Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54677
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

Summary

البلعمة دبقية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة وعدم كفاية وظيفة أكلة وقد تورط في علم الأمراض. ومع ذلك، تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا. قمنا بتطوير تقنية بسيطة ولكنها قوية لرصد وقياس القدرة أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في إعداد الفسيولوجية على وجه التحديد.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو إجراء تقييم دقيق وتحديد في البلعمة دبقية الجسم الحي. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS). وأداء مجموعة متنوعة من المهام لضمان الحفاظ على توازن الأنسجة. وتشمل هذه المراقبة المناعي، إفراز عوامل عصبية و، من أهمية محورية، البلعمة 1. البلعمة دبقية أساسية في العديد من الأحداث الهامة خلال تطور الدماغ وشبكية العين، مثل البلعمة من نقاط الاشتباك العصبي غير ذات صلة (التقليم متشابك) وإزالة الخلايا العصبية أفكارك 2-4. وعلاوة على ذلك، وقد تبين البلعمة دبقية صغيرة من الخلايا العصبية التالفة أو أفكارك، والحطام الخلوي، والميكروبات الغازية لأنها ضرورية للحفاظ على الجهاز العصبي المركزي التوازن من خلال سن البلوغ 5. وأخيرا، فقد تورطت البلعمة دبقية في التسبب في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر والمرتبط بالعمرالضمور البقعي، حيث قيل إن المعيبة أو غير كافية القدرة أكلة يمكن أن تسهم في تراكم اميلويد β (Aβ) لويحات وبراريق شفافة، على التوالي 6،7.

وينظم وظيفة دبقية بإحكام من قبل المكروية، وخاصة من خلال العوامل القابلة للذوبان مثل ورم عامل النمو β أو التفاعلات خلية خلية. الخلايا العصبية تعبير جوهري عدة بروابط سطح الخلية، مثل CD200 وCX3CL1، في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة التعبير حصرا المستقبلات منها CD200R وCX3CR1. هذه المستقبلات تحتوي على immunoreceptor الزخارف تثبيط القائم على التيروزين (ITIMs) في جزء من الخلايا. هذه المانع مستقبلات حيوية لمنع الإفراط في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تسهم في neuroinflammation. وهكذا، في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية، والتفاعلات خلية خلية بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة تبقي الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة سكون. أثناء إصابة الأنسجة، ومع ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية أسفل تنظيم إكسبression هذه بروابط، وإزالة تأثير كابح بشكل خاص على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وهكذا وظيفة دبقية (بما في ذلك البلعمة) ترتبط ارتباطا وثيقا المكروية من 8. ومع ذلك، حتى الآن، لا توجد فحوصات موحدة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في سياق الفسيولوجية أو في الطريقة التي يعيد كامل الجهاز العصبي المركزي المكروية بهم.

وقد وضعت عدة فحوصات لقياس النشاط أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أو خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة يتم تربيتها مع الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية أفكارك) أو حبات fluorescently المسمى. ثم يتم تقييم امتصاص الهدف باستخدام الفلورسنت المجهر التصوير أو التدفق الخلوي 9-12. هذه المقايسات تتيح اختبار كيفية التلاعب الدوائي أو وراثية قد تؤثر على البلعمة دبقية صغيرة، وبينما غنية بالمعلومات، تفشل لتكرار تماما المجمع في بيئة الجسم الحي. طرق غير مباشرة لدراسة البلعمة دبقيةفي الجسم الحي وقد تم الإبلاغ عن: يتم إنجاز هذه تلوين جزيئات يعتقد أن تشارك في البلعمة (على سبيل المثال، CD68)، وتقييم القرب المادي من الخلايا الدبقية الصغيرة والأهداف لالبلعمة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية للخطر أو عناصر متشابك)، أو عن طريق كشف المناعى من أكلة أهداف داخل الخلايا دبيقي (على سبيل المثال، Aβ) 13-17. وقد استخدمت دراستين نهج أكثر مباشرة لتقييم الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في الجسم الحي. وقد استخدمت هيوز ورفاقه تقنيات التصوير لقياس امتصاص دبقية من الخرز تسليمها عبر الطريق داخل الجمجمة 18. سييرا وآخرون بتطوير أسلوب دقيق لتقييم كمي البلعمة الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا أفكارك باستخدام تقنيات التصوير المعقدة 4. ومع ذلك، هذه الطرق تتضمن بروتوكولات معقدة لإعداد الأنسجة، باجتزاء، والتصوير، والتحليل. لقد استخدمت سابقا تحليل cytometric تدفق لتقييم البلعمة من مبصرة خارجشرائح إيه بواسطة خلايا الشبكية الظهارة الصباغية (RPE) في الثقافة (19). هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم امتصاص بسرعة fluorescently المسمى الجسيمات من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين كإجراء الكمي في الجسم الحي الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة.

