA: Per controllare la qualità della digestione, pipettare una goccia 2 ml di sospensione su un vetrino e controllare sotto il microscopio che tutte le cellule sono ben separati, e che non doppiette o grumi di cellule sono rimaste. - Arrestare la reazione aggiungendo 14 ml di freddo CMRL con i supplementi (10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% di penicillina-streptomicina (P / S), 1% di gentamicina, 1 % piruvato di sodio). Centrifugare a 425 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 15 ml di terreno CMRL al pellet.
- Risospendere il pellet in un piccolo volume di CMRL con supplementi. Contare il numero di cellule al microscopio utilizzando un hemocytometro, regolare il volume CMRL in modo da ottenere una concentrazione cellulare di ~ 650, 000 cellule / ml.
- Pipettare 3 separato gocce di 100 microlitri ciascuno dalla sospensione cellulare dispersa ottenuto nello stadio 1.1.8 in 3,5 centimetri piatto pre-rivestito con laminina.
NOTA: Le cellule allegare al piatto in circa 24 ore. - Incubare le cellule (Figura 1A) in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C in una camera umida. Cambiare il mezzo della cella scende ogni 2-3 giorni aspirando 100 microlitri da ogni goccia e sostituendolo con lo stesso volume di mezzo fresco.
- Primari umani mioblasti, Cultura e differenziazione in miotubi
- Biopsia del tessuto, l'isolamento delle cellule satellite e cultura mioblasti
Nota: Le biopsie muscolari sono stati ottenuti dal gruppo di Etienne Lefai (INSERM, Lione, Francia) 19.- Purificare mioblasti scheletrici primarie secondo la procedura descritta in precedenza 30.
- differenziando pmioblasti umani rimary in miotubi
- Prendere una fiala (1 x 10 6 cellule) di mioblasti umani conservati in azoto liquido e scongelamento cellule rapidamente ponendo la fiala per 30 sec per 1 min in un bagno d'acqua a 37 ° C con agitazione.
- cellule Pipettare (1 ml) in 24 ml di mezzo di crescita composti HAM F-10 supplementato con 20% FBS, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B.
- Centrifugare 5 min a 150 x g.
- Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 15 ml di terreno di coltura fresco per 2,5 x 10 5 cellule.
- Piastra di almeno 2,5 x 10 5 cellule per F75 pallone aderente. Mantenere i mioblasti in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
- Una volta che le cellule raggiungono 60-80% di confluenza, dissociare cellule con tripsina-EDTA 0,05% per 1-2 min e piastra in 2 ml di mezzo di crescita su aderenti 3,5 cm piatti petri.
- Dopo aver raggiunto confluenza, rimuovere il mezzo di crescita.
- Avviare il proto differenziazionecolle di mioblasti umani in miotubi da loro coltura in 2 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 1 g / L di glucosio, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamicina e 0,2% amfotericina B (terreno di differenziamento) in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Cambiare la media ogni 2 o 3 giorni.
NOTA: miotubi sono di solito formate entro 7-10 giorni. - Controllare il differenziamento delle cellule muscolari al microscopio (Figura 2A) osservando la fusione dei mioblasti in miotubi polynucleated 19.
- Biopsia del tessuto, l'isolamento delle cellule satellite e cultura mioblasti
2. small interfering RNA (siRNA) Transfection
- siRNA Transfection di cellule insulari umana
NOTA: Il protocollo di trasfezione viene eseguito in gocce di 100 ml il giorno successivo dopo la dissociazione delle cellule (passi 1.1.1-1.1.10).- Aspirare 100 microlitri di terreno CMRL da ogni goccia e sostituirlo con lo stesso volume di privo di siero Minimal Essential Medium (MEM) 2 hrprima di trasfezione pipettando.
- Preparare un mix MEM a base di reagente di trasfezione e 50 Nm di destinazione siRNA (SICLOCK) o 50 nm di non-targeting siControl secondo le istruzioni del produttore.
