Abstract
일 주기성 시계는 일일 환경 변화를 예측하여 외부 세계에 적응을 허용, 모든 빛에 민감한 생물에서 기능입니다. 주기성 시계와 생리학의 대부분의 측면 사이의 긴밀한 연결에 대한 우리의 이해에 상당한 진전이 지난 10 년 동안 현장에서했다. 그러나, 인간의 주기성 발진기의 기능의 기초가되는 분자 기초를 푸는 것은 가장 높은 기술적 인 문제로 남아 있습니다. 여기서는 차 배양 된 세포에서 장기간 (2-5일) 생물 발광 기록 유출 매체 수집 실험 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이를 위해, 우리는 호르몬 분비 주기성 생물 발광들의 병렬 평가를 허용하는 코어 클록 유전자 프로모터의 제어하에있는 루시페라아제 리포터 렌티 일차 세포를 형질 도입 하였다. 더욱이, 우리는 홍보 주기성 시계를 방해하는 조건을 기술siRNA를 대상으로 시계를 형질 감염에 의해 imary 인간 세포. 인간의 췌장에 의한 인슐린 분비의 일주기 조절에 대한 연구 결과, 인간의 골격 근육 세포에 의해 myokine 분비,이 방법론의 응용 프로그램을 설명하기 위해 여기에 제시되어있다. 이러한 설정은 인간 말초 시계 분자 메이크업 공부 또는 병태 생리 학적 조건 하에서 일차 세포에 미치는 기능적 영향을 분석하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
(라틴어 "년경 디엠"에서) 주기성 타이밍 시스템은 지구의 회전에 적응 메커니즘으로, 모든 빛에 민감한 생물에 등장했다. 포유 동물에서, 복부 시상 하부의 시교 차 상핵에 위치해 중앙 시계를 포괄, 계층 적 방식으로 조직하고, 주변 (또는 슬레이브) 다른 기관에서 동작한다 발진기. 또한, 이러한 세포 자율적 인 자기 유지 발진기는 본체 (1)의 거의 모든 세포의 기능입니다. SCN에서 나오는 신경과 체액 신호가 주변 시계를 재설정 반면 빛의 신호는 SCN 신경 세포에 대한 지배적 인 동기 큐 (Zeitgeber)를 나타냅니다. 차례 먹이-금식 사이클에서 운전 외에 나머지 활동 리듬에서, 주변 시계 2에 대한 더 싱크로 나이저입니다. 현재의 이해에 따르면, 코어 클록의 분자량 화장 전사 및 transla에 기초생물 사이에 보존된다적인 피드백 루프. 이 함께 음의 코어 클럭 PER과 CRY 유전자의 전사를 활성화 전사 활성화 BMAL1 및 CLOCK을 포함한다. PER 및 CRY 단백질의 높은 수준은 BMAL1 / CLOCK 복합체의 억제를 통해 자신의 전사를 억제한다. 보조 루프는 또한 BMAL1 및 CLOCK의 전사를 조절하는 핵 수용체 REV-ERBS 및 RORS로 구성되어 있습니다. 또한, 인산화 sumoylation, 아세틸, O-GlcNAcylation 분해 및 코어 클록 입력 단백질 핵 포함 번역 후 이벤트는 24 시간 진동주기 3 확립 추가적인 중요한 조절 층을 나타낸다.
축적 증거는 설치류 모델 연구에서 줄기와 신진 대사 및 내분비 기능 4-5의 조정의 일 주기성 시스템의 중요한 역할을 강조한다. larg의 다수의금식 사이클 주변 발진기 6-8의 동기화에 중심적인 역할을 - 전자 규모의 사체 분석 수유하는 것이 좋습니다. 이러한 연구와의 계약에서, 설치류와 인간의 대사 체 및 lipidomic 분석은 대사의 많은 수는 주기성 방식 9-11에서 조직, 혈장, 타액으로 진동 것으로 밝혀졌다. 중요한 것은, 대부분의 호르몬은 혈액 5,12-13에서 활동 일주기를 나타낸다. 또한, 말초 조직의 제조 대응 호르몬 주기성 시계 로컬 호르몬 분비를 조절할 수있다. 셀 자치 일중 발진기는 설치류와 인간의 췌장 섬 세포를 14 ~ 16에 기재되어있다. 이 발진기는 췌장 섬의 사체를 조절하는 중요한 역할을 담당하고 15,17-18를 작동합니다. 또한, 인간의 골격 myotubes에 의해 myokine 분비는 최근 세포 자치 oscillato에 의해 조절되는 주기성 패턴을 나타내는 것으로 입증되었다이러한 셀 (19)의 동작 RS.