البروتوكول وصفنا هنا يسمح لقياس موثوقة والكمي للالبلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين في أقل من ست ساعات في ثلاث خطوات حاسمة: (1) تسليم intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى، (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية، و (3) تدفق تحليل cytometric. طريقة وضعنا هو وسيلة قوية لتقييم البلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين، ويمكن استخدامه بنجاح لاختبار مدى مختلف المركبات أو التلاعب الجيني تغير هذه الوظيفة دبقية الرئيسية في إعدادات الفسيولوجية. كمجال متخصص في الجهاز العصبي المركزي، وشبكية العين هو نظام نموذجي للوصول بسهولة إلى دراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة 20. في حين تم تطوير هذه الطريقة في تيانه عين، فإننا نعتقد أنه يمكن أن تكون مفيدة لجميع علماء الأعصاب التحقيق وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها معهد سكريبس للأبحاث.

1. إعداد مواد للحقن

  1. تعقيم إبرة 33 G وحقنة: تفكيك والأوتوكلاف على 115 ο C. تعد الإبر لحقن بسبب ارتفاع في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  2. ذوبان الجليد جزيئات fluorescently المسمى في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقيقة. يعد حل الجسيمات للحقن خلال إعادة تأسيس ل/ مل حل 50 ملغ في برنامج تلفزيوني العقيمة مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+.
    ملاحظة: تستخدم الجزيئات المسمى AF488 من أصل الفطرية التي تم التحقق من صحتها لفحوصات البلعمة في هذا البروتوكول 21-23. لامتصاص الأمثل، وإعداد جزيئات جديدة ومباشرة قبل الحقن.
    قد يكون الأمثل الجسيمات تركيزات لكل تجربة محددة: الملاحظة (2).

2. Intravitreal حقن الخرزة الحل

ملاحظة: اثنان صeople المطلوبة لإجراء الحقن، بطريقة مثل أن الشخص أداء الحقن يمكن الاستمرار على الماوس، والحفاظ على التركيز على مقلة العين، في حين أن الشخص الآخر يمر المحاقن تحميلها ويدفع المكبس.