- Per un piatto con 3 gocce preparare due provette da 1,5 ml con 200 ml di MEM ciascuno.
- Aggiungere a uno di questi tubi 4 microlitri di reagente di trasfezione.
- Aggiungere al secondo tubo 1 ml di soluzione di appropriata siRNA magazzino (20 micron).
- Agitare questi due tubi lentamente l'agitatore orbitale per 5 minuti e poi mescolare il contenuto dei tubi insieme e agitare per altri 20 min.
- Aspirare 100 ml di MEM da ogni goccia e sostituirlo con lo stesso volume di miscela di trasfezione ottenuto nel passaggio precedente pipettando.
- Sostituire la soluzione trasfezione con il mezzo CMRL dopo 4 ore di incubazione a 37 ° C. Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 il giorno seguente per cella ri-trasfezione.
- siRNA Transfection di miotubi umani
- Prima di trasfezione, sostituire il supporto (vedi punto 1.2.2.8), con 2 ml di terreno differenziazione fresca per 3,5 cm piatto di Petri.
- In una provetta sterile da 1,5 ml, preparare una miscela di 20 nM siRNA (siControl o SICLOCK), che corrisponde a 2,4 ml di una soluzione 20 mM siRNA, e 12 ml di reagente di trasfezione diluiti in 100 ml di terreno di differenziamento. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti con agitazione.
- Cellule trasfezione con 114,4 ml di miscela siRNA per 3,5 cm di Petri cellule piatto e posto in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
3. continua a lungo termine circadiano bioluminescenza registrazione Eseguita in parallelo con la valutazione della secrezione dell'ormone nelle cellule viventi umane primarie
- L'introduzione di circadiani Bioluminescenza Reporter in cellule primarie umane dilentivirali trasduzione
NOTA: Tutte le procedure con le particelle lentivirali devono essere eseguite in un impianto di biosicurezza di livello 2 di prendere ulteriori precauzioni per il lavoro con gli agenti che rappresentano un potenziale pericolo moderata per il personale e per l'ambiente.- Preparare particelle lentivirali giornalista dal co-trasfezione del vettore di interessi pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc o pLV156-Per2-dLuc (chiamato Bmal1-Luc e Per2-Luc, rispettivamente) plasmide 31 con vettori lentivirali pMD2G e psPAX in cellule 293T con il metodo polietilenimmina (per la procedura dettagliata vedi riferimento 16).
- Titolare le particelle lentivirali ottenuti (i dettagli sulla titolazione sono disponibili presso http://lentilab.unige.ch/). Per ulteriori esperimenti, utilizzare lentivirus con titoli che vanno 10 4 10 5 unità di trasduzione [TU / ml].
- Luogo piatti con cellule delle isole umane o mioblasti umani (al 30-50% di confluenza) all'interno della cabina a flusso laminareet e sostituire il supporto con 2 ml di mezzo fresco INTEGRAZIONI CMRL (vedi punto 1.1.7) o mezzo di crescita (vedi punto 1.2.2.2), rispettivamente.
- Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) (cioè particelle infettive (unità di trasduzione) / numero di cellule).
- Trasdurre la coltura cellulare primaria pipettando soluzione lentivirus al piatto in modo da ottenere un MOI = 3 (ad esempio, per 65.000 cellule attaccate aggiungono 3 ml di soluzione di virus con il titolo di 6,5 x 10 4 a 100 l medie goccia).
- Incubare per una notte in un incubatore di coltura tissutale. Cambiare media il giorno successivo.
NOTA: trasdurre cellule insulari umane almeno 4 giorni prima della registrazione bioluminescenza per conseguire sufficiente espressione del costrutto giornalista. Mioblasti sono trasdotti durante la fase di espansione, quindi cresciuto a confluenza, e successivamente differenziate in miotubi.
