Summary
phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא להעריך במדויק ולכמת ב phagocytosis microglial vivo. Microglia הם מקרופאגים תושב רקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם לבצע מגוון של פונקציות כדי להבטיח תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות. אלה כוללים מעקב חיסוני, הפרשת גורמי neurotrophic ו, בעל חשיבות מרכזית, phagocytosis 1. Phagocytosis microglial הוא מפתח בכמה אירועים חשובים במהלך ההתפתחות של מוח הרשתית, כגון phagocytosis של סינפסות רלוונטי (גיזום סינפטי) והסרה של נוירונים אפופטוטיים 2-4. יתר על כן, phagocytosis microglial של נוירונים פגומים או אפופטוטיים, פסולת הסלולר, חיידקים פולשים הוכח להיות חיוני לשמירה על הומאוסטזיס CNS לבגרות 5. לבסוף, phagocytosis microglial היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר וגיל הקשורותניוון מקולרי, שם הוצע כי קיבולת phagocytic פגום או לא מספיק עלולים לתרום הצטברות של עמילואיד-β (Aβ) כרזות דרוזן, בהתאמה 6,7.
פונקצית microglial מוסדרת בחוזקה על ידי microenvironment שלהם, בעיקר על ידי גורמים מסיסים כגון β גורם-צמיחת גידול או תאי תאי אינטראקציות. נוירונים constitutively להביע כמה הליגנדים פני התא, כגון CD200 ו CX3CL1, תוך microglia בלעדי להביע את הקולטנים המתאימים CD200R ו CX3CR1. קולטנים אלה מכילים מוטיבי העיכוב מבוסס טירוזין immunoreceptor (ITIMs) בחלק תאיים שלהם. אלה מעכבים קולטניים הם קריטיים למניעת גירוי היתר של microglia, אשר יכול לתרום neuroinflammation. לכן, בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, תאים תאים אינטראקציות בין נוירונים microglia לשמור microglia במצב שקט. במהלך פגיעה ברקמות, לעומת זאת, הנוירונים יכול למטה להסדיר expression של ליגנדים אלה, הסרת ההשפעה המעכבת שלהם על הפעלת שריר כלשהו. פונקצית microglial (כולל phagocytosis) ובכך היא קשורה קשר הדוק microenvironment שלהם 8. אף על פי כן, עד כה, אין מבחנים סטנדרטיים ללמוד phagocytosis microglia בהקשר פיסיולוגי או באופן מלא משכפל microenvironment שלהן במערכת העצבים המרכזי.
מבחני כמה פותחו כדי למדוד את פעילות phagocytic של microglia במבחנה, שבו microglia ראשוני או שורות תאים microglia מתורבתים עם תאים היעד (למשל, הנוירונים אפופטוטיים) או חרוזים שכותרתו fluorescently. ספיגת יעד נבחנת מכן באמצעות מיקרוסקופ הדמיה ניאון או cytometry זרימה 9-12. מבחנים אלה מאפשרים בדיקה של כמה מניפולציה תרופתית או גנטית עשויה להשפיע phagocytosis microglial, ובעוד אינפורמטיבי, לא מצליח לשחזר את המורכבות באופן מלא בסביבת vivo. שיטות עקיפות לבחינת phagocytosis microglialin vivo דווח: הם השיגו אלה על ידי מכתים של מולקולות חשבו להיות מעורבים phagocytosis (למשל, CD68), בהערכת קרבה פיזית של המיקרוגליה מטרות עבור phagocytosis (למשל, הנוירונים נפגעים או אלמנטים הסינפטי), או על ידי זיהוי immunohistochemical של phagocytic מטרות בתוך תאי microglial (למשל, Aβ) 13-17. שני מחקרים השתמשו בגישות ישירות יותר להעריך phagocytosis microglia in vivo. יוז ועמיתיו השתמשו בטכניקות הדמיה כדי למדוד ספיגת microglial של חרוזים שיועברו דרך המסלול תוך גולגולתי 18. סיירה et al. פיתח שיטה מעודן להעריך microglia phagocytosis של תאים אפופטוטיים כמותית תוך שימוש בטכניקות הדמיה מורכבות 4. עם זאת, שיטות אלה כרוכים פרוטוקולים מסובכים עבור הכנת רקמה, חתך, הדמיה, וניתוח. השתמשנו בעבר ניתוח תזרים cytometric להעריך phagocytosis של קולטי האור החוצהמגזרים אה באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) התאים בתרבית 19. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעריך ספיגת במהירות של fluorescently חלקיקים שכותרתו ידי microglia הרשתית כמו מדד כמותי של phagocytosis microglia in vivo.
הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידה אמינה וכמותית של phagocytosis microglial רשתית בתוך פחות משש שעות בשלושה שלבים קריטיים: (1) משלוח intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently, (2) קציר והכנת רקמת רשתית, ו (3) זרימה ניתוח cytometric. השיטה שפתחנו היא שיטה חזקה כדי להעריך phagocytosis microglial ברשתית, והוא יכול לשמש בהצלחה לבחון כיצד תרכובות שונות או מניפולציה גנטית לשנות את תפקוד microglial מפתח זאת בהגדרות פיסיולוגיות. כתוצאה אזור מיוחד של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית היא מערכת מודל נגישים בקלות ללמוד microglia פונקציה 20. אמנם שיטה זו פותחה ב tהוא עין, אנחנו מאמינים שזה יכול להיות שימושי עבור כל מדעני מוח חוקרת פונקצית phagocytic microglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות טופלו בהתאם להנחיות האתיות הוקמו על ידי מכון המחקר סקריפס.
1. הכנת חומרים להזרקה
- לעקר 33 G מחט מזרק: לפרק חיטוי ב 115 ο ג כן מחטים להזרקה על ידי עולה בופר פוספט סטרילית (PBS).
- להפשיר חלקיקים שכותרתו fluorescently בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות. הכן פתרון החלקיקים להזרקה ידי reconstituting לפתרון 50 מ"ג / מ"ל ב PBS סטרילי עם Ca 2 + / Mg 2+.
הערה: AF488 שכותרתו לחלקיקים מן פטרייתי כי אומתו על מבחני phagocytosis משמשים בפרוטוקול זה 21-23. לספיגה אופטימלית, להכין חלקיקים טריים מיד לפני ההזרקה.
הערה 2: ריכוזי חלקיקים עשויים להיות מותאמים עבור כל ניסוי ספציפי.
2. הזרקת intravitreal של פתרון חרוז
הערה: שני people נדרש לבצע את הזריקה, בצורה כזאת שהאדם בביצוע ההזרקה יכול להחזיק את העכבר ולשמור את הפוקוס על גלגל העין, בעוד האדם האחר עובר את המזרק הטעון ודוחף את הבוכנה.
- לטשטש את המכרסם בזריקה intraperitoneal של 100 מ"ג / מ"ל קטמין ו xylazine 10 מ"ג / מ"ל במינון של 20 μl / 10 גרם של משקל גוף. לפני הזריקה, להשתמש קמצוץ הבוהן כדי להעריך את רמת הרדמה.
הערה: Isoflurane יש השפעה עמוקה על תפקוד התאים מיאלואידית, ובכך, השימוש בו לאורך assay זה יש להימנע 24,25. - מחט טען 0.5 μl של פתרון חלקיקים שכותרתו fluorescently.
- הנח את העכבר הצידה תחת מיקרוסקופ כירורגי (איור 1A-B). השתמש חומר רך, למשל, חפיסת ג'ל, עבור מיקום טוב יותר של העכבר. עבור עכברים צעירים בה העיניים עדיין לא פתוחות, בעדינות לפתוח את העפעפיים בעזרת 45 בסדר o מלקחיים זוויתי ידי יצירת fissuמחדש לאורך החריץ שממנו העפעפיים יהיה בסופו של דבר פתוח.
- בעזרת מלקחיים 45 o זוויתי בסדר להפעיל לחץ בזהירות סביב העפעף, כך גלגל העין קופצת מעט מתוך השקע. להחזיק את הראש עם שתי אצבעות בדיוק מעל האוזן ועל ידי הלסת שלו בעדינות למתוח את העור במקביל העפעפיים כדי לשמור על העין מעט מתוך השקע. היזהר שלא לתפוס קרוב מדי אל הגרון (איור 1B).