  1. تخدير القوارض عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / مل الكيتامين و 10 ملغ / مل زيلازين بجرعة 20 ميكرولتر / 10 غرام من وزن الجسم. قبل الحقن، واستخدام قرصة أخمص القدمين إلى تقييم مستوى التخدير.
    ملاحظة: الأيزوفلورين له تأثير عميق على وظيفة خلايا الدم النخاعي، وبالتالي، واستخدامه في جميع أنحاء هذا الاختبار يجب تجنب 24،25.
  2. تحميل إبرة مع 0.5 حل الجسيمات ميكرولتر من fluorescently المسمى.
  3. وضع الماوس جانبية تحت المجهر الجراحي (الشكل 1A-B). استخدام مواد لينة، على سبيل المثال، حزمة هلام، لتحديد المواقع أفضل من الفأرة. بالنسبة للفئران الشباب فيها العيون ليست مفتوحة حتى الآن، افتح برفق الجفون مع مساعدة من غرامة 45 س ملقط الزاوية عن طريق إنشاء fissuإعادة على طول الشق الذي الجفون سوف تفتح في نهاية المطاف.
    1. مع مساعدة من ملقط غرامة 45 س الزاوية تطبيق بعناية الضغط حول جفن، بحيث ملوثات العضوية الثابتة مقلة العين قليلا من مأخذ. عقد رئيس مع اثنين من أصابع فقط فوق الأذن والفك، وتمتد برفق الجلد بالتوازي مع الجفون للحفاظ على العين قليلا من مأخذ. يجب الحرص على عدم فهم قريبة جدا من الحلق (الشكل 1B).
  4. ثقب مقلة العين، تضاف إبرة الحقنة في حوف القرنية (حيث القرنية والصلبة الاتصال). هذا واضح كدائرة رمادية في الفئران مصطبغة. سحب الإبرة قليلا لطرد كمية صغيرة من السائل الزجاجي ومن ثم حقن. الشخص الذي يؤدي حقن ينبغي أن تعقد بلطف الفأر مع يد واحدة وإبرة مع الآخر. الشخص الثاني أن تدفع ببطء الغطاس.
  5. سحب الحقنة ببطء. ترطيب تطبيق قطرات العين للحفاظ على العين رطبة. </ لى>
  6. دع القوارض يتعافى في قفص على وسادة الحرارة ويستمر لمراقبة الحيوانات. إذا كان يعمل مع الجراء، لا عودة الحيوان إلى قفص مع الحيوانات في حالة تأهب أخرى حتى يتم التنفس وقادرة على الحركة العفوية. إذا كان يعمل مع الكبار، لا عودة القوارض إلى قفص مع الحيوانات في حالة تأهب أخرى حتى يستعيد رقود القصية.

3. حصاد الأنسجة الشبكية

ملاحظة: أنسجة الشبكية من عيون لا حقن جزيئات fluorescently المسمى ينبغي جمع كعنصر تحكم لتحليل تدفق cytometric. على الرغم من أن الفحص يمكن القيام بها باستخدام الشبكية واحدة، للحصول على أفضل أداء، يجب أن تجمع اثنين من شبكية العين معا.

  1. جمع الشبكية الأنسجة 3 ساعات بعد الحقن intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى.
    ملاحظة: على الرغم من الوقت بعد الحقن من الحل الجسيمات قد يكون الأمثل لكل تجربة محددة، وجدنا أن 3 ساعة بعد الحقن، ويمكن أن ينظر الجسيمات امتصاص طوال معظم طبقات سو شبكية العين (الشكل 1C-D).
  2. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم.
  3. جمع مقل العيون عن طريق الضغط بلطف على الجفن بمساعدة غرامة 45 س ملقط الزاوية لproptose مقلة العين. وضع ملقط وراء مقلة العين وسحب.
  4. تشريح شبكية العين تشريح تحت المجهر. نقل مقلة العين إلى طبق بتري تحتوي على كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. في منطقة جافة من طبق بيتري، خرم مقلة العين في حوف القرنية مع غيض من ملقط رقيق.
  5. عقد مقلة العين بمساعدة غرامة 45 س ملقط الزاوية واستخدام مقص الربيع لخفض حول حوف القرنية، حتى يتم قطع ما يقرب من نصف محيط حوف القرنية.
  6. عقد مقلة العين مع غرامة 45 س ملقط الزاوية وتقديم مقلة العين في برنامج تلفزيوني. مع الزوج الثاني من غرامة 45 س ملقط الزاوية المسيل للدموع القرنية والصلبة على حدة. والعدسة والشبكية يخرج طntact.
  7. فصل العدسة والشبكية. جمع شبكية العين ونقل إلى أنبوب اختبار 5.4 مل البوليسترين تحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+.

4. إعداد تعليق خلية واحدة

  1. إعداد تعليق خلية واحدة باستخدام طقم تفكك الأنسجة العصبية مع تعديلات طفيفة لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، شبكية العين يسحن من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 وإجراء عملية الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية دون أن تهتز.