- In Vitro sincronizzazione delle cellule primarie umane
- <li> Aggiungi 10 micron di ciclasi attivatore in 2 ml di terreno per 3,5 cm piatto di Petri contenente le cellule primarie precedentemente trasdotte nella fase 3.1.5.
- Incubare per 60 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
- Modificare il mezzo contenente la ciclasi attivatore ciclasi con 2,5 ml del supporto di registrazione contenente 100 micron luciferina.
NOTA: per cellule insulari umani usano CMRL supplementato con 10% FBS, 1% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 1% di gentamicina; per miotubi umani usano rosso fenolo - DMEM senza con 1 g / L di glucosio integrato con il 2% FBS, 2% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B.
4. Valutazione parallela di circadiano bioluminescenza Registrazione e secrezione dell'ormone profili in cellule sincronizzate umana secretoria primarie
- Impostazione a lungo termine La perfusione costante e registrazione bioluminescenza per le cellule primarie umane.
NOTA: Quando si lavora outide la cappa a flusso laminare, pulire tutte le superfici di contatto e limitare l'esposizione delle culture o mezzo per l'aria per evitare la contaminazione.- Per preparare il mezzo perifusione, aggiungere 100 mM di luciferina al mezzo.
NOTA: per cellule insulari umani usano CMRL supplementato con 10% FBS, 1% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 1% di gentamicina; per miotubi umani usano rosso fenolo - DMEM senza con 1 g / L di glucosio integrato con il 2% FBS, 2% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B. - All'interno della cappa a flusso laminare, aprire i 3,5 cm piatti contenenti le trasdotte, trasfettate e sincronizzati colture cellulari primarie (cellule delle isole o miotubi) come descritto sopra. Inserire tappi metallici sterili (sviluppati in casa) (Figura 1B2) nei piatti da 3,5 cm che sono dotate di afflusso silicone / tubi di efflusso di collegamento (Figura 1B1 / B5).
- Porre le capsule sulla piattaforma di misurazione nel 37 ° C light a tenuta incubatore. Fissare i piatti alla piattaforma utilizzando un adattatore a vite (Figura 1B3). Inserire i tubi afflusso / efflusso del sistema perifusione nei tubi silicone appropriate del tappo (Figura 1B1 / B5) e impostare la velocità della pompa ad una portata di ~ 0,5 ml di terreno per 1 ora.
- Aprire il software Drip-biolumicorder sviluppato in casa che registra i segnali dal rivelatore tubo fotomoltiplicatore (PMT). Ha scelto la directory in cui verranno memorizzati e iniziare a bioluminescenza continua la registrazione da ogni piatto facendo clic sull'icona "start" i dati.
NOTA: in alternativa al software Drip-biolumicorder, altri programmi (ad esempio LumiCycle), può essere utilizzato per registrare i segnali di rivelatore PMT. - Posizionare sterile 6 pozzetti piastre di coltura tissutale nella scatola di raccolta sul ghiaccio.
- Aprire il software di controllo che controlla la temporizzazione dell'interruttore automatico tra i pozzetti di raccolta. Impostare il tempo window di raccolta media (sec). Inizia la raccolta del mezzo deflusso ogni 4 ore (14.400 secondi; ~ 2 ml per time-point) facendo clic sull'icona "run".
- Trasferire e misurare la media deflusso per ogni collezione e in sterili 2 ml tubi pipettando. Mantenere provette in un -20 ° C freezer prima di iniziare la fase successiva. Ripetere i passaggi 4.1.5-4.1.6 ogni 24 ore.
- Interrompere la registrazione bioluminescenza e il flusso medio facendo clic sull'icona "stop" sul software corrispondente. Rimuovere i tappi metallici e aspirare il terreno residui dai piatti.
- Al fine di normalizzare i valori di proteina secreta ottenuti in esperimenti diversi, o estrarre il DNA (normalizzazione dal contenuto di DNA genomico per miotubi 19), o aggiungere 1 ml di tampone di lisi acido-etanolo (normalizzazione dal contenuto totale ormonale per le cellule delle isole 18) al piatti.