- כדי לנקב את גלגל העין, הכנס המחט של המזרק ב לימבוס הקרנית (שבו הקרנית בלובן העין להתחבר). זה גלוי כעיגול אפור בעכברים פיגמנט. לחזור בו את המחט מעט לגרש נפח קטן של נוזל זגוגי ואז מזריקים. האדם בביצוע ההזרקה צריך להחזיק את העכבר בעדינות ביד אחת ואת המחט עם אחרים; האדם השני צריך לדחוף את הבוכנה לאט.
- לחזור בו מזרק לאט. החל עיניים לחות טיפות כדי לשמור על העין hydrated. </ Li>
- תנו מכרסם להתאושש בכלוב על כרית חום ולהמשיך לפקח החיה. אם עובד עם גורים, לא להחזיר את בעל החיים לכלוב עם חיות התראה אחרות עד שהוא נושם ומסוגל תנועה ספונטנית. אם עובד עם מבוגרים, לא מחזיר את המכרסם לכלוב עם חיות התראה אחרות, עד שהיא חוזרת recumbence sternal.
3. קציר רקמת הרשתית
הערה: רקמת הרשתית מעיניים לא הזריקו חלקיקים שכותרתו fluorescently יש לאסוף כביקורת על ניתוח תזרים cytometric. למרות assay יכול להתבצע באמצעות רשתית יחידה, עבור ביצועים הטובים ביותר, שתי רשתיות צריכות להיות ונקווה יחד.
- אסוף hr 3 רקמת הרשתית לאחר ההזרקה intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently.
הערה: בעוד זמן לאחר ההזרקה של הפתרון חלקיק יכול להיות מותאם עבור כל ניסוי ספציפי, מצאנו כי 3 שעות לאחר ההזרקה, ספיגת החלקיקים ניתן היה לראות לאורך רוב שכבות of הרשתית (איור 1 ג-ד). - הקורבן עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם.
- אסוף את העיניים על ידי לחיצה עדינה על העפעף בעזרת מלקחיים בסדר 45 o הקטומה proptose גלגל העין. מקם את המלקחיים מאחורי גלגל העין ולמשוך.
- לנתח את הרשתית תחת מיקרוסקופ לנתח. מעביר את גלגל העין כדי בצלחת פטרי המכילה כמות קטנה של PBS עם Ca 2 + / Mg 2+. באזור יבש של צלחת פטרי, לחורר את גלגל העין בבית לימבוס הקרני עם קצה המלקחיים איכותיים מאוד.
- החזק את גלגל העין בעזרת בסדר 45 o מלקחיים זוויתי ולהשתמש מספרי האביב לחתוך סביב לימבוס הקרני, עד כמחצית מן ההיקף לימבוס קרנית נחתכה.
- החזק את גלגל העין עם קנס 45 o מלקחיים זוויתי ולהביא את גלגל העין לתוך PBS. עם זוג נוסף של קנס 45 o מלקחיים זוויתי לקרוע את הקרנית ואת בלובן העין בנפרד. העדשה ואת הרשתית ייצאה intact.
- הפרד את העדשה לרשתית. אסוף הרשתית ולהעביר מבחנה קלקר 5.4 מ"ל המכיל 2 מ"ל של PBS עם Ca 2 + / Mg 2+.
4. הכנת תרחיף תא בודד
- כן השעיות תא בודדים באמצעות ערכת דיסוציאציה רקמה עצבית עם שינויים קלים בצורה להוראות היצרן. בקצרה, הרשתיות triturate ידי pipetting מעלה ומטה עם טפטפת P1000 וביצוע עיכול אנזימטי ב 37 o C בלי לרעוד.
5. השעיות תא בודדות מכתימות עבור ניתוח התזרים Cytometric
- תאים Resuspend ב 200 μl של חיץ מכתים (פוספט שנאגרו מלוחים של Dulbecco עם אלבומין 0.2% שור (BSA) ו אזיד הנתרן 0.09%) ו ומעבירים לצלחת U-התחתון 96-היטב. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x.