5. تلطيخ تعليق خلية واحدة لتحليل تدفق Cytometric

  1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة مع الزلال 0.2٪ المصل البقري (BSA) وبنسبة 0.09٪ أزيد الصوديوم) ونقل إلى لوحة U-أسفل 96-جيدا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم الضارة على البشر والبيئة. استخدام المناسب معدات الحماية الشخصية لالثانية التخلص من النفايات من وفقا للوائح المحلية.
  2. عكس لوحة أكثر من بالوعة إلى تجاهل طاف. لمنع مستقبلات اف سي، وخلايا resuspend في 25 ميكرولتر من العازلة وصمة عار تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر CD16 / CD32 الأجسام المضادة لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 25 ميكرولتر من العازلة تلطيخ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر Ly6C-APC-Cy7، و 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر Ly6G-بي-Cy7 و 2.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر CD11b-AF650. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س. عكس لوحة لتجاهل طاف. يغسل عن طريق إعادة التعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س. resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة البقعة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من يوديد propidium (PI). نقل إلى أنابيب عيار مكروي 1.2 مل.
  6. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر إضافية من العازلة تلطيخ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من PI والتجمع مع 200 ميكرولتر السابقة في1.2 مل أنابيب عيار مكروي. يتم الحصول على الحجم الكلي 300 ميكرولتر من الخلايا الملون.

6. تحليل تدفق Cytometric

  1. باستخدام الليزر ثلاثة التقليدي (البنفسجي والأزرق، والأحمر ليزر)، وتجنب PE، PerCP-Cy5.5، BV510، والأصباغ PI بسبب امتداد كبير من جسيمات AF488 الفلورية مشرق للغاية. استخدام الرابع (الصفراء) ليزر لتحسين هذا الاختبار، لأنها تسمح لالأجسام المضادة PE المسمى وPI (في القناة mCherry بدلا من قناة PerCP-Cy5.5) ليتم استخدامها (الشكل 2).
    ملاحظة: إذا كان ليزر أصفر غير متوفر، استخدام القتلى استبعاد الخلايا الصبغة في قناة أخرى.
  2. البوابة على PI خلايا السلبية (PI-) لاستبعاد الخلايا الميتة (الشكل 2B).
  3. بعد استبعاد الخلايا الميتة، بوابة على CD11b خلايا إيجابية (CD11b +)، وهذا يشمل جميع خلايا الدم النخاعي (الشكل 2C).
  4. بين السكان CD11b +، بوابة على Ly6C - / Ly6G - استبعادالعدلات (CD11b + / Ly6G +) وحيدات (CD11b + / + Ly6C؛ الشكل 2D). بعد تبوب على الخلايا الدبقية الصغيرة (هنا تعرف بأنها CD11b + / Ly6C - / Ly6G - البساطة)، وينبغي أن يكون اثنين من السكان واضحا وضوحا. واحد سلبي وإيجابي للجسيمات fluorescently المسمى. واتخذت الخلايا البلعمية تصل الجزيئات، وبالتالي فهي AF488 + (الشكل 2E).
    ملاحظة: Ly6C إيجابية أو Ly6G السكان الإيجابي الذي يمكن أيضا تحليل لقياس امتصاص الجسيمات باستخدام هذا النهج تلطيخ. النسبة المئوية للأكلة CD11b + الخلايا يرتبط بشكل جيد مع نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (الشكل 2F). للباحثين من دون خبرة التدفق الخلوي، تحليلا أكثر بساطة مع تلطيخ CD11b وحدها لا يمكن أن يؤديها، وإن كان هذا سيشمل العدلات وحيدات البلعمية، وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. وفي هذا CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ sup> في السكان، وهذه الخلايا هي> 99٪ الخلايا الدبقية الصغيرة كما تقرره تلطيخ مع علامات F4 / 80 و CX3CR1. هذه العلامات يمكن إضافة ولكن ليست ضرورية في أيدينا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا تصف طريقة لبسرعة وبشكل موثوق تحديد عدد الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين البلعمية في إعداد الفسيولوجية باستخدام تحليل تدفق cytometric (الشكل 2). ويمكن تكييف هذه الطريقة لاختبار تأثير المركبات و / أو التلاعب الجيني على القدرة أكلة ل الخلايا الدبقية الصغيرة (أرقام 3A، 3B). ويمكن أن تستخدم أيضا في الشباب (10-20 أيام بعد الولادة) أو فئران بالغة (الشكل 3C). كانت تدار جرعات متفاوتة من lipopolysaccharide في (LPS) البريتونى. 24 ساعة بعد التحدي LPS، تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لتقييم الشبكية وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة (الشكل 3A). جرعة من 1.42 ملغ / كغ من LPS يسببها زيادة ذات دلالة إحصائية في نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة بالمقارنة مع السيطرة على السيارة (الشكل 3B)، كما هو متوقع 26.