- Per preparare il mezzo perifusione, aggiungere 100 mM di luciferina al mezzo.
5. misurazione dei livelli ormonali e Islet Myokine nel deflussoMedia Ottenuto da La perfusione continua di cellule umane endocrini primaria
- Insulina
- Quantificare i livelli di insulina basale nel medio deflusso di volta in punti raccolti utilizzando un kit umano insulino enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) seguendo le istruzioni del produttore.
- Normalizzare i dati per il volume assoluto del mezzo raccolte in ciascun pozzetto e al contenuto totale di insulina, estratto da cellule trattate con acido etanolo al termine dell'esperimento (fase 4.1.9) 18.
- L'interleuchina-6 (IL-6)
- Quantificare basale di IL-6 livelli nel medio deflusso di volta in punti raccolti utilizzando un IL-6 kit ELISA umano seguendo le istruzioni del produttore.
- Normalizzare i dati per il volume assoluto del mezzo raccolte in ciascun pozzetto e contenuto di DNA genomico alla fine dell'esperimento (fase 4.1.9).
6. Le analisi dataset circadiani per Bioluminesscenza e secrezione dell'ormone profili
- Analisi bioluminescenza
- Analizzare profilo bioluminescenza utilizzando il software in dotazione 19.
- Analisi JTK-ciclo
- Analizzare i profili secrezione dell'ormone e risultati di registrazione bioluminescenza utilizzando l'algoritmo JTK_CYCLE 32.
- Impostare la larghezza periodo circadiano in 20-24 ore.
NOTA: Nel caso in cui sono state registrate le condizioni sperimentali in parallelo, l'analisi statistica accoppiato può essere eseguita per confrontare gli esperimenti.
- Analisi CosinorJ
- In alternativa, analizzare la secrezione ormonale e profili di bioluminescenza circadiani utilizzando il software CosinorJ 28.
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Representative Results
La valutazione della secrezione dell'ormone Isolotto con Parallel circadiano bioluminescenza Registrazione da cellule Perifused Islet umana
Dopo aver fornito una prima caratterizzazione molecolare dell'orologio circadiano, operativa in cellule delle isole umane 16, si propone di studiare l'impatto di orologio interruzione sulla funzione isolotto e la trascrizione 18. Abbiamo istituito un efficiente protocollo di SICLOCK trasfezione in cellule delle isole umane dispersi (vedi protocollo per i dettagli), che ha portato in oltre l'80% atterramento di CLOCK mRNA, e in efficienza l'ablazione orologio circadiano come misurato da bioluminescenza profilatura 18. Il glucosio indotta secrezione di insulina (GSIS) analisi ha rivelato significativamente ridotto basale e stimolata la secrezione di insulina in virtù di tale interruzione orologio (non mostrato). Per valutare la secrezione ormonale da parte delle cellule pancreatiche umane around-the-clock, un ContinSistema perifusione uo stato collegato ad un luminometro (illustrato nella Figura 1B). Cellule insulari umane, recanti un funzionale (siControl) o disfunzionale oscillatore (SICLOCK) sono state trasdotte con particelle lentivirali Bmal1-luc. Le cellule sono state successivamente sincronizzati con un impulso di ciclasi attivatore seguita da analisi parallela di bioluminescenza circadiano e la secrezione di insulina nel mezzo deflusso durante 48 ore (Figura 1C, D 18). Questi esperimenti suggeriscono che sotto concentrazione costante fisiologica di glucosio (5,6 mm glucosio), la secrezione di insulina da in vitro cellule delle isole umane sincronizzate presenta un profilo circadiano, che viene interrotto nei campioni recanti SICLOCK (Figura 1D).
Studiando Myokine secrezione da scheletrico umano miotubi sincronizzato in vitro in presenza o assenza di Clock funzionale
33, si rivolge a caratterizzare i ritmi circadiani in scheletrico umano primario miotubi e ad indagare il loro ruolo nella funzione myotube 19. A tal fine, l'interruzione dell'orologio circadiano in miotubi scheletrici è stato ottenuto transfezione siRNA CLOCK targeting. Saggi di bioluminescenza giornalista circadiani con Bmal1-Luc e giornalisti Per2-Luc rivelato che miotubi scheletrici umani, sincronizzati in vitro, mostrano un ritmo circadiano di auto-sostenuta, che è stata ulteriormente confermata da espressione nucleo orologio trascrizione endogena (Figura 2B; 19). Questo orologio endogena è stata efficiente interrotto in presenza di siRNA targeting per CLOCK (Figura 2B). Inoltre, la secrezione basale di IL-6 (Figura 2C), interleuchina-8 (IL-8)e Monocyte Chemotactic Protein 1 (MCP-1) (non mostrata) da miotubi scheletrici sincronizzati, valutati dal sistema perifusione qui descritto (Figura 1B) e successiva Myokine larga scala analisi multiplex (non illustrato), presenta un profilo circadiano, che è fortemente disregolazione su rottura dell'orologio (Figura 2C 19).
Figura 1: Valutazione della secrezione dell'ormone con Parallel circadiano bioluminescenza Registrazione da cellule Perifused Islet umano (A) quadro rappresentativo delle cellule delle isole umane attaccate un giorno dopo isolotto dissociazione.. (B) Rappresentazione schematica del sistema perifusione fatta in casa che comprende una bottiglia con il mezzo perifusione, una pompa, una piattaforma di misura dotato di un tubo fotomoltiplicatore (PMT) entro l'incubatore a tenuta di luce, Un dispositivo luminometro, controllato dal software di registrazione, ed un collettore di esempio semiautomatica. Inserire: tubo (B1) Afflusso di collegamento; (B2) tappo metallico per il 3,5 centimetri piastra di Petri; (B3) Adattatore avvitabile che fissa il tappo alla piattaforma di misurazione (B4); tubo (B5) efflusso di collegamento; (B6) controllata automaticamente mezzo distributore. (C), le cellule pancreatiche umane sono state trasfettate sia con scrambled siRNA (siControl) o siRNA CLOCK targeting (SICLOCK) e trasdotte con il reporter Bmal1-Luc. Le cellule sono state costantemente perifused con terreno di coltura contenente 5.6 mM glucosio. bioluminescenza circadiano è stato registrato dopo la sincronizzazione da un impulso attivatore ciclasi. (D) I livelli di insulina sono stati valutati mediante ELISA nei campioni di deflusso raccolti ogni 4 ore durante 48 ore. Applicazione di algoritmo JTK_CYCLE 32 confermato che, in pRESENZA di un orologio funzionale (siControl), il profilo medio di insulina secreta era circadiano entro 48 ore, con una lunghezza periodo di 24,19 ± 0,89 hr (** p = 0,009; n = 7 donatori). Questo profilo circadiano è stato perso su di interruzione di clock (SICLOCK). I dati sono presentati come% di ormone secreto dal contenuto totale di ormone (media ± SEM) per n = 7 donatori (uno repliche per ciascun donatore) .Questo dato è stato modificato dal riferimento 18. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Basale di IL-6 secrezione da umani scheletrici miotubi è fortemente inibita in assenza di un orologio circadiano funzionale mioblasti sono stati trasdotte con particelle lentiviralicontenente il transgene Bmal1-Luc, differenziate in miotubi, e trasfettate sia con siControl o SICLOCK siRNA. 