הערה: אזיד הנתרן הוא מזיק לאדם ולסביבה. השתמש בציוד מגן אישי מתאיםnd להשליך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות. - הפוך את הצלחת מעל הכיור כדי להשליך supernatant. כדי לחסום קולטני Fc, תאים resuspend ב 25 μl של חיץ כתם המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 לכל טוב. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 25 μl של חיץ מכתים המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי עכבר Ly6C-APC-Cy7, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי עכבר Ly6G-PE-Cy7 ו -2.5 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי עכבר CD11b-AF650. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x. הפוך את הצלחת להשליך supernatant. שטפו ידי resuspending התאים 200 μl של חיץ מכתים.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x. Resuspend ב 200 μl של חיץ כתם המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל של יודיד propidium (PI). העברת צינורות microtiter 1.2 מיליליטר.
- לשטוף בארות עם חיץ 100 μl של מכתים נוסף המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל של PI ובריכה עם 200 μl הקודם1.2 מ"ל צינורות microtiter. בהיקף כולל של 300 μl של תאים מוכתמים מתקבל.
6. ניתוח תזרים Cytometric
- באמצעות ליזר שלוש קונבנציונלי (סגול, כחול, ליזר אדום), להימנע PE, PerCP-Cy5.5, BV510, ו PI צבע בשל זליגה משמעותית מן AF488-חלקיקי ניאון בהירים מאוד. השתמש לייזר הרביעי (צהוב) כדי לייעל assay זה, שכן היא מאפשרת עבור נוגדנים PE שכותרתו PI (בערוץ mCherry במקום ערוץ PerCP-Cy5.5) לשמש (איור 2).
הערה: אם ליזר צהוב אינו זמין, להשתמש לצבוע הדרת תאים מתה באפיק אחר. - שער על PI תאים שליליים (נרדף למלק) להוציא תאים מתים (איור 2 ב).
- לאחר הוצאת תאים מתים, שער על תאים חיוביים CD11b (CD11b +), זה יכלול את כל תאי מיאלואידית (איור 2 ג).
- בתוך האוכלוסייה + CD11b, השער על Ly6C - / Ly6G - למעטנויטרופילים (CD11b + / Ly6G +) ומונוציטים (CD11b + / Ly6C +; איור 2 ד). לאחר gating על microglia (כאן המוגדרים CD11b + / Ly6C - / Ly6G - לפשטות), שתי אוכלוסיות ברורות צריכות להיות גלויות; אחד שלילי ואחד חיובי עבור החלקיקים שכותרתו fluorescently. תאי Phagocytic יינקטו חלקיקים ולכן הם AF488 + (איור 2E).
הערה: Ly6C החיובי או Ly6G אוכלוסיות חיוביות יכולה גם להיות מנותחת למדוד ספיגת חלקיקים באמצעות גישה מכתימה זה. אחוז phagocytic CD11b + תאים וקושרת היטב עם אחוז microglia phagocytic (איור 2F). לחוקרים ללא ניסיון cytometry זרימה, ניתוח פשוט עם מכתים CD11b לבד יכול להתבצע, אם כי זה יכלול נויטרופילים ומונוציטים phagocytic, כמו גם שריר כלשהו. בתוך זה CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> אוכלוסייה, תאים אלה הם> microglia 99% כמו להישפט על ידי צביעה עם הסמנים F4 / 80 ו CX3CR1; סמנים אלה ניתן להוסיף אך הן אינן הכרחיות בידינו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מתארים שיטה במהירות ובאמינות לכמת את מספר microglia רשתית phagocytic בסביבה פיזיולוגית באמצעות ניתוח התזרים cytometric (איור 2). שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות ו / או מניפולציה גנטית על קיבולת phagocytic של microglia (איורים 3A, 3B). זה יכול לשמש גם צעיר (10 - 20 ימים לאחר לידה) או עכברים בוגרים (איור 3 ג). מינונים משתנים של lipopolysaccharide (LPS) נוהלו intraperitoneally. 24 שעות לאחר אתגר LPS, פרוטוקול המתואר כאן שימש להערכת תפקוד phagocytic microglia הרשתית (איור 3 א). מינון של 1.42 מ"ג / ק"ג של LPS גרם לעלייה משמעותית סטטיסטית באחוז microglia phagocytic בהשוואה שליטה ברכב (איור 3 ב), כפי שניתן היה לצפות 26.