-page = "1"> شكل 1
القسم الشبكية الممثل الإعداد حقن Intravitreal وتظهر الجسيمات Fluorescently المسمى في طبقات الشبكية: الشكل 1. يتم وضع (A) حزمة هلام تحت المجهر تشريح. (ب) وعقد القوارض كما هو مبين لوضع العين لحقن intravitreal. (C) بعد ثلاث ساعات ويمكن رؤية حقن جزيئات fluorescently المسمى طبقات في معظم أنحاء الشبكية. (D استخدمت الفئران E) CX3CR1 GFP / GFP والجزيئات المسمى مع fluorophore الأحمر لتصور امتصاص الجسيمات عن طريق الخلايا الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة في أعمق (D) وسطحية طبقات (E) يستغرق الجسيمات. أشرطة النطاق - 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: استراتيجية المحاصرة إلى تحديد أكلة الدبقية الصغيرة (A) ويتم تحليل الخلايا تعليق واحد من أنسجة الشبكية من الماوس P10 (ب) بعد استبعاد الخلايا الميتة (PI +)، ويتم اختيار (C) CD11b خلايا + (D) ل.. حدد فقط عن الخلايا الدبقية الصغيرة، يتم استبعاد CD11b + العدلات (Ly6G +) وحيدات (Ly6C +). (E) الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة سيكون قد تناول جزيئات fluorescently المسمى. (F) عدد من أكلة CD11b + خلايا مماثلة لتلك التي من الخلايا الدبقية الصغيرة (CD11b + Ly6G - Ly6C -). ن = 9، مجمعة من ثلاث تجارب مستقلة؛ تمثل أشرطة الخطأ يعني ± SEM.r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة أكلة يمكن المقررة بعد LPS التحدي وفي الجراء والفئران الكبار (A) الفئران الشباب (P10) وتحدى مع LPS الغشاء البريتوني بجرعات متفاوتة، 24 ساعة قبل تقييم البلعمة (ب) التحدي مع 1.42 ملغ /. أدى كغ في حدوث زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين أكلة بالمقارنة مع الضوابط مركبة (ع = 0.0021). (C) هذا البروتوكول يمكن استخدامها لقياس الشبكية وظيفة البلعمة دبقية في الجرو والكبار الفئران على حد سواء. هناك نسبة أقل بكثير من الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية في فئران بالغة بالمقارنة مع الشباب (P10) الفئران (ع = 0.019) لا تحدى مع LPS. ن = 9 -12، مجمعة من ثلاث إلى أربعتجربة مستقلة؛ أشرطة الخطأ تمثل يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا الأسلوب: (1) حقن intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى. (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية. و (3) تحليل تدفق cytometric. من المستحسن أن الباحثين ممارسة حقن intravitreal قبل أداء طريقة يمكننا في هذا المقام. الفئران البيضاء (على سبيل المثال، BALB / ج)، وإيجاد حل اللون (على سبيل المثال، جزيئات fluorescently المسمى) يمكن استخدامها لرؤية سهلة للإبرة وحل حقن. حقن Intravitreal تشكل تحديا وإذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح سوف تؤدي إلى نتائج متحيزة والمتغيرة. المشاكل الشائعة المقترنة تقنية الحقن الفقيرة ثقب العدسة و / أو تلف في الشبكية، مما قد يؤدي إلى النزيف والالتهابات. للحد من خطر الصدمة للعين، ويجب أن يكون القوارض في وضع مستقر مع حركة الرأس الحد الأدنى. اختراق مقلة العين، ينبغي إدراج الحقنة ببطء وعدم دفع بعيدة جدا لتجنب ضربالعدسة. المضاعفات الشائعة الأخرى هي الجزر من المواد حقن من العين. لتجنب هذا، يجب أن يكون الاكتئاب المكبس ببطء، وبعد الحقن، وينبغي أن يسمح للمقلة العين إلى التراجع في محجر العين، وينبغي أن تراجع الحقنة ببطء. أفضل الحقن intravitreal تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عند مستويات منخفضة، ولكن يمكن قياس فروق واضحة بين المجموعات غير المعالجة والمعالجة. ومن الضروري أن الضوابط المناسبة (على سبيل المثال، الفئران غير تحدى) وتستخدم في كل تجربة لتحديد مستويات أكلة أساسية. جانب آخر من هذا الأسلوب الذي يتطلب ممارسة هو تشريح في شبكية العين. لضمان الاستعدادات خلية واحدة قابلة للمقارنة عبر العينات، أنسجة الشبكية يجب جمع بسرعة وبأقل قدر من الانقطاع الأنسجة ممكن. تنفيذ الخطوات الأخيرة من تشريح في برنامج تلفزيوني (انظر 3،4-3،7) وتسهيل جمع. وأخيرا، من المهم للتحضير الأنسجة الشبكية لالتدفق الخلوي بشكل صحيح. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة upregulate التيسيرقد تحدث مستقبلات وملزمة لجزء التيسير من الأجسام المضادة وبالتالي انوعي 7. يجب إجراء كتلة التيسير لمنع تلطيخ غير محددة. اختيار fluorophores والتعويض انشاء المناسبة مهم 27 أيضا.