생체 내에서 인간 활동 일주기를 연구하기위한 여러 접근 방식이 널리 사용되어왔다. 예를 들어, (참조 3,20 검토) 플라즈마 멜라토닌 코티솔 수치뿐만 아니라 흉부 피부 표면 온도는 내인성 일 주기성 시계를 평가하기 위해 연구되어왔다. 이 방법은 생체 내에서 전신 주기성 진동을 연구 할 수 있지만, 그들은 지금까지 다른 장기와 조직에없는 실행 자율적 인 활동 일주기의 신뢰성있는 평가를 제공부터입니다. 그럼에도 불구하고, 전신 규제에서 이러한 박리는 이들 세포의 기능을 세포 내 분자 시계의 구체적인 효과를 이해하기위한 필수 도구가 될 것이다. 따라서, 상당한 노력이 시험 관내에서 동기화 불멸화 또는 일차 배양 된 세포에서 인간의 시계를 연구하기위한 신뢰할 수있는 방법을 개발하기 위해 수행되었다. 중요한 것은, 그 입증되었다일차 배양 된 피부 섬유 아세포에서 측정 클럭 특성에 밀접 전체 유기체 (21)의 각각의 클럭 특성을 반영한다. 형광 및 발광 생물의 circadian 기자의 개발은 크게이 방법 22-27 고급있다. 또한, 다른 말초 기관에서 파생 된 공부 일차 전지 시계는 인체 조직 별 시계 3,5,16,19-20,28의 분자 특성의 조사를 할 수 있습니다. 따라서, 체외 동기화 기본 외식 또는 셀의 일 주기성 시계의 평가는 생물 발광 기자를 사용하여, 분자 인간 말초 시계의 메이크업과 장기의 기능에 미치는 영향을 연구 할 수있는 매우 유용한 방법을 나타냅니다.
이 글에서, 우리는 자율적 인 휴대 시계의 영향뿐만 아니라 체외에서 동기화 인간의 주요 섬과 골격 근육 세포에서 일 주기성 유전자 발현을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다이러한 세포의 분비 기능에 장애가 발생했습니다.
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Protocol
윤리 문 :이 프로토콜에 포함 노는 제네바 대학 병원의 윤리위원회와 윤리위원회 SUD EST IV (계약 1백11분의 12) (19)에 의해 승인되었다. 상용 소스에서 참조 (16, 18) 우리 설명, 또는 얻어진 인간의 섬은 제네바 대학 병원 (스위스)의 작은 섬 이식 센터에서 뇌사 멀티 장기 기증자의 췌장에서 분리 하였다.
차 세포 배양 1. 준비
- 인간의 췌장 아일릿 격리, 해리와 문화
주 : 코트 코 노트 의학 연구소 (CMRL) 셀 재료의 상당한 손실을 초래할 수있는 플라스틱 표면에 부착되는 섬 또는 섬 세포를 방지하기 위해 매체마다 튜브 플라스틱 피펫 팁 또는.- 세포 분리가 라미닌 -5 풍부한 세포 외 기질 1 ㎖를 추가 섬에 어느 날 이전에 (descri으로 804G 세포에서 파생 된3.5 cm 접시 당 기준 29)에 침대. 세포를 도금하기 전에 매트릭스를 대기음 및 살균 이중 증류수와 함께 접시에 3 번 씻는다. 접시가 5 분 동안 층류 캐비닛에서 건조하도록 허용합니다.
- 층류 캐비닛 내부, 15ml의 튜브 (들)에 CMRL 배지 얻어지는 아일렛 배포. 5 분 동안 272 XG에 원심 분리기.
- 칼슘과 마그네슘없이 37 ° C로 미리 예열 뜨는을 대기음, 다음 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖ (DPBS)에 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 272 XG에 원심 분리기.
- 뜨는을 기음과 DPBS의 1 ml의 세포 펠렛을 resuspend.
- 새로운 3.5 cm 접시에 섬, 피펫 1 ML의 섬 현탁액 10 μL의 총 수를 계산합니다. 현미경 10 μL 강하 랑게르한스 섬의 수를 계산하고이 용액에서 1 아일렛 현탁액 아일렛의 총 수를 계산한다. DPBS의 14 ML을 추가하고 세포 현탁액을 원심 분리 한 번 더5 분 272 XG에 시간.
- 섬 세포 분리의 경우, 뜨는을 대기음 1,000 섬 등가물 (IEQ)의 최대 세포 분리 용액 1 ㎖를 추가합니다. 37 ° C에서 물을 욕조에 튜브를 삽입하고 부드럽게 6-10 분 동안, 매 순간 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 섬을 섞는다.
참고 : 유리 슬라이드에 정지 2 μL 드롭을 피펫 모든 세포가 잘 분리 현미경 검사, 소화 품질을 확인하려면, 어떤 이중선 또는 세포 덩어리가 남아하지 않았는지. - 첨가제 (10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 %의 냉간 CMRL 14 ml에 첨가하여 반응을 정지 L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S), 1 % 겐타 마이신 1 % 피루브산 나트륨). 5 분 동안 425 XG에 원심 분리기. 뜨는을 기음과 세포 펠렛에 CMRL 매체의 15ml를 추가합니다.
- 보충제 CMRL 작은 부피로 펠렛을 재현 탁. hemocyto을 사용하여 현미경 하에서 세포의 개수를 세어m ~ 650, 000 세포 / ml의 세포 농도를 얻기 위해 CMRL 볼륨을 조절한다.
- 피펫 3은 3.5 cm 접시 라미닌로 사전 코팅 단계 1.1.8에서 얻어진 분산 된 세포 현탁액에서 100 ㎕를 각각의 방울을 분리.
참고 : 세포는 약 24 시간에 요리에 연결합니다. - 습한 챔버에서 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 세포 (도 1A)를 부화. 각 드롭 100 μl를 흡인하고, 신선한 배지를 동일한 부피로 교체하여 세포의 배지는 2-3 일마다 상품 변경한다.
- Myotubes에 인간의 기본 근원 세포 배양 및 분화
- 조직 생검, 위성 세포의 분리 및 근원 세포 배양
참고 : 근육 생검은 에티엔 느 Lefai (INSERM, 리옹, 프랑스) (19)의 그룹에서 얻어졌다.- 이전에 기술 된 절차 (30)에 따라 기본 골격 근육 아세포를 정화.
- 차별화 페이지myotubes에 rimary 인간의 근육 아세포
- 액체 질소에 저장 인간 근육 아세포의 한 바이알 (1 × 106 세포)를 가지고 교반하면서 37 ℃의 수조에서 30 초 내지 1 분 용 바이알 바꾸어 빠르게 세포를 해동.
- 이루어지는 성장 배지 24 ml를 피펫으로 셀 (1 mL) 중 HAM F-10 20 % FBS, 1 % P / S, 0.5 % 젠타 마이신 및 0.2 % 암포 테리 B. 보충
- 150 X g에서 원심 분리기 5 분.
- 2.5 × 10 5 세포 당 신선한 성장 배지 15 ml의 상층 액과에 resuspend 세포를 제거합니다.
- F75 부착 플라스크 당 플레이트는 최소 2.5 × 10 5 세포. CO 2를 37 ° C에서 세포 배양기에서 근육 아세포를 유지하고 5 %.
- 세포가 60-80%의 포화 상태에 도달하면, 1 ~ 2 분 동안 트립신 EDTA 0.05 %와 세포를 떼어 놓다 및 부착 3.5 cm 배양 접시에 성장 배지 2 ㎖에 그들을 판.
- 합류점에 도달 한 후, 성장 배지를 제거한다.
- 분화의 프로토 시작그들을 배양 myotubes으로 인간 근육 아세포의 COL이 1g / 글루코스 L, 2 % FBS, 1 % P / S, 0.5 % 젠타 마이신 및 0.2 %의 암포 테리 신 B (분화 배지)을 함유하는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) ml의 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포 배양기있다. 매 2 ~ 3 일 매체를 변경합니다.
참고 : Myotubes은 보통 7 ~ 10 일이 형성된다. - polynucleated myotubes (19) 근육 아세포의 융합을 관찰하여 현미경 (그림 2A)에서 근육 세포 분화를 확인합니다.
- 조직 생검, 위성 세포의 분리 및 근원 세포 배양
2. 작은 간섭 RNA (siRNA를) 형질
- 인간의 작은 섬 세포의 siRNA를 형질
참고 : 형질 전환 프로토콜 세포 분리 후 다음 날에 100 μL (1.1.1-1.1.10 단계) 방울에서 수행된다.- 각 드롭 CMRL 매체 대기음 100 μL 및 혈청이없는 최소 필수 매체 (MEM)이 시간의 동일한 부피로 대체피펫에 의해 형질 전환 전에.
- MEM 기반의 형질 전환 시약의 혼합 및 대상의 siRNA (siClock) 또는 50 nM의 50 nM의 준비는 제조업체의 지침에 따라 siControl 비를 타겟팅.
- 3 방울과 한 접시를 들어 MEM 각 200 μL 두 개의 1.5 ml의 튜브를 준비합니다.
- 이 튜브 형질 전환 시약의 4 μL 중 하나에 추가합니다.
- 적절한 siRNA의 원액 (20 μM)의의 제 2 튜브 1 μL에 추가합니다.
- 5 분 동안 진탕 천천히 두 튜브를 교반하고 함께 튜브의 함유량을 혼합하고 20 분 동안 더 교반한다.
- 대기음 100 각 드롭 MEM의 μL 및 피펫 팅에 의해 이전 단계에서 얻어진 형질 전환 믹스의 동일한 볼륨으로 교체.
- 37 ° C에서 배양 4 시간 후 CMRL 매체와 형질 전환 솔루션을 교체합니다. 단계를 반복 2.1.1-2.1.3 셀 재 형질 전환에 대해 다음 날.
- 인간 Myotubes의 siRNA를 형질
- 형질 전환하기 전에 3.5 cm 배양 접시 당 신선한 분화 배지 2 ㎖로 매체 (단계 1.2.2.8 참조)를 교체합니다.
- 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에서 20 μM siRNA를 용액 2.4 μL, 분화 배지 100 ㎕에 희석 형질 감염 시약 12 μL에 대응 20 ㎚의 siRNA (siControl 또는 siClock)을 혼합하여 준비한다. 교반과 함께 15 분 동안 실온에서 용액을 인큐베이션.
- 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 3.5 cm 페트리 접시와 장소 세포 당 siRNA를 믹스 114.4 ㎕의 5 % 24 시간 동안 CO 2와 형질 세포.
3. 연속 장기 일주기 생물 발광 녹화 거실 인간의 기본 세포의 호르몬 분비의 평가와 병렬로 수행
- 에 의해 인간의 기본 세포로 일주기 생물 발광 기자를 소개합니다렌티 바이러스 형질 도입
참고 : 렌티 바이러스 입자 모든 절차는 직원과 환경에 적당한 잠재적 인 위험이 에이전트와 작업에 대한 추가 예방 조치를 할 수있는 바이오 안전성 수준이 시설에서 수행해야합니다.- 에 의해 기자 렌티 바이러스 입자를 준비 공동 형질이자 pLenti6.4의 벡터 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1 뤽 또는 pLV156-Per2-dLuc (각각라는 Bmal1 뤽 및 Per2 - 루크,,) 렌티 바이러스 벡터 pMD2G와 플라스미드 (31) 및 폴리에틸렌 이민 방법을 사용하여 293T 세포에 psPAX (자세한 절차는 참조 16 참조).
- (적정에 세부 http://lentilab.unige.ch/ 얻을 수있다)를 수득 렌티 바이러스 입자의 적정. 추가 실험을 위해, 역가가 10 5 열 변환 장치 [TU / μL] 10 4에 이르기까지 함께 렌티 바이러스를 사용합니다.
- 층류 오두막 안에 인간의 섬 세포 또는 (30 % ~ 50 %의 포화 상태에서) 인간의 근육 아세포와 장소 요리등 신선한 보충 CMRL 배지 2 ㎖로 배지를 교체 각각 또는 성장 배지 (단계 1.2.2.2 참조) (단계 1.1.7 참조).
- 감염의 다양성 (MOI) (단위 열 변환 즉, 감염성 입자 () 셀 / 수)를 계산합니다.
- MOI = 3을 얻기 위해 접시 렌티 바이러스 용액을 피펫 팅하여 일차 세포 배양 물을 형질 도입 (예를 들어, 65,000 대한 부착 세포는 6.5 × 104 내지 100 μL 중간 방울의 역가 바이러스 용액 3 μl를 추가).
- 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션. 다음 날 매체 변경합니다.
주 : 리포터 구조체의 충분한 발현을 달성하기 위해 최소 4 일 전에 생물 발광 기록 인간 췌장 세포를 형질 도입. 아세포는 합류로 성장, 팽창 단계 동안 형질 도입하고,이어서 myotubes로 분화된다.
- 인간의 기본 세포의 체외 동기화에서
- <리> 이전 단계 3.1.5로 형질 일차 세포를 함유하는 3.5 cm 페트리 접시 당 배지 2 ㎖로 10 μM 아데 닐 레이트 시클 라제 활성화 제의 추가.
- 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션.
- 100 μM 루시페린을 포함하는 기록 매체의 2.5 mL로 아데 닐 레이트 시클 라제 활성화 제를 함유하는 배지를 변경한다.
주 : 인간 췌장 세포를 사용할 CMRL 10 % FBS로 보충 된, 1 % L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드, 1 % P / S, 1 % 겐타 마이신; 인간 myotubes은 페놀 레드 용도 - 1g과 무료 DMEM을 / L 글루코스는 2 % FBS로 보충 된 2 % L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드, 1 % P / S, 0.5 % 젠타 마이신 및 0.2 % 암포 테리 B.
동기화 된 인간의 분비 차 전지의 일주기 생물 발광 녹음 및 호르몬 분비 정보 4. 병렬 평가
- 인간의 기본 세포에 대한 장기 상수 Perifusion 및 생물 발광 녹화 설정.
참고 : 작업 아웃층류 캐비닛 깨끗한 모든 접촉면을 IDE 및 오염을 방지하기 위해 공기 또는 배양 배지의 노출을 제한한다.- 의 perifusion 매체를 준비 매체에 루시페린의 100 μM을 추가합니다.
주 : 인간 췌장 세포를 사용할 CMRL 10 % FBS로 보충 된, 1 % L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드, 1 % P / S, 1 % 겐타 마이신; 인간 myotubes은 페놀 레드 용도 - 1g과 무료 DMEM을 / L 글루코스는 2 % FBS로 보충 된 2 % L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드, 1 % P / S, 0.5 % 젠타 마이신 및 0.2 % 암포 테리 B. - 층류 캐비닛 내부, 전술 한 바와 같이, 형질 형질 동기화 일차 세포 배양 (췌장 세포 myotubes)를 함유하는 3.5 cm 접시를 연다. 실리콘 유입 / 유출 연결 튜브 (그림 1B1 / B5)가 장착 된 3.5 cm 요리로 (집에서 개발) 멸균 금속 캡 (그림 1B2)를 삽입합니다.
- 37 ° C 형 리터에서 측정 플랫폼에서 요리를 배치ight 꽉 인큐베이터. 나사 결합 식 어댑터 (그림 1B3)를 사용하여 플랫폼으로 요리를 수정합니다. 캡 (도 1B1 / B5)의 적절한 실리콘 튜브로 perifusion 시스템의 유입 / 유출 튜브를 넣고 ~의 유량으로 1 시간마다 배지 0.5 ml의 펌프 속도를 설정한다.
- 광전자 증 배관 (PMT) 검출기로부터의 신호를 기록하는 자체 개발 드립 - biolumicorder 소프트웨어를 엽니 다. 데이터를 저장하고 "시작"아이콘을 클릭하여 각 접시에서 촬영 연속 생물 발광을 시작 될 디렉토리를 선택했다.
주 : 대안 누수 biolumicorder 소프트웨어, 다른 프로그램 (예 LumiCycle), PMT 검출기로부터의 신호를 기록하기 위해 사용될 수있다. - 얼음에 수집 상자에 무균 6 잘 조직 배양 플레이트를 놓습니다.
- 수집 웰 간의 자동 전환의 타이밍을 제어하는 제어 소프트웨어를 연다. 시간 w를 설정매체 컬렉션 (초)의 indow. 유출 매체의 매 4 시간 (14,400 초, 시간 포인트 당 1 ~ 2 ㎖) 컬렉션을 시작합니다 "실행"아이콘을 클릭하여.
- 피펫으로 무균 2 ml의 튜브에 잘 각 컬렉션에서 유출 매체를 전송하고 측정한다. 다음 단계를 시작하기 전에 -20 ° C 냉장고에 튜브를 유지합니다. 단계를 반복 4.1.5-4.1.6 매 24 시간.
- 생물 발광 기록 및 해당 소프트웨어의 "중지"아이콘을 클릭하여 매체 흐름을 중지합니다. 금속 캡을 제거하고 요리에서 잔여 매체를 대기음.
- 다른 실험에서 얻은 분비 된 단백질의 값을 정규화 어느 추출 DNA (myotubes 19 게놈 DNA 함량 정규화) 또는 행 (췌도 세포 (18)의 총 호르몬 함량으로 정상화) 용해 산 에탄올 완충액 1 ㎖를 추가하기 위해서 그릇.
- 의 perifusion 매체를 준비 매체에 루시페린의 100 μM을 추가합니다.
유출 5. 측정 작은 섬 호르몬과 Myokine 레벨보통 인간의 기본 내분비 세포의 연속 Perifusion에 의해 획득
- 인슐린
- 제조자의 지시에 따라 인간 인슐린 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트를 사용하여 수집 된 시간 지점에서 유출 매체 기저 인슐린 수준을 정량화.
- 실험 (단계 4.1.9) (18)의 단부에 산 에탄올 처리 된 세포로부터 추출하고, 각 웰에 총 인슐린 함량을 수거 매체의 절대 볼륨 데이터를 정규화.
- 인터루킨 -6 (IL-6)
- 정량화 기저 IL-6은 제조업체의 지시에 따라 인간 IL-6 ELISA 키트를 사용하여 수집 시간 지점에서 유출 매체 수준.
- 각 웰과 실험군 (단계 4.1.9)의 끝에서 게놈 DNA 함량을 수거 매체의 절대 용적에 데이터를 정규화.
Biolumines 6. 일주기 데이터 집합 분석cence 및 호르몬 분비 프로필
- 생물 발광 분석
- 제공된 소프트웨어 (19)를 사용하여 생물 발광 프로파일을 분석합니다.
- JTK주기 분석
- JTK_CYCLE 알고리즘 (32)를 사용하여 호르몬 분비 프로필 및 생물 발광 기록 결과를 분석합니다.
- 20 ~ 24 시간의 일 주기성 기간의 폭을 설정합니다.
참고 실험 조건이 병행하여 기록 된 경우는 한 쌍의 통계적 분석은 실험과 비교하기 위해 수행 될 수있다.
- CosinorJ 분석
- 대안 적으로, 호르몬 분비 및 CosinorJ 소프트웨어 (28)를 이용하여 주기성 생물 발광 프로파일을 분석한다.
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Representative Results
Perifused 인간의 작은 섬 세포에서 병렬 일주기 생물 발광 녹화와 작은 섬 호르몬 분비의 평가
일 주기성 시계의 제 분자 특성화를 제공 한 후, 인간의 아일렛 셀 (16) 동작, 우리는 췌장 기능과 전사 18 클럭 방해의 영향을 연구 목적. 주기성 생물 발광 프로파일 링 (18)에 의해 측정 우리는 효율적인 siClock 형질 전환 CLOCK의 mRNA의 80 % 이상 최저의 결과 분산 된 인간의 섬 세포에서 프로토콜 (자세한 내용은 프로토콜 참조), 효율적인 클럭 제거에를 설정합니다. 포도당 유도 인슐린 분비 (GSIS) 분석은 상당히 감소 기저 및 클록 중단시 인슐린 분비를 자극 계시 (도시하지 않음). , 연중 무휴 인간의 섬 세포에 의해 CONTIN을 호르몬 분비를 평가하기uous perifusion 시스템 (도 1b에 도시) 루미에 접속 하였다. 기능 (siControl) 또는 기능 장애 (siClock) 발진기 베어링 인간의 섬 세포, Bmal1 - 뤽 렌티 바이러스 입자로 형질 도입 하였다. 세포를이어서 48 시간 (도 1C, D 18) 중에 유출 매체에 주기성 생물 발광과 인슐린 분비의 병렬 분석 하였다 아데 닐 레이트 사이 클라 제 활성화 펄스에 동기 하였다. 이 실험은 일정한 생리적 포도당 농도 (5.6 mM의 포도당), 체외 동기화 인간의 섬 세포에 의한 인슐린 분비에 따라 siClock 베어링 샘플 (그림 1D)에 방해되는 일 주기성 프로필을 전시하는 것이 좋습니다.
기능성 시계의 존재 또는 부재에 시험관에서 인간의 골격 Myotubes 동기화하여 Myokine 분비를 공부
(33)의 포도당 대사의 조절에 골격 근육 시계의 잠재적 인 역할의 관점에서 유지-together.within 페이지는 = "1"> 우리는 기본 인간의 골격에서 활동 일주기의 특성을 목표로 myotubes 및 myotube 기능 (19)에서 자신의 역할을 조사에. 이를 위해, 골격 myotubes의 일 주기성 시계의 중단은 siRNA를 대상으로 시계를 형질 감염에 의해 이루어졌다. Bmal1 뤽 및 Per2 뤽 기자들과 주기성 생물 발광 리포터 분석은 시험 관내에서 동기화 인간의 골격 myotubes가 더 (19도 2B) 내생 코어 클럭의 성적 표현에 의해 확인되었다 자체 지속적인 활동 일주기를 보이는 것으로 나타났습니다. 이것은 내인성 클록 siRNA를 효율적으로 타겟팅 CLOCK의 존재 (도 2B)에서 파괴시켰다. 또한, IL-6 (도 2c)의 기초 분비, 인터루킨 -8 (IL-8)및 단핵구 화학 주성 단백질 1 (MCP-1) (도시 생략) 여기에 설명 perifusion 시스템 (도 1b) 및 후속 대규모 myokine 다중 분석 (미도시)에 의해 평가 동기화 골격 myotubes 의해이 어떤하는 주기성 프로파일을 나타낸다 강하게 시계 중단 (그림 2C 19)에 조절 곤란.
그림 1 : Perifused 인간의 작은 섬 세포에서 병렬 일주기 생물 발광 녹화와 호르몬 분비의 평가 (A) 일일 섬 해리 후 부착 된 인간의 섬 세포의 대표적인 사진입니다.. (B)이 perifusion 배지 병, 펌프, 광 타이트 인큐베이터 내에서 광전자 증 배관 (PMT)를 구비 한 측정 플랫폼을 포함 수제 perifusion 시스템의 개략도 프레젠테이션기록 소프트웨어에 의해 제어 루미 장치 및 반자동 샘플 수집기. 삽입 : (B1)의 유입 연결 관; (B2) 3.5 cm 페트리 접시를위한 금속 캡; 측정 플랫폼 (B4)에 캡을 부착 (B3) 나사 결합 식 어댑터; (B5) 유출 연결 관; (B6)가 자동으로 중간 유통을 통제했다. (C) 인간의 섬 세포는 하나 스크램블 된 siRNA (siControl) 또는 siRNA를 대상으로 CLOCK (siClock)로 형질과 Bmal1 - 뤽 기자 형질 도입 하였다. 세포는 항상 5.6 mM의 포도당을 함유하는 배양 배지로 perifused 하였다. 주기성 생물 발광은 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화 펄스에 의해 다음 동기 기록 하였다. (D) 인슐린 수치는 48 시간 동안 4 시간마다 수집 유출 샘플 ELISA에 의해 평가 하였다. JTK_CYCLE 알고리즘 (32)의 응용 프로그램 페이지에 그 확인기능 시계 (siControl), 분비 된 인슐린의 평균 프로파일의 resence은 24.19 ± 0.89 시간의 기간 길이, 48 시간 내에 일중했다 (** P = 0.009; N = 7 기증자). 이 일주기의 프로필이 시계 중단 (siClock)에 분실되었다. 데이터는 전체 호르몬 함량에서 분비 된 호르몬의 %로 표시된다 (± SEM을 의미)에 대한 N = 7 기증자 (각 기증자에 대한 하나의 복제) .This 그림 참조 (18)에서 수정되었습니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
도 2 :. 인간 골격 Myotubes 의해 기저 IL-6 분비 강하게 기능적 일주기 클록의 부재 금지 아세포는 렌티 바이러스 입자로 형질 도입 한Bmal1 - 루크의 형질 전환 유전자, myotubes로 분화하고, siControl 또는 siClock siRNA를 하나 형질을 포함. 24 시간 형질 따라 myotubes은 아데 닐 레이트 사이 클라 제 활성화 펄스에 동기 한 병렬 생물 발광 기록 연속 perifusion 실시. (A) 대표 사진은 myotubes의 분화를 유도하는 매체를 포함하는 20 % ~ 2 %의 FBS에서 스위치 다음 날 0 (D0) 및 D7에서 촬영되었다. 분화 과정에서 인간 근육 아세포이 재배 향되고, 신장되고 그리고 plurinuclated syncytium을 형성하기 위하여 함께 융합. siControl의 (B) Bmal1 룩 생물 발광 프로파일은 myotubes (검은 선) -transfected 및 siClock은 (회색 선) myotubes을 -transfected. Bmal1 - 루크 진동 프로파일은 3 개의 독립적 인 실험 (실험 당 하나의 기증자)에 기록되었다. (C) 대표 기저 IL-6 분비시계 기능의 존재 또는 부재의 단면도. perifusion 유출 매체 (0-4 0 시간 및 4 시간 사이에서 IL-6의 축적에 상당) 48 시간 동안 4 시간 간격으로 수집 하였다. 배지에서 IL-6 레벨은 3 개의 독립적 인 실험에서 두 기술 중복 ELISA에 의해 평가 하였다. 결과는 총 DNA 함량 정규화 기저 IL-6 농도를 나타낸다. IL-6 분비가 일 주기성 시계 중단시 69.30 ± 10.61 %의 평균 감소 하였다 (SEM 평균 ±, N = 3; * P <0.05, 쌍을 이루는 t 테스트). 이 그림은 참조 (19)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 실험 설정은 다음 체외 동기화 및 며칠 동안 생물 발광의 연속 기록, 같은 세포에 의한 호르몬 분비의 병렬 분석 한 다음, 배양 된 인간의 기본 세포로의 circadian 생물 발광 기자의 렌티 바이러스 전달로 구성된다. 그들은 분자 메커니즘과 인간의 일차 전지에 주기성 시계의 기능적인 측면을 탐구하기위한 효율적인 접근 방식을 나타냅니다.
도너 재료의 품질이 가능한 기본 조직 배양의 제조를위한 중요한 과제이다. 인간의 아일렛의 품질 실험을 시작하기 전에 각각의 시간을 평가하여야한다. 추정 순도 및 / 또는 70 %보다 열등 생존과 섬이 실험을하지 않는 것이 좋습니다. 아일렛 세포 생존 및 기능에 중요한 역할을 해리 문화의 접촉을 재 구축하는 경향이있다. 췌도 세포 증식 CU 없으므로lture, 그들은 세포는 이웃 세포와 연락처를 확립 할 수있는 높은 밀도에 도금해야합니다. 이는 소량의 물방울 세포를 도금함으로써 달성된다. 중요한 세포 죽음은 저밀도 췌장 세포 배양 물에서 더 높다. 배지 교체는 세포 건조를 피하기 위하여 신속하게 수행되어야합니다.
높은 밀도는 근원 세포 분화를 유도 할 수 있기 때문에 아세포가 60 % 합류 바람직 계대한다. 트립신 처리 후 아세포 신중하게 재현 탁시키고, 세포 클러스터를 회피하도록 적절하게 분산되어야한다.
일차 전지의 세균 또는 곰팡이 오염이 perifusion 분석을 시작하기 전에 현미경 제외해야합니다. 문화 매체는 항진균 물질로 보충 될 수 있습니다. 또한, perifusion 튜브가 알코올 요오드 소독 / 멸균 물과 금속 캡에 의해 세척해야 고압 증기 멸균 소독해야한다. 이 단계는 각 전자 사이에 권장xperiment.
생물 발광 효율 기록 용, 리포터 렌티 바이러스 제제의 품질은 생물 발광 신호의 강도에 의해 결정되어야한다. 문제 해결을 포함하여 렌티 바이러스 생산의 세부 사항은 http://lentilab.unige.ch/에서 찾을 수 있습니다. 렌티 바이러스 생산을위한 형질 전환 플라스미드 이전에, 293T 세포를 30-50 %의 합류에 도금한다. 매우 CMV-GFP 또는 다른 형광 lentivector를 사용하여 예를 들어, 병렬 접시에 형질 감염 효율의 제어를 행하는 것을 추천합니다. 각각의 바이러스 준비 바이러스 역가가 확립되어야한다.
전술 한 실험들은 일반적으로 (48 시간 이상) 오래 지속되기 때문에, 이러한 시간 범위 동안 안정 사일런있는 것이 중요하다. siRNA의 농도는 siRNA의 시약 프로토콜에 따라 세포 생장뿐만 아니라 최적화되어야한다. 유전자 침묵의 효율 experime 끝에 테스트해야NT RT-qPCR에 의해 또는 웨스턴 블로 팅에 의해.
perifusion 동안 유량 완전히 접시에 배지를 교환하는데 필요한 시간을 결정뿐만 아니라 일차 세포 배양 물에 기계적 충격을 갖는다. 실제로, 너무 낮은 속도의 흐름을 설정하는 상기 접시 매체의 전체 교환을 허용하지 않으며, 상기 방법의 민감도를 감소시킬 것이다. 반대로, 고속 유량은 세포가 손상된다. 우리 손에 두 세포 유형에 대한 최적의 속도는 1 시간 당 유출 배지 0.5 ml를 수집 할 수 있도록했다.
중요한 유출 매체 내의 물질의 농도 측정을 얻기 위해, 분비 세포의 충분한 수가 perifused 접시에 존재해야한다. 분비 된 물질의 검출을위한 후속 조치 방법 (ELISA 또는 기타)은 특히 매우 낮은 농도에서 분비되는 물질에 대해 충분히 민감해야한다. 높은 세포 밀도를 극복하는 것이 좋습니다 수 있습니다이 문제를 가능하면. 기준 (19)에 상세하게 소개하여 설명 된 바와 같이 대안 적으로, 상기 유출 매체 투석 또는 원심 필터로 농축 될 수있다.
인간의 췌장 섬 세포 및 기본 myotubes에서 함께 실험을 찍은이 인간의 세포는 높은 진폭 세포 자율적 인 일 주기성 시계 18-19을 가지고 있음을 처음으로 강력한 증거를 제공한다. 루미 장치 우리는 이러한 클럭은 췌장 세포의 기저 인슐린 분비의 주기성 조절 (도 1D)에 중요한 역할을한다는 것을 증명 하였다 (도 1b)와 골격 myotubes 의해 기저 IL6 분비 결합되어 여기에 설명 perifusion 시스템을 채용 (그림 2C). 또한, 두 실험 시스템에서, 코어 클록 유전자 CLOCK 쓰러함으로써 기능성 주기성 발진기 적절한 리듬 인슐린과 IL-6 분비에 필요한 것을 보여인간 췌장 및 골격근 세포, 각각 (도 1C, 및도 2b D, C)에 의해. 우리의 결과는 적절한 인슐린 분비에 대한 인간의 섬 클럭의 중요한 역할을 나타내고, 설치류 유전 모델 15,17 수행 작품과 잘 일치한다. 생물 매일 환경 변화를 예측하기보다는 그들에게 반응 할 수있는 일 주기성 시계의 중요한 역할을 감안할 때, 기저 인슐린과 myokine 분비의 일중 규제는 rest-에 췌장 섬과 골격 근육 분비 활동을 조정 이러한 선행 메커니즘을 나타낼 수 몸 전체의 활동주기.