-page = "1"> 
איור 1: הגדרת הזרקת intravitreal ונציג רשתית סעיף מראה חלקיקים שכותרתו fluorescently שכבות הרשתית. (א) חבילת ג'ל ממוצבת תחת מיקרוסקופ לנתיחה. (ב) מכרסם מוחזק כמוצג למקם את העין להזרקה intravitreal. (C) שלוש שעות אחרי חלקיקים שכותרתו הזרקת fluorescently ניתן לראות ברחבי שכבות הרשתית ביותר. (D CX3CR1, E) עכברים וחלקיקים GFP / GFP שכותרתו עם fluorophore אדום שימשו כדי להמחיש ספיגת החלקיקים ידי microglia. Microglia ב העמוק יותר (D) ושטחיות (E) שכבות תופסות חלקיקים. ברי סולם -. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אסטרטגיה Gating לבחור Phagocytic Microglia (א) השעיות תאים בודדים מתוך רקמת הרשתית מן העכבר P10 מנותחים (B) לאחר הוצאת תאים מתים (+ PI), (ג) CD11b + תאים נבחרים (ד) כדי... לבחור רק עבור microglia, CD11b + נויטרופילים (Ly6G +) ומונוציטים (Ly6C +) מודרים. (E) microglia phagocytic יינקט חלקיקים שכותרתו fluorescently. (F) מספר תאים phagocytic CD11b + דומה לזה של microglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, ונקווה משלושה ניסויים עצמאיים; ברי שגיאה מייצגים ממוצעים ± SEM.r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. פונקציה Microglia Phagocytic ניתן להעריך אחרי LPS אתגר וב Pups עכברים בוגרים (א) עכברים צעירים (P10) היו תיגר עם LPS intraperitoneal במינונים משתנים, 24 שעות לפני בהערכת phagocytosis (B) אתגר עם 1.42 מ"ג /. קילו הניב אחוז עלייה משמעותי microglia רשתית phagocytic כאשר בהשוואה לקבוצת ביקורת רכב (p = 0.0021). (ג) פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את תפקוד phagocytic microglial רשתית בעכברי גור ומבוגרים כאחד. ישנו אחוז קטן יותר באופן משמעותי של microglia phagocytic בעכברים בוגרים בהשוואה צעירים (P10) עכברים (p = 0.019) לא תיגר עם LPS. n = 9 -12, ונקווה משלושה לארבעהניסוי עצמאי; ברי שגיאה מייצגים ממוצעים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם שלושה שלבים קריטיים בשיטה זו: (1) הזרקת intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently; (2) קציר והכנת רקמת הרשתית; ו (3) ניתוח תזרים cytometric. אנו ממליצים החוקרים לתרגל זריקות intravitreal קודם לביצוע השיטה שאנו מציגים כאן. עכברים לבקנים (למשל, BALB / ג) ופתרון בצבע (למשל, חלקיקים שכותרתו fluorescently) יכולים לשמש ראיה קלה של מחט פתרון מוזרק. זריקות intravitreal הם מאתגר ואם לא מבוצעים כהלכה, תבאנה לתוצאות מוטות ומשתנות. בעיות נפוצות הקשורות טכניקת הזרקה עניה הן ניקוב של העדשה ו / או ניזק לרשתית, אשר עלול לגרום לדימום ודלקת. כדי למזער את הסיכון של טראומה לעין, המכרסם צריך להיות בעמדה יציבה עם תנועת הראש מינימלית. כדי לחדור את גלגל העין, את המזרק צריך להיות מוכנס לאט ולא דחף רחוק מדי כדי להימנע מפגיעההעדשה. סיבוך נפוץ נוסף הוא ריפלוקס של החומר המוזרק מחוץ לעין. כדי למנוע זאת, הבוכנה צריכה להיות בדיכאון לאט, לאחר הזרקה, גלגל העין צריכה להיות מותר לחזור לתוך ארובת העין ואת המזרק צריך להיות חזר בו לאט. זריקות intravitreal הטובות ביותר להפעיל microglia ברמות נמוכות, אך הבדלים ברורים בין קבוצות מטופלות ומטופל ניתן למדוד. זה חיוני כי בקרות מתאימות (למשל, עכברים שאינם מאותגרים) משמשות כל ניסוי כדי לקבוע רמות phagocytic בסיס. היבט נוסף של שיטה זו הדורשת תרגול הוא לנתיחה רשתית. כדי להבטיח הכנות תא בודד דומות על פני דגימות, רקמת רשתית יש לאסוף במהירות ותוך הפרעת רקמה מינימאלית אפשרית. ביצוע הצעדים האחרונים של דיסקציה ב PBS (ראה 3.4 - 3.7) יקל אוסף. לבסוף, חשוב להכין את רקמת הרשתית עבור cytometry זרימה נכונה. הופעל microglia upregulate Fcקולטנים ובכך ספציפי מחייב את החלק של נוגדני Fc עלול להתרחש 7. בלוק Fc חייב להתבצע כדי למנוע מכתים ספציפי. מבחר fluorophores המתאים ופיצוי להגדיר חשוב גם 27.
אנו משתמשים באופן שגרתי עכברים בגילאי 10 עד 20 ימים לאחר הלידה לניסויים אלה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להעריך תפקוד phagocytic microglial בעכברים בוגרים (איור 3 ג). מן ראוי לציין כי, בשל נוכחות של כלי הדם hyaloid, אוכלוסיות של תאי מיאלואידית אקסוגניים (Ly6C + או Ly6G +) בולטות יותר עכברים צעירים (כ 40 - 50% מכלל תאי CD11b +) מאשר אצל מבוגרים (כ 5% מכלל CD11b + תאים). חוקרים צריכים לקבוע את הגיל המתאים ביותר עבור הניסויים שלהם. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר זיהוי חזק של הרמות של microglia phagocytic ברשתית. עם זאת, אנו ממליצים כי שלושה כדי ארבעה ביולוגייםאל משכפל לשמש בכל ניסוי וכי לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים בוצע. בעוד החלקיקים בשימוש בפרוטוקול זה אומתו על מבחני phagocytic 21-23, אם נדרשה אימות נוספת, immunohistochemical שיתוף לוקליזציה של חלקיקים עם סמני phagocytic מסוימים יכולה להתבצע.
מגבלה פוטנציאלית אחת של שיטה זו היא גישה דיפרנציאלית של microglia לחלקיקים. ברשתית הנורמלית, microglia מתגורר בשתי שכבות, השכבה החיצונית plexiform העמוק, ושכבת plexiform הפנימית שטחית יותר, שהוא קרוב יותר אל 7 הזגוגית. על גירוי, או במהלך ההזדקנות, microglia יכולים להעביר בכל שכבות הרשתית. בשיטה זו, חלקיקים שכותרתו fluorescently מוזרקים לתוך הזגוגית. שלוש שעות לאחר ההזרקה זה תוצאות הצטברות החלקיקים לאורך הרשתית ובמיוחד לאורך משטח vitreal. חוקרים יכולים נוספים לייעל את concentratiעל חלקיקים או זמן לאחר ההזרקה עבור הניסויים שלהם. סביר להניח כי microglia בסמיכות קרובה יותר אל הזגוגית תהיה גישה נוחה יותר חלקיקים. אף על פי כן, אנו מראים כי חלקיקי המפוזרים על פני הרשתית נתפסים על ידי microglia בכל השכבות אך לא האפיתל פיגמנט רשתית (RPE) תאים, ככל הנראה בשל גישה מוגבלת חרוז (איור 1 ג-ה). יש לנו עדיין כדי לקבוע אם microglia subretinal (אשר יכול לצבור עם הגיל) היה לקבל גישה החלקיקים. אם זה חשוב החוקר, פרוטוקול זה יכול להתבצע לאחר הזרקת subretinal הזהירה של החלקיקים. שיקול חשוב נוסף הוא כי ייתכן שיהיה התנהגויות שונות באופן אינהרנטי בין microglia רשתית