24 ore dopo la trasfezione, miotubi sono stati sincronizzati con un impulso di attivatore ciclasi e sottoposto a perifusione continuo con la registrazione bioluminescenza parallelo. (A) immagini rappresentative sono state scattate al giorno 0 (D0) e D7 dopo il passaggio dal 20% al 2% FBS contenenti terreno di indurre il differenziamento miotubi. Durante il processo di differenziazione, mioblasti umani sono riorientati, diventano allungata e si fondono insieme per formare un sincizio plurinuclated. (B) i profili bioluminescenza Bmal1-luc di siControl transfettate miotubi (linea nera) e SICLOCK transfettate miotubi (linea grigia). Profili di oscillazione Bmal1-luc sono stati registrati in tre esperimenti indipendenti (un donatore per ogni esperimento). (C) basale Rappresentante IL-6 secrezioneprofilo in presenza o assenza di un orologio funzionale. Il mezzo perifusione deflusso è stato raccolto a intervalli di 4 hr durante 48 ore (0-4 corrisponde all'accumulo di IL-6 tra 0 ore e 4 ore). IL-6 nel mezzo sono stati valutati mediante ELISA in due duplicati tecnici provenienti da tre esperimenti indipendenti. I risultati rappresentano basali di IL-6 livelli normalizzati al contenuto totale di DNA. IL-6 è stata ridotta secrezione in media di 69,30 ± 10,61% alla circadiano interruzione di clock (media ± SEM, n = 3; * P <0,05, paired t test). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 19. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le impostazioni sperimentali qui descritte sono composti di consegna lentivirale di reporter bioluminescenza circadiani in cellule primarie umane coltivate, seguita da successiva sincronizzazione in vitro e registrazione continua della bioluminescenza per diversi giorni, e analisi parallela della secrezione dell'ormone dalle stesse cellule. Essi rappresentano un approccio efficace per esplorare i meccanismi molecolari e gli aspetti funzionali di orologi circadiani nelle cellule primarie umane.
La qualità del materiale donatore è una questione importante per la preparazione di colture di tessuti primaria vitali. La qualità delle isole umane dovrebbe essere valutata ogni volta prima di iniziare l'esperimento. Isolotti con purezza stimato e / o la vitalità inferiore al 70% non sono raccomandati per questi esperimenti. cellule insulari tendono a ristabilire contatti in colture dissociate, che svolge un ruolo importante nella loro sopravvivenza e la funzionalità. Dal momento che le cellule delle isole non proliferano in culture, devono essere placcato ad alta densità, che permette alle cellule di stabilire contatti con cellule vicine. Ciò si ottiene placcatura cellule in gocce di piccolo volume. È importante sottolineare che la morte delle cellule è più elevato nelle colture di cellule isolotto a bassa densità. Si noti che media la sostituzione deve essere eseguita immediatamente per evitare l'essiccazione delle cellule.
Mioblasti devono essere diversi passaggi preferibilmente al 60% di confluenza, poiché una maggiore densità può indurre la differenziazione dei mioblasti. Dopo tripsinizzazione, mioblasti devono essere accuratamente risospesi e dispersi per evitare gruppi di cellule.
La contaminazione batterica o fungina di pile dovrebbe essere escluso al microscopio prima di iniziare il test perifusione. Terreno di coltura può essere completata con sostanze antimicotiche. Inoltre, il tubo perifusione devono essere risciacquati dall'alcol iodio disinfezione / acqua sterile e tappi metallici devono essere sterilizzati in autoclave. sono consigliate Questi passaggi fra ogni eXperiment.
Per la registrazione bioluminescenza efficiente, la qualità della preparazione lentivirus giornalista dovrebbe essere determinata dall'intensità del segnale bioluminescente. I dettagli della produzione di lentivirus tra cui la risoluzione dei problemi possono essere trovati a http://lentilab.unige.ch/. Prima di plasmide trasfezione per la produzione di lentivirus, le cellule 293T dovrebbero essere placcato a 30-50% di confluenza. Si raccomanda di effettuare un controllo della efficienza di trasfezione in un piatto parallelo, ad esempio utilizzando CMV-GFP o un lentivector fluorescente alternativa. Per ogni preparazione virus deve essere stabilito il titolo del virus.
Come gli esperimenti descritti sono in genere di lunga durata (48 ore o più), è fondamentale avere silenziamento stabile durante questo intervallo di tempo. La concentrazione di siRNA dovrebbe essere ottimizzata, nonche la confluenza cella secondo il protocollo siRNA reagente. Efficienza di silenziamento genico deve essere testato alla fine del experiment mediante RT-qPCR o mediante Western blotting.
Durante perifusione, la portata determina il tempo necessario sostituire completamente i media nel piatto ma ha anche un impatto meccanico sul colture primarie. Infatti, impostare il flusso a una velocità che è troppo basso, non consentire un ricambio completo media nel piatto, e si riduce la sensibilità del metodo. Al contrario, una portata ad alta velocità può danneggiare le cellule. Nelle nostre mani, la velocità ottimale per entrambi i tipi cellulari ha permesso di raccogliere 0,5 ml del mezzo deflusso per 1 ora.
È importante sottolineare che, per ottenere una concentrazione misurabile di sostanze nel mezzo deflusso, un numero sufficiente di cellule secernenti dovrebbe essere presente nel piatto perifused. Il metodo seguito per la rivelazione della sostanza secreta (ELISA o altro) dovrebbe essere abbastanza sensibile, specialmente per le sostanze secrete in concentrazioni molto basse. Maggiore densità delle cellule potrebbe essere raccomandato per superarequesto problema quando possibile. In alternativa, il mezzo di efflusso può essere concentrato mediante dialisi o con filtri centrifughi, come descritto da noi in dettaglio in riferimento 19.
Nel loro insieme i nostri esperimenti in cellule delle isole pancreatiche umane e in miotubi primari forniscono per la prima volta una prova convincente che queste cellule umani possiedono orologi circadiani ad alta ampiezza di cellule autonome 18-19. Impiegando il sistema perifusione qui descritto in combinazione con un dispositivo luminometro (Figura 1B) abbiamo dimostrato che questi orologi svolgono un ruolo importante nella regolazione circadiano della secrezione basale di insulina da cellule delle isole pancreatiche (Figura 1D), e basale IL6 secrezione miotubi scheletrici (Figura 2C). Inoltre, abbattendo il gene orologio di base in entrambi i sistemi sperimentali, si dimostra che un oscillatore circadiano funzionale è necessario per il corretto dell'insulina ritmica e la secrezione di IL-6da isolotto umano e cellule del muscolo scheletrico, rispettivamente (Figure 1C, D e 2B, C). I nostri risultati indicano un ruolo critico del clock isolotto umano per una corretta secrezione di insulina, e sono in buon accordo con opere eseguite in modelli genetici di roditori 15,17. Dato il ruolo di primo piano dell'orologio circadiano nel permettere organismi di anticipare i cambiamenti ambientali quotidiane piuttosto che di reagire ad essi, regolamentazione circadiano della secrezione di insulina basale e Myokine potrebbe rappresentare un meccanismo tale anticipazione che coordina isole pancreatiche e nel muscolo scheletrico attività secretoria al resto- ciclo di attività di tutto il corpo.
La metodologia qui proposto può essere facilmente modificato per studiare ulteriori secrezione ormonale dagli stessi tessuti. Abbiamo già analizzato un grande pannello aggiuntivo di myokines secrete dalle cellule muscolari scheletriche, utilizzando gli array multiplex Myokine umani 19, e siamo in procinto di valutareing secrezione di glucagone dalle cellule delle isole umane utilizzando il kit di glucagone ELISA (dati non riportati). Inoltre, queste condizioni sperimentali possono essere ottimizzati per altri tipi di cellule, per esempio adipociti primari, per studiare la secrezione di adipochine, tireociti primarie per studiare la secrezione di ormone tiroideo, enterociti primarie per lo studio incretine secrezione, ecc Un ulteriore importante applicazione di questo sistema potrebbe essere quello di esplorare l'impatto dei composti fisiologici e / o farmacologici sul cellulare funzione orologio circadiano e la secrezione. Il composto di interesse può essere applicata continuamente durante l'intero esperimento (per esempio studiare la secrezione di insulina dalle cellule insulari umane in presenza di alte concentrazioni di glucosio o di diversi livelli di acidi grassi liberi), oppure il composto potrebbe essere aggiunto in una fase scelta del circadiano ciclo.
Questa tecnica ha le limitazioni di uno studio in vitro e non rappresenta la complessità circadiano rego ritmomento a livello del corpo intero. Allo stesso tempo, aiuta a distinguere il ruolo di un orologio autonoma sul metabolismo cellulare in condizioni controllate. Attualmente i metodi disponibili si basano su misurazioni istantanee di attività di secrezione nelle cellule o espianti di seguito nella sincronizzazione vitro 17. Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo unico che consente un'analisi concordante e continuo del ritmo circadiano e dell'attività secretoria all'interno della stessa coltura cellulare. In alternativa, questa metodologia potrebbe essere applicata per studiare la cinetica di reporter bioluminescenti non circadiani, in combinazione con la secrezione cellulare, nonché per rilevare gli effetti delle diverse sostanze aggiunte al mezzo perifusione sulla funzione cellulare. I passaggi critici nel protocollo sono: 1) la preparazione lentivirus efficiente, 2) trasfezione delle cellule efficiente con siRNA e giornalista vettori trasduzione; 3) raccolta costante media di deflusso e 4) fare in modo che un numero sufficiente di ceLLS è utilizzato al fine di ottenere livelli misurabili di ormoni o citochine nel medio deflusso raccolti (vedi la risoluzione dei problemi di cui sopra).
In considerazione dei recenti evidenze sul legame tra perturbazioni orologio circadiano e malattie metaboliche e il cancro negli esseri umani 3-4,28,34-35, studiando umani proprietà di clock periferici in colture primarie può rappresentare un approccio importante e unica per comprendere le potenzialità di connessione di clock a queste malattie. Quindi, la nostra scoperta dell'esistenza di legami tra funzionale isole pancreatiche umane e orologio muscolo scheletrico e la secrezione di insulina basale e myokines, potrebbe portare potenziali conseguenze per la comprensione dello sviluppo di malattie croniche, come l'obesità e il diabete di tipo 2 18-19 e porterà nuove strade nel trattamento di queste malattie. È importante sottolineare che, grazie alla correlazione stabilita tra le caratteristiche dell'oscillatore valutato in vitro ed in vivo 36, implicazione della umana proprietà dell'orologio circadiano come un segno distintivo di malattie, è di più alta e immediata rilevanza clinica 20.
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Acknowledgments
Siamo grati ai nostri colleghi presso l'Università di Ginevra: Jacques Philippe per i commenti costruttivi su questo lavoro, Ueli Schibler aiuto prezioso con lo sviluppo del sistema perifusione e di ispirazione scientifica, André Liani per aver ideato il design, la produzione e la messa in funzione di il sistema di perfusione, società Lesa-TECHNOLOGY LTD per l'assistenza nel sistema perifusione e Drip-biolumicorder lo sviluppo del software, George Severi per l'assistenza con gli esperimenti perifusione, Ursula Loizides-Mangold per la lettura critica del manoscritto, e Anne-Marie Makhlouf per i preparati lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vidal (INSERM, Lione) per la preparazione di mioblasti primari umani; e di Domenico Bosco e Thierry Berney (Essere umano Islet Transplantation Center, Ginevra Ospedale universitario) per la fornitura di isole umane. Questo lavoro è stato finanziato dal n Science Foundation nazionale svizzero di Grant 31003A_146475 / 1, il Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo HJELT Foundation, Fondazione Ernst et Lucie Schmidheiny, e Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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