نحن نستخدم بشكل روتيني الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 10 إلى 20 يوما بعد الولادة لهذه التجارب. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم وظيفة البلعمة دبقية في فئران بالغة (الشكل 3C). من المذكرة، بسبب وجود الأوعية الدموية الجسم الزجاجي، والسكان من خلايا الدم النخاعي الخارجية (Ly6C + أو Ly6G +) هي أكثر وضوحا في الفئران الشباب (حوالي 40 - 50٪ من جميع الخلايا + CD11b) منه عند البالغين (ما يقرب من 5٪ من جميع CD11b + الخلايا). يجب على الباحثين تحديد سن الأنسب لتجاربهم. بروتوكول المعروضة هنا يسمح للكشف قوية من مستويات الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية في شبكية العين. ومع ذلك، فإننا نوصي بأن 03:57 البيولوجيةآل مكررات أن تستخدم في كل تجربة ويتم تنفيذ ذلك تجارب مستقلة ثلاثة على الأقل. بينما الجزيئات المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم التحقق من صحتها لفحوصات أكلة 21-23، إذا مطلوب التحقق من صحة إضافية، يمكن أن يقوم المناعى شارك في توطين الجزيئات مع علامات أكلة معينة.

واحد الحد المحتمل لهذا الأسلوب هو وصول فرق من الخلايا الدبقية الصغيرة للجسيمات. في شبكية العين العادية، الخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة في طبقتين، طبقة أعمق ضفيري الخارجي، وأكثر سطحية طبقة ضفيري الداخلية، والتي هي أقرب إلى الزجاجي 7. على التحفيز، أو أثناء الشيخوخة، والخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تهاجر في جميع طبقات الشبكية. في هذه الطريقة، يتم حقن جزيئات fluorescently المسمى في الجسم الزجاجي. ثلاث ساعات بعد الحقن وهذا يؤدي إلى تراكم الجسيمات في جميع أنحاء الشبكية وخاصة على طول سطح الزجاجية. قد الباحثون زيادة الاستخدام الأمثل للconcentratiعلى جزيئات أو الوقت بعد الحقن لتجاربهم. ومن المرجح أن الخلايا الدبقية الصغيرة في أقرب القرب من الجسم الزجاجي وسوف يكون من الأسهل الوصول إلى الجسيمات. ومع ذلك، وتبين لنا أن الجزيئات المنتشرة في جميع أنحاء الشبكية وتؤخذ من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في جميع طبقات ولكن ليس في خلايا الشبكية الظهارة الصباغية (RPE)، وربما يرجع ذلك إلى محدودية فرص حبة (الشكل 1C-E). لا يزال يتعين علينا تحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة تحت الشبكية (التي يمكن أن تتراكم مع تقدم العمر) من شأنه الوصول إلى الجسيمات. إذا كان هذا هو المهم للباحث، لا يمكن أن يقوم هذا البروتوكول بعد الحقن تحت الشبكية الدقيق للجزيئات. اعتبار آخر مهم هو أنه قد يكون هناك سلوكيات مختلفة بطبيعتها بين الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين والخلايا الدبقية الصغيرة في مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. ومن المعروف أن مناطق محددة في الدماغ لديهم حساسيات مختلفة لهذا المرض. على سبيل المثال، في مرض باركنسون، والخلايا العصبية في المادة السوداء تتأثر في الغالب، بينما في ألذمرض HEIMER، فإن الخلايا العصبية قرن آمون تتأثر في الغالب 28. وبالتالي، عند دراسة علم الأمراض من مرض معين، من المرجح أن تكون عاملا مهما منطقة في الدماغ. يمكن أن يؤديها بروتوكول مماثلة لتلك الموصوفة هنا بعد الحقن داخل الجمجمة لاستكشاف الاختلافات المحتملة في استجابة أكلة بين الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين والدماغ. الشبكية لديها العديد من القواسم المشتركة مع مناطق أخرى من الدماغ، بما في ذلك وجود الدم في الشبكية حاجز 20. الخلايا الدبقية الصغيرة شبكية العين والخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ تنبع من نفس الأسلاف صفار الكيس وتظهر مشابهة جدا فيما يتعلق التشكل وسطح الخلية علامة التعبير 7،29. وعلاوة على ذلك، العديد من الأمراض في الدماغ (مثل مرض الزهايمر والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد) لديها مظاهر العين، مشيرا إلى أن شبكية العين يتأثر 20 أيضا. في حين الباحثين ينبغي أن يكون على بينة من الاختلافات الإقليمية المحتملة، ونحن نعتقد أن هذا هو النموذج المفيد للجميع البحوث الخلايا الدبقية الصغيرة، وتشير إلى أن كل علماء الأعصاب دراسة البلعمة دبقية يمكن استخدام هذا البروتوكول.

وهناك ميزة واضحة لأداء هذا الاختبار في العين هي أن تقنيات متعددة تم وضعها للحث الضغوط العصبية المتنوعة في شبكية العين، ويمكن رصد استجابات التوتر في الجسم الحي وكميا باستخدام بروتوكولات موحدة 30. عن طريق إحداث الإجهاد العصبية ومن ثم إجراء فحص وصفها هنا، يمكن للباحثين تحليل وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة عبر طيف واسع من الشتائم التي تختلف في شدتها. وأخيرا، عندما جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي تقنيات الفرز، وهذا البروتوكول لديه ميزة على المناعية التي قد تسمح لتحليل متعمق من الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (على سبيل المثال، QPCR، لزراعة الخلايا، البروتينات).

وقد سبق أن استخدمت امتصاص الجزيئات لقياس وظيفة أكلة، سواء في في المختبر وأنظمة الجسم الحي. ولاتشارك tter الحقن داخل الجمجمة من الجسيمات والحصاد وتجميد أنسجة المخ، cryosectioning، المناعية، والتصوير، وتحليل ما بعد التصوير (18). بروتوكول المقدمة هنا يسمح لتقدير أسرع بكثير من الشبكية وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة. لديها ميزة على في المختبر الأنظمة التي لا يتم إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة حساسة للغاية من المكروية، والسماح لتقييم وظيفة أكلة في سياق الفسيولوجية. على وجه التحديد، ينبغي أن تمكين اختبار مدى وجود عيوب في أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، الاجتثاث الوراثي للجينات في الخلايا العصبية) يؤثر على الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة البلعمة. كما أن لديها ميزة على سابقة في المقايسات فيفو أنه يستخدم التدفق الخلوي، مما يسمح للكشف السريع والكمي، ودقيق للسكان الخلية البلعمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 116، البلعمة، الخلايا الدبقية الصغيرة، بلعم، شبكية العين،
تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murinello, S., Moreno, S. K.,… More

Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter