Abstract
Los relojes circadianos son funcionales en todos los organismos sensibles a la luz, lo que permite una adaptación al mundo exterior mediante la previsión de los cambios ambientales diarios. considerables progresos en la comprensión de la estrecha conexión entre el reloj circadiano y la mayoría de los aspectos de la fisiología se ha hecho en el campo durante la última década. Sin embargo, desentrañar la base molecular que subyace a la función del oscilador circadiano en los seres humanos se mantiene más alta de desafío técnico. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de un enfoque experimental para el largo plazo (2-5 días) de grabación de bioluminiscencia y la recogida de medio de salida en células primarias humanas cultivadas. Para este propósito, hemos transducidas células primarias con un indicador de luciferasa lentiviral que está bajo control de un promotor del gen de reloj del núcleo, lo que permite la evaluación paralela de la secreción de la hormona y la bioluminiscencia circadiano. Además, se describen las condiciones para interrumpir el reloj circadiano en primary células humanas mediante la transfección de siRNA RELOJ de orientación. Nuestros resultados en la regulación circadiana de la secreción de insulina por los islotes pancreáticos humanos, y Myokine secreción de las células del músculo esquelético humanos, se presentan aquí para ilustrar la aplicación de esta metodología. Estos ajustes se pueden utilizar para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y analizar su impacto funcional en las células primarias en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.
Introduction
El sistema de sincronización circadiano (del latín "circa diem") se ha convertido en todos los organismos sensibles a la luz, como un mecanismo de adaptación a la rotación de la Tierra. En los mamíferos, está organizado de una manera jerárquica, que abarca el reloj central, que está situado en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo ventral, y periférica (o esclavo) osciladores que son operativos en diferentes órganos. Además, estas células osciladores autónomas autosostenidas son funcionales en casi todas las células del cuerpo 1. Fóticos señales representan una señal de sincronización dominante (Zeitgeber) de las neuronas del SCN, mientras que las señales neurales y humorales que emanan del SCN reajustar los relojes periféricos. Se incrementan los ritmos de descanso-actividad, que impulsan en ciclos de alimentación-ayuno a su vez, son otros sincronizadores para relojes periféricos 2. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, la composición molecular del reloj central se basa en la transcripción y translabucles de retroalimentación cionales, que se conservan entre los organismos. Esto comprende los activadores de la transcripción BMAL1 y el reloj, que en conjunto activan la transcripción de los genes negativos de reloj de núcleo PER y llorar. Los altos niveles de PER y proteínas Cry inhibirán su propia transcripción a través de la inhibición del complejo / RELOJ BMAL1. Un bucle auxiliar consta de los receptores nucleares REV-ERB y Rors, que también regulan la transcripción de BMAL1 y el reloj. Por otra parte, los acontecimientos posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación, sumoylation, acetilación, O-GlcNAcylation, la degradación y la entrada en el núcleo de las proteínas del reloj del núcleo representan una capa adicional reguladora importante en el establecimiento del ciclo de oscilación de 24 horas 3.
La acumulación de pruebas se deriva de estudios en modelos de roedores y pone de relieve el papel fundamental del sistema circadiano en la coordinación de las funciones metabólicas y endocrinas 4-5. Un número de large-escala de análisis del transcriptoma indican que la alimentación - ayuno ciclos juegan un papel central en la sincronización de osciladores periféricos 6-8. En un acuerdo con estos estudios, el análisis metabolomic y lipidomic en roedores y seres humanos han revelado que un gran número de metabolitos oscile en el tejido, plasma, saliva y de una manera circadiano 9-11. Es importante destacar que, la mayoría de las hormonas exhiben ritmos circadianos en 5,12-13 sangre. Por otra parte, los relojes circadianos de la correspondiente hormona que produce el tejido periférico podrían regular la secreción de la hormona localmente. Osciladores circadianos células autónomas se han descrito en roedores y células de los islotes pancreáticos humanos 14-16. Estos osciladores juegan un papel esencial en la regulación del transcriptoma de los islotes pancreáticos y la función 15,17-18. Por otra parte, la secreción Myokine por miotubos esqueléticos humanos se ha demostrado recientemente para exhibir un patrón circadiano, que está regulada por oscillato de células autónomasrs operativos en estas células 19.
Varios enfoques para el estudio de los ritmos circadianos en los seres humanos in vivo se han usado ampliamente. Por ejemplo, la melatonina plasma o los niveles de cortisol, así como temperatura de la superficie de la piel torácica (revisado en referencias 3,20) han sido estudiados para evaluar los relojes circadianos endógenos. Aunque estos métodos permiten el estudio de las oscilaciones circadianas sistémicos en vivo, que están lejos de proporcionar una evaluación fiable de los ritmos circadianos autónomos de funcionamiento libre en diferentes órganos y tejidos. Sin embargo, como la disección de la regulación sistémica sería una herramienta indispensable para la comprensión de los efectos específicos de los relojes moleculares intracelulares de la función de estas células. Por lo tanto, se ha realizado un esfuerzo considerable para desarrollar enfoques fiables para el estudio de los relojes humanos en cultivos celulares inmortalizadas o primarios sincronizados in vitro. Es importante destacar que se ha demostrado quecaracterísticas de reloj medidos en células de fibroblastos de piel cultivados primaria reflejan estrechamente las propiedades del reloj individuales de todo el organismo 21. El desarrollo de los reporteros fluorescentes y bioluminiscentes circadianos ha avanzado en gran medida este enfoque 22-27. Por otra parte, el estudio de los relojes de células primarias que se derivan de diferentes órganos periféricos permite la investigación de las propiedades moleculares de los relojes específicos de tejidos humanos 3,5,16,19-20,28. Por lo tanto, la evaluación de los relojes circadianos en in vitro de explantes o células primarias sincronizados, mediante el uso de los reporteros bioluminiscentes, representa un método muy útil para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y su impacto en la función del órgano.
En este artículo, presentaremos los protocolos detallados para la evaluación de la expresión de genes circadianos en las células de los islotes primaria y el músculo esquelético humano sincronizados in vitro, así como el impacto de reloj celular autónomala interrupción de la función secretora de estas células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de la ética: Manipulaciones incluidas en este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Ginebra y por el Comité Ético SUD EST IV (Acuerdo 12/111) 19. Islotes humanos se aislaron a partir de páncreas de donantes múltiples órganos con muerte cerebral en el Centro de Trasplante de islotes en el Hospital Universitario de Ginebra (Suiza) como se ha descrito por nosotros en las referencias 16,18, u obtenida de una fuente comercial.
1. Preparación del cultivo de células primarias
- Aislamiento humanos islote pancreático, disociación y Cultura
NOTA: Capa cada tubo, punta de plástico o una pipeta con Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medio con el fin de evitar islotes o células de los islotes se pegue a la superficie de plástico, que puede conducir a una pérdida significativa de material celular.- Un día antes de la disociación celular de los islotes añadir 1 ml de matriz extracelular laminina-5-rica (derivado de las células 804G como descricama en la referencia 29) por 3,5 cm plato. Antes de placas células, aspirar la matriz y se lava el plato 3 veces con agua bi-destilada estéril. Dejar que la cápsula se seque bajo la cabina de flujo laminar durante 5 min.
- Dentro de la cabina de flujo laminar, distribuir los islotes obtenidos con medio CMRL en 15 tubo (s) ml. Centrifugar a 272 g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante, y luego volver a suspender el sedimento en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) previamente calentada a 37 ° C sin calcio y magnesio. Centrifugar a 272 g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de DPBS.
- Para contar el número total de islotes, de pipeta 10 l de la suspensión de islotes 1 ml en un nuevo plato 3,5 cm. Contar el número de islotes en la caída de 10 l bajo el microscopio y de esta calcular el número total de islotes en la suspensión de islotes 1 ml. Añadir 14 ml de DPBS y centrifugar la suspensión celular una mástiempo en 272 xg durante 5 min.
- Para la disociación de células de islote, aspirar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células durante un máximo de 1,000 equivalentes de islotes (IEQ). Se coloca el tubo en un baño de agua a 37 ° C y mezclar suavemente los islotes pipeteando arriba y abajo varias veces cada minuto, durante 6-10 minutos.
NOTA: Para verificar la calidad de la digestión, pipetear una caída de 2 l de suspensión en un portaobjetos de vidrio y se les presentarán bajo el microscopio que todas las células están bien separadas, y que no hay dobletes o grupos de células se han mantenido. - Detener la reacción mediante la adición de 14 ml de CMRL frío con suplementos (10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 1% de gentamicina, 1 piruvato de sodio%). Centrifugar a 425 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 15 ml de medio CMRL al sedimento celular.
- Resuspender el precipitado en un pequeño volumen de CMRL con suplementos. Contar el número de células en el microscopio utilizando una hemocytometro, ajustar el volumen CMRL con el fin de obtener una concentración de células de ~ 650, 000 células / ml.
- Pipetear 3 separa gotas de 100 l cada una de la suspensión celular dispersada obtenida en la etapa 1.1.8 en una placa de 3,5 cm pre-recubiertas con laminina.
NOTA: Las células se adhieren al plato en aproximadamente 24 horas. - Se incuban las células (Figura 1A) en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C en una cámara húmeda. Cambiar el medio de la célula gotas cada 2-3 días por aspiración de 100 l de cada gota y su sustitución por el mismo volumen de medio fresco.
- Primaria humana mioblastos cultura y diferenciación en miotubos
- biopsia de tejido, el aislamiento de células satélite y la cultura de mioblastos
Nota: Las biopsias musculares se obtuvieron del grupo de Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Francia) 19.- Purificar mioblastos esqueléticos primaria de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito 30.
- diferenciando pmioblastos en miotubos humanos rimary
- Tomar un vial (1 x 10 6 células) de mioblastos humanos almacenados en nitrógeno líquido y descongelar las células rápidamente poniendo el vial durante 30 segundos a 1 minuto en un baño de agua a 37 ° C con agitación.
- células de pipeta (1 ml) en 24 ml de medio de crecimiento compuestas de HAM F-10 suplementado con 20% FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B.
- Centrifugar 5 min a 150 x g.
- Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 15 ml de medio de crecimiento fresco por 2,5 x 10 5 células.
- Placa de al menos 2,5 x 10 5 células por matraz F75 adherente. Mantener los mioblastos en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, se disocian las células con tripsina-EDTA al 0,05% durante 1-2 minutos y la placa en 2 ml de medio de crecimiento sobre platos adherentes 3,5 cm de Petri.
- Después de alcanzar la confluencia, se elimina el medio de crecimiento.
- Iniciar el proto diferenciacióncol de mioblastos humanos en miotubos cultivando en 2 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 1 g / L de glucosa, 2% de FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B (medio de diferenciación) en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días.
NOTA: Myotubes se forman generalmente dentro de 7-10 días. - Consultar la diferenciación de células de músculo bajo el microscopio (figura 2A) mediante la observación de la fusión de mioblastos en miotubos polinucleadas 19.
- biopsia de tejido, el aislamiento de células satélite y la cultura de mioblastos
2. pequeños ARN de interferencia (siRNA) Transfección
- siRNA transfección de células de islotes humanos
NOTA: El protocolo de transfección se realiza en gotas de 100 l en el día siguiente, después de disociación de células (pasos 1.1.1-1.1.10).- Aspirado de 100 l de medio CMRL de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de suero libre de medio esencial mínimo (MEM) 2 hantes de la transfección mediante pipeteo.
- Prepare una mezcla a base de MEM de reactivo de transfección y 50 nM de objetivo siRNA (Siclock) o 50 nM de no director siCONTROL de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Por un plato con 3 gotas preparar dos tubos de 1,5 ml con 200 l de MEM cada uno.
- Añadir a uno de estos tubos de 4 l de reactivo de transfección.
- Añadir a la segunda tubo de 1 l de la solución de siRNA de la correspondiente (20 M).
- Agitar estos dos tubos lentamente en el agitador orbital durante 5 min y luego mezclar el contenido de los tubos juntos y agitar durante 20 min más.
- Aspirar 100 l de MEM de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de mezcla de transfección obtenida en el paso anterior con la pipeta.
- Vuelva a colocar la solución de transfección con medio CMRL después de 4 horas de incubación a 37 ° C. Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 al día siguiente para celular re-transfección.
- siRNA transfección de miotubos humanos
- Antes de la transfección, sustituir el medio (véase la etapa 1.2.2.8) con 2 ml de medio de diferenciación fresca por 3,5 cm plato petri.
- En un tubo estéril de 1,5 ml, preparar una mezcla de 20 nM siRNA (siCONTROL o Siclock), que corresponde a 2,4 l de una solución 20 mM siRNA, y 12 l de reactivo de transfección diluidos en 100 l de medio de diferenciación. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 15 min con agitación suave.
- Transfectar células con 114,4 l de la mezcla de siRNA por 3,5 cm células plato de petri y lugar en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C y CO 2 durante 24 horas al 5%.
3. continuo a largo plazo circadiano bioluminiscencia de grabación a cabo en paralelo con la Evaluación de la secreción de la hormona en las células vivas humanas primarias
- La introducción circadianos Los reporteros de bioluminiscencia en células humanas primarias porLa transducción lentiviral
NOTA: Todos los procedimientos con partículas de lentivirus se deben realizar en una instalación de bioseguridad de nivel 2 para tomar precauciones adicionales para el trabajo con los agentes que representan un peligro potencial moderado para el personal y el medio ambiente.- Preparar partículas reportero lentivirales por co-transfección del vector de pLenti6.4 interés / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc o pLV156-Per2-dLuc (llamado Bmal1-luc y Per2-luc, respectivamente,) plásmido 31 con vectores lentivirales pMD2G y pspax en células 293T utilizando el método de polietilenimina (para el procedimiento detallado véase la referencia 16).
- Valorar las partículas lentivirales obtenidos (detalles en la valoración se pueden obtener en http://lentilab.unige.ch/). Para otros experimentos, utilizar lentivirus con títulos que van 10 4 a 10 5 unidades de transducción [TU / l].
- Coloque los platos con células de islotes humanos o mioblastos humanos (en el 30-50% de confluencia) en el interior de la cabina de flujo laminaret y reemplazar el medio con 2 ml de medio CMRL suplementado fresco (ver paso 1.1.7) o medio de crecimiento (véase la etapa 1.2.2.2), respectivamente.
- Calcular la multiplicidad de infección (MOI) (es decir, partículas infecciosas (unidades de transducción) / número de células).
- Transducir el cultivo de células primarias pipeteando solución lentivirus para el plato con el fin de obtener una MOI = 3 (por ejemplo, para 65.000 células unidas añaden 3 l de la solución de virus con el título de 6,5 x 10 4-100 gota l de medio).
- Incubar toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambio de medio el día siguiente.
NOTA: transducir células de los islotes humanos al menos 4 días antes de la grabación de bioluminiscencia con el fin de lograr la expresión suficiente de la construcción indicadora. Los mioblastos se transdujeron durante la fase de expansión, entonces crecer hasta confluencia, y posteriormente se diferenciaron en miotubos.
- In Vitro La sincronización de las células humanas primarias
- <li> Añadir 10 M de ciclasa activador de ciclasa en 2 ml de medio por 3,5 cm plato de Petri que contiene las células primarias transducidas con anterioridad en el paso 3.1.5.
- Incubar durante 60 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.
- Cambiar el medio que contiene el activador de la adenilato ciclasa con 2,5 ml del medio de grabación que contiene 100 mM de luciferina.
NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B.
4. Evaluación paralela de bioluminiscencia circadiano de grabación y Hormona perfiles en células sincronizadas humana secretora primarias
- Configuración de largo plazo perifusion constante y la bioluminiscencia de Grabación en células humanas primarias.
NOTA: Cuando outs de trabajoide la campana de flujo laminar, limpiar todas las superficies de contacto y limitar la exposición de las culturas o medio para el aire para evitar la contaminación.- Para preparar el medio de perfusión, añadir 100 mM de luciferina al medio.
NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B. - Dentro de la cabina de flujo laminar, abrir los 3,5 cm platos que contienen los cultivos transducidos, transfectadas y sincronizados primarios de células (células de los islotes o miotubos) como se ha descrito anteriormente. Insertar tapas metálicas estériles (desarrollados en casa) (Figura 1B2) en los platos de 3,5 cm que están equipadas con afluencia de silicona / tubos de flujo de salida de conexión (Figura 1B1 / B5).
- Colocar los recipientes en la plataforma de medición en el 37 ° C light estanca incubadora. Fijar los platos a la plataforma mediante el uso de un adaptador atornillable (Figura 1B3). Introducir los tubos de afluencia / flujo de salida del sistema de perifusion en los tubos de silicona apropiados de la tapa (Figura 1B1 / B5) y ajustar la velocidad de la bomba a una velocidad de flujo de ~ 0,5 ml de medio por 1 hr.
- Abra el software de goteo biolumicorder de desarrollo propio que registra las señales del detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Elegir el directorio donde se almacenarán y comienzan bioluminiscencia continua la grabación desde cada plato haciendo clic en el icono "Inicio" los datos.
NOTA: Como alternativa al software Drip-biolumicorder, otros programas (por ejemplo LumiCycle), se pueden utilizar para grabar señales de detector PMT. - Colocar las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos estériles en la colecta en hielo.
- Abra el software de control que controla la sincronización del interruptor automático entre los pocillos de recogida. Configurar el tiempo window de la recogida de medio (seg). Iniciar la recogida del medio de salida de cada 4 horas (14.400 segundos; ~ 2 ml por punto de tiempo) haciendo clic en el icono "run".
- Transferir y medir el medio de salida de cada colección bien en recipientes estériles de tubos de 2 ml con la pipeta. Mantenga tubos en un congelador a -20ºC antes de comenzar el siguiente paso. Repita los pasos 4.1.5-4.1.6 cada 24 horas.
- Detener la grabación bioluminiscencia y el flujo del medio haciendo clic en el icono de "stop" en el software correspondiente. Retire las tapas metálicas y aspirar el medio residual de los platos.
- Con el fin de normalizar los valores de proteínas secretadas obtenidos en diferentes experimentos, o bien extraer el ADN (normalización por el contenido de ADN genómico para miotubos 19), o añadir 1 ml de tampón de lisis ácido-etanol (normalización del contenido total de la hormona para las células de los islotes 18) a la platos.
- Para preparar el medio de perfusión, añadir 100 mM de luciferina al medio.
5. Medición de los Niveles hormonales Islet y Myokine en el flujo de salidaSe obtiene por medio de perfusión continua de células humanas endocrino primario
- Insulina
- Cuantificar los niveles de insulina basales en el medio de salida de puntos de tiempo recogidos por el uso de un kit de insulina humana ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido total de insulina, extraído de células tratadas con ácido-etanol al final del experimento (etapa 4.1.9) 18.
- La interleucina-6 (IL-6)
- Cuantificar basales de IL-6 en el medio de salida desde los puntos temporales recogidos mediante el uso de un IL-6 humana kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido de ADN genómico en el final del experimento (etapa 4.1.9).
6. Los análisis del conjunto de datos circadianos para Bioluminescencia y Hormona Perfiles
- Análisis bioluminiscencia
- Analizar el perfil de bioluminiscencia utilizando el software suministrado 19.
- Análisis de ciclo JTK
- Analizar los perfiles de secreción de hormonas y registrar los resultados de bioluminiscencia utilizando el algoritmo JTK_CYCLE 32.
- Establecer el ancho período circadiano a 20-24 h.
NOTA: En caso de que se registraron las condiciones experimentales en paralelo, un análisis estadístico de dos puede llevar a cabo para comparar los experimentos.
- Análisis CosinorJ
- Por otra parte, analizar la secreción de hormonas y perfiles circadianos bioluminiscencia utilizando el software de CosinorJ 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La evaluación de los islotes con Hormona paralelo circadiano bioluminiscencia de grabación a partir de células de islotes humanos Perifused
Después de proporcionar una primera caracterización molecular del reloj circadiano, operativo en las células de los islotes humanos 16, que apunta a estudiar el impacto de la interrupción del reloj en función de los islotes y la transcripción 18. Hemos creado un protocolo eficiente Siclock transfección en las células de los islotes humanos dispersos (véase el Protocolo para más detalles), lo que resultó en más de un 80% desmontables de RELOJ ARNm, y en la ablación de reloj eficaz medida por perfiles de bioluminiscencia circadiano 18. la secreción de insulina inducida por análisis de glucosa (GSIS) reveló redujo significativamente basal y estimulada la secreción de insulina a partir de tal interrupción de reloj (no mostrado). Para evaluar la secreción de hormonas por las células de los islotes humanos alrededor del reloj, un Continsistema perifusion superfluo se conectó a un luminómetro (representado en la Figura 1B). Células de los islotes humanos, que llevan un funcional (siCONTROL) u oscilador disfuncional (Siclock) fueron transducidas con partículas de lentivirus Bmal1-luc. Las células se sincronizan posteriormente con un pulso de activador de la adenilil ciclasa, seguido de análisis en paralelo de la bioluminiscencia circadiano y la secreción de insulina en el medio de flujo de salida durante 48 hr (Figura 1C, D 18). Estos experimentos sugieren que bajo concentración constante fisiológica de la glucosa (glucosa 5,6 mM), la secreción de insulina por las células de los islotes humanos sincronizados in vitro presenta un perfil circadiano, que está interrumpido en muestras que llevan Siclock (Figura 1D).
El estudio de la secreción por Myokine esquelético humano Myotubes sincronizada in vitro en presencia o ausencia de reloj funcional
33, que tuvo como objetivo caracterizar los ritmos circadianos en el esqueleto humano primario miotubos y en la investigación de su papel en la función myotube 19. Con este fin, la alteración del reloj circadiano en miotubos esqueléticos se consiguió mediante la transfección de ARNsi RELOJ orientación. Reportero ensayos de bioluminiscencia circadianos con Bmal1-luc y reporteros Per2-luc revelaron que miotubos esqueléticos humanos, sincronizados in vitro, muestran un ritmo circadiano autosostenido, que fue confirmado por las expresiones fundamentales de reloj transcripción endógena (Figura 2B; 19). Este reloj endógeno fue interrumpido de manera eficiente en presencia de siRNA RELOJ de orientación (Figura 2B). Por otra parte, la secreción basal de IL-6 (Figura 2C), la interleucina-8 (IL-8)y proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) (no mostrado) por miotubos esqueléticos sincronizados, evaluados por el sistema de perfusión que aquí se describe (Figura 1B) y el análisis multiplex posterior Myokine a gran escala (no mostrado), exhibe un perfil circadiano, que es fuertemente desregulado sobre la interrupción del reloj (Figura 2C 19).
Figura 1: Evaluación de la secreción de la hormona con Paralelo circadiano bioluminiscencia de grabación a partir de células de islotes humanos Perifused (A) imagen representativa de las células de los islotes humanos unidos un día después de la disociación de los islotes.. (B) Representación esquemática del sistema de perifusion hecho en casa que incluye una botella con el medio de perfusión, una bomba, una plataforma de medición equipado con un tubo fotomultiplicador (PMT) dentro de la incubadora hermética a la luz, Un dispositivo de luminómetro, controlado por el software de grabación, y un colector de muestra semiautomático. Insertar: tubo (B1) La afluencia de conexión; (B2) casquillo metálico para el plato de Petri de 3,5 cm; (B3) adaptador atornillable que se une la tapa a la plataforma de medición (B4); tubo (B5) de flujo de salida de conexión; (B6) controla automáticamente distribuidor medio. (C) células de los islotes humanos fueron transfectadas con siRNA o bien revueltos (siCONTROL) o siRNA RELOJ focalización (Siclock) y transducidas con el reportero Bmal1-luc. Las células se perifused constantemente con medio de cultivo que contiene glucosa 5,6 mM. bioluminiscencia circadiano se registró tras la sincronización mediante un impulso activador de la adenilato ciclasa. (D) Los niveles de insulina se evaluaron por ELISA en las muestras recogidas de salida cada 4 horas durante 48 horas. Aplicación de algoritmo JTK_CYCLE 32 confirmó que en el presencia de un reloj funcional (siCONTROL), el perfil medio de la insulina secretada era circadiano dentro de las 48 horas, con una longitud de 24.19 ± periodo de 0,89 horas (** p = 0,009; n = 7 donantes). Este perfil circadiano se perdió tras la interrupción del reloj (Siclock). Los datos se presentan como% de la hormona secretada al contenido total de la hormona (media ± SEM) para n = 7 donantes (un replicado de cada donante) .Esta cifra ha sido modificado a partir de la referencia 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Basal de secreción de IL-6 por Myotubes esqueléticos humanos se inhibió fuertemente en ausencia de un reloj circadiano Funcional Los mioblastos se transdujeron con partículas de lentivirusque contiene el transgén Bmal1-luc, diferenciado en miotubos, y transfectadas con cualquiera de siCONTROL o Siclock siRNA. 24 horas después de la transfección, miotubos se sincronizaron con un pulso activador de la adenilato ciclasa y se sometió a perifusion continua con la grabación de la bioluminiscencia paralelo. (A) Fotografías representativas fueron tomadas en día 0 (D0) y D7 tras el cambio de 20% a 2% FBS que contienen medio para inducir la diferenciación miotubos. Durante el proceso de diferenciación, mioblastos humanos se reorientan, se alargan y se fusionan entre sí para formar un sincitio plurinuclated. (B) los perfiles de bioluminiscencia Bmal1-luc de siCONTROL transfectadas miotubos (línea negro) y Siclock transfectadas miotubos (línea gris). Perfiles de oscilación Bmal1-luc se registraron en tres experimentos independientes (uno de los donantes por experimento). (C) basal Representante la secreción de IL-6Perfil en la presencia o ausencia de un reloj funcional. El medio perifusion flujo de salida se recogió a intervalos de 4 horas durante 48 hr (0-4 corresponde a la acumulación de IL-6 entre 0 hr y 4 hr). IL-6 niveles en el medio se evaluaron por ELISA en dos duplicados técnicas de tres experimentos independientes. Los resultados representan basales de IL-6 niveles normalizados para el contenido total de ADN. la secreción de IL-6 se redujo en promedio de 69.30 ± 10.61% a la alteración del reloj circadiano (media ± SEM, n = 3; * P <0,05, prueba t pareada). Esta cifra ha sido modificado a partir de 19 de referencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los parámetros experimentales descritos aquí se componen de entrega lentiviral de reporteros de bioluminiscencia circadianos en células humanas primarias cultivadas, seguido de la posterior sincronización in vitro y el registro continuo de la bioluminiscencia durante varios días, y el análisis paralelo de la secreción de hormona por las mismas células. Representan un enfoque eficaz para explorar los mecanismos moleculares y los aspectos funcionales de los relojes circadianos en células humanas primarias.
La calidad del material donante es una cuestión importante para la preparación de cultivos de tejidos primarios viables. La calidad de islotes humanos debe ser evaluado cada vez antes de comenzar el experimento. No se recomiendan islotes con pureza estimado o / y la viabilidad inferior al 70% para estos experimentos. células de los islotes tienden a volver a establecer contactos en cultivos disociados, que desempeña un papel importante en su supervivencia y función. Dado que las células de los islotes no proliferan en culture, deben ser colocaron en placas a una densidad alta, que permite a las células para establecer contactos con las células vecinas. Esto se consigue mediante siembra de las células en gotitas de un volumen pequeño. Es importante destacar que, la muerte celular es mayor en cultivos de células de los islotes de baja densidad. Tenga en cuenta que la sustitución medio se debe realizar rápidamente con el fin de evitar el secado de la célula.
Los mioblastos se deben a pases preferiblemente al 60% de confluencia, desde una densidad más alta puede inducir la diferenciación de mioblastos. Después de tripsinización, mioblastos deben ser cuidadosamente resuspendieron y se dispersaron para evitar grupos de células.
La contaminación bacteriana o fúngica de células primarias se debe excluir microscópicamente antes de comenzar el ensayo perifusion. El medio de cultivo puede ser suplementada con sustancias antifúngicas. Además, el tubo de perfusión debe enjuagarse por el alcohol de yodo de desinfección / agua estéril y las tapas metálicas deben ser esterilizados en autoclave. Se recomiendan los siguientes pasos entre cada correoXperiment.
Para la grabación de bioluminiscencia eficiente, la calidad de la preparación lentivirus reportero debe ser determinada por la intensidad de la señal bioluminiscente. Los detalles de la producción lentivirus incluyendo la solución de problemas se pueden encontrar en http://lentilab.unige.ch/. Antes de la transfección de plásmidos para la producción de lentivirus, las células 293T se deben colocaron en placas a 30-50% de confluencia. Es muy recomendable para llevar a cabo un control de la eficacia de transfección en un plato en paralelo, por ejemplo mediante el uso de CMV-GFP o un lentivirus fluorescente alternativa. Para cada preparación de virus se debe establecer el título de virus.
Como los experimentos descritos son típicamente larga duración (48 horas o más), es crucial tener silenciamiento estable durante este lapso de tiempo. La concentración de siRNA debe ser optimizado, así como la confluencia de células según el protocolo reactivo siRNA. Eficiencia de silenciamiento de genes debe ser probado en el extremo de la EXPERIMEnt por RT-qPCR o por transferencia de Western.
Durante perifusion, el caudal determina el tiempo necesario para intercambiar completamente el medio en el plato, pero también tiene un impacto mecánico en el cultivo de células primarias. De hecho, la configuración del flujo a una velocidad, que es demasiado bajo, no permitirá un intercambio completo de medio en el plato, y disminuirá la sensibilidad del método. Por el contrario, una velocidad de flujo de alta velocidad puede dañar las células. En nuestras manos, la velocidad óptima para ambos tipos de células permitió recoger 0,5 ml del medio de flujo de salida por 1 hr.
Es importante destacar que, para obtener una concentración medible de sustancias en el medio de salida, un número suficiente de células secretoras debe estar presente en el plato perifused. El método de seguimiento para la detección de la sustancia secretada (ELISA u otro) debe ser lo suficientemente sensible, especialmente para sustancias secretadas en concentraciones muy bajas. podría recomendarse mayor densidad celular para superareste problema cuando sea posible. Alternativamente, el medio de flujo de salida se puede concentrar por diálisis o con filtros centrífugos, como se ha descrito por nosotros en detalles en referencia 19.
Tomados en conjunto nuestros experimentos en células de los islotes pancreáticos humanos y en miotubos primarios proporcionan por primera vez evidencia convincente de que estas células humanas poseen un reloj circadiano células autónomas de gran amplitud 18-19. Empleando el sistema de perfusión que aquí se describe en combinación con un dispositivo de luminómetro (Figura 1B) hemos demostrado que estos relojes juegan un papel importante en la regulación circadiana de la secreción de insulina basal por las células de los islotes pancreáticos (Figura 1D), y de basal secreción de IL6 por miotubos esqueléticos (Figura 2C). Por otra parte, derribando el RELOJ gen reloj de núcleo en ambos sistemas experimentales, se muestra que se requiere un oscilador circadiano funcional para la insulina rítmica adecuada y la secreción de IL-6por islotes humanos y células del músculo esquelético, respectivamente (Figuras 1C, D y 2B, C). Nuestros resultados indican un papel crítico del reloj de islotes humanos para la secreción de insulina adecuada, y están en buen acuerdo con trabajos realizados en modelos genéticos de roedores 15,17. Teniendo en cuenta el importante papel del reloj circadiano en permitir a los organismos anticipar los cambios ambientales diarias en lugar de reaccionar a ellos, la regulación circadiana de la insulina basal y la secreción Myokine podría representar un mecanismo de este tipo de anticipación que coordina los islotes pancreáticos y el músculo esquelético actividades secretoras a los demás- ciclo de actividad de todo el cuerpo.
La metodología aquí propuesta se puede modificar fácilmente con el fin de estudiar la secreción de la hormona adicional de los mismos tejidos. Ya hemos analizado un gran panel adicional de myokines secretadas por las células del músculo esquelético, utilizando matrices múltiplex Myokine humanos 19, y estamos en el proceso de evaluaring la secreción de glucagón por las células de los islotes humanos utilizando el kit de glucagón ELISA (datos no mostrados). Por otra parte, estas condiciones experimentales se pueden optimizar para otros tipos de células, por ejemplo adipocitos primarios, para el estudio de la secreción de adipokine, tirocitos primaria para el estudio de la secreción de la hormona tiroidea, los enterocitos primaria para el estudio de la secreción de las incretinas, etc. Una aplicación importante adicional de este sistema podría ser la de explorar el impacto de compuestos fisiológicos y / o farmacológicos sobre la función del reloj circadiano celular y la secreción. El compuesto de interés puede aplicarse continuamente a lo largo de todo el experimento (por ejemplo el estudio de la secreción de insulina por las células de los islotes humanos en presencia de alto contenido de glucosa o diferentes niveles de ácidos grasos libres), o el compuesto puede ser añadido en una fase elegida de la circadiano ciclo.
Esta técnica tiene las limitaciones de un estudio in vitro y no representa la complejidad del Regla ritmo circadianomento a nivel de todo el cuerpo. Al mismo tiempo, ayuda a distinguir el papel de un reloj autónoma sobre el metabolismo celular en condiciones controladas. Actualmente los métodos disponibles se basan en mediciones instantáneas de la actividad de la secreción en las células o explantes siguientes en sincronización vitro 17. El protocolo descrito aquí representa un método único que permite un análisis concordantes y continuo del ritmo circadiano y actividad secretora dentro del mismo cultivo celular. Alternativamente, esta metodología se puede aplicar para estudiar la cinética de reporteros bioluminiscentes no circadianos, en relación con la secreción de la célula, así como para la detección de los efectos de diferentes sustancias añadidas al medio de perfusión en función de la célula. Los pasos críticos en el protocolo son: 1) la preparación eficiente de los lentivirus, 2) la transfección de células con siRNA eficiente y reportero vectores de transducción; 3) recogida constante flujo medio y 4) asegurándose de que un número suficiente de ceLLS se utiliza con el fin de obtener niveles medibles de hormonas o citoquinas en el medio de salida recogido (ver la solución de problemas arriba).
En vista de las recientes evidencias sobre la relación entre las perturbaciones del reloj circadiano y enfermedades metabólicas y el cáncer en los seres humanos, 3-4,28,34-35 estudian propiedades del reloj periférica humana en cultivos primarios puede representar un enfoque importante y única para la comprensión de la posible relación de reloj a estas enfermedades. Por lo tanto, nuestro descubrimiento de la existencia de enlaces entre los islotes de páncreas humano funcional y el reloj del músculo esquelético y la secreción basal de insulina y myokines, podría tener consecuencias potenciales para la comprensión del desarrollo de enfermedades crónicas, como la obesidad y la diabetes 2 de tipo 18-19 y traerá nuevas vías en el tratamiento de estas enfermedades. Es importante destacar que, debido a la correlación establecida entre las características de oscilador evaluados in vitro y in vivo la 36, implicación de las propiedades del reloj circadiano humano como un sello distintivo de las enfermedades, es de la más alta y la relevancia clínica inmediata 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a nuestros colegas de la Universidad de Ginebra: Jacques Philippe de comentarios constructivos sobre este trabajo, Ueli Schibler por su inestimable ayuda con el desarrollo del sistema de perfusión y para la inspiración científica, André Liani para el haber concebido el diseño, fabricación y puesta en servicio de el sistema de perfusión, la compañía de Lesa-Technology LTD para la asistencia en el sistema de perfusión y desarrollo de software de goteo biolumicorder, George Severi para obtener ayuda con los experimentos de perfusión, Ursula Loizides-Mangold para la lectura crítica del manuscrito, y Anne-Marie Makhlouf para las preparaciones de lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon y Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para la preparación de mioblastos humanos primarios; y para Domenico Bosco y Thierry Berney (Centro de trasplante de islotes humanos, Hospital Universitario de Ginebra) para proporcionar islotes humanos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencia de Suiza No. Nacional de Grant 31003A_146475 / 1, el Sinergia Swiss National Science Foundation Grant N º CRSII3-154405, Fondation Romande para la Investigación sobre la Diabetes, en Fundación Bo Hjelt, Fundación Ernst y Lucie Schmidheiny, y Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