여기에 제안 된 방법이 용이 동일한 조직으로부터 추가 호르몬 분비를 연구하기 위해 수정 될 수있다. 이미 다중 인간 myokine 어레이 (19)를 사용하여, 골격 근육 세포에 의해 분비 myokines 추가로 대형 패널을 분석 한 결과, 우리는 평가하는 중글루카곤 ELISA 키트를 사용하여 인간의 췌장 세포에 의해 글루카곤 분비를 보내고 (데이터는 보이지 않음). 또한, 이러한 실험 조건은 아디 포카 인 분비, 갑상선 호르몬 분비 공부 인크 레틴 분비 등이 시스템의 또 다른 중요한 응용에 수에 대한 기본 장 세포 연구를위한 기본 thyrocytes을 연구, 예 차 지방 세포와 같은 다른 세포 유형에 대해 최적화 될 수있다 셀룰러 주기성 시계 기능 및 분비 생리 학적 및 / 또는 약학 적 화합물의 효과를 탐구한다. 관심 화합물 (높은 포도당 또는 유리 지방산의 다른 수준의 존재 하에서 인간의 췌장 세포에 의한 인슐린 분비 연구를 들면) 전체 실험 전반에 걸쳐 연속적으로 적용 할 수도 있고, 상기 화합물은 주기성의 선택 단계에서 첨가 될 수도 주기.
이 방법은 시험 관내 연구의 한계를 가지며, 일 주기성 리듬 가열 공기 조절기의 복잡성을 나타내지 않는다몸 전체의 수준에 LATION. 동시에, 제어 된 조건 하에서 세포 대사에 자율적 클럭의 역할을 구별 할 수 있습니다. 현재의 방법은 시험 관내 동기화 17 다음 세포 이식편의 분비 활성의 스냅 샷의 측정에 기초한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 동일한 세포 배양액 내에서 분비 주기성 리듬과의 조화 된 활성 지속적인 분석을 가능하게하는 고유 한 방법을 나타낸다. 대안 적으로,이 방법은 세포의 분비와 관련하여, 비 주기성 생물 발광 기자의 동역학을 연구뿐만 아니라 세포 기능에 perifusion 배지에 첨가 상이한 성분의 효과를 검출하기 위해 적용될 수있다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 효율적인 렌티 바이러스 준비, 2)의 siRNA와 기자 효율적인 세포 형질이 전달이 벡터; 3) 일정한 중간 유출 컬렉션 4) 확인한 해당 CE 충분한 개수LLS 수집 유출 매체 호르몬이나 사이토 카인의 레벨 측정을 얻기 위해 사용된다 (위의 문제 참조).
잠재적 시계 연결을 이해하기위한 중요하고 독특한 접근 방식을 나타낼 수있는 차 문화에서 인간의 말초 시계의 특성을 공부 인간 3-4,28,34-35의 일 주기성 시계의 교란 및 대사성 질환과 암 사이의 링크에 최근 증거의 관점에서 이러한 질병. 따라서, 기능적 인간의 췌장 섬과 골격 근육 시계와 인슐린과 myokines의 기저 분비 사이의 링크의 존재를 우리의 발견은 비만과 제 2 형 당뇨병 18-19과 같은 만성 질환의 개발의 이해에 대한 잠재적 인 결과를 맺을 수 있습니다 및 이들 질환의 치료에 새로운 길을 가져올 것이다. 중요한 것은, 확립 된 시험 관내 평가 발진기 특성 간의 상관 관계에 의한 생체 (36), 질병의 특징으로 인간의 일주기 시계 속성의 의미는, 최고 즉시 임상 관련성 (20)이다.
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Acknowledgments
우리는 제네바 대학에서 우리의 동료에게 감사 : 자크 필립이 작품에 대한 건설적인 의견, 그리고 Ueli Schibler perifusion 시스템의 개발 및 과학 영감을 귀중한 도움을 설계, 제조 및 시운전 생각하는 데에 대한 앙드레 Liani 관류 시스템의 perifusion 시스템 및 누수 biolumicorder 소프트웨어 개발에 도움을 LESA-기술 LTD 회사, 조지 SEVERI는 perifusion 실험에 대한 지원을 위해, 우르술라 Loizides-만 골드는 대한 비판적 렌티 바이러스 제제에 대한 원고를 읽기, 앤 - 마리 Makhlouf ; 에티엔 느 Lefai, 스테파니 Chanon 및 휴 버트 비달 (INSERM, 리옹) 인간의 기본 근육 아세포를 제조하는 단계; 인간의 독도를 제공 도메니코 보스코와 티에리 Berney (인간의 작은 섬 이식 센터, 제네바 대학 병원)에. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호에 의해 투자되었다 31003A_146475 / (1),시nergia 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 번호 CRSII3-154405, 파운데이션 부문로만 드 라 공들인 쉬르 Diabète, 보 Hjelt 재단, 파운데이션 부문 에른스트 외 루시 Schmidheiny, 그리고 소시 Académique 드 제네바 (CD)를 붓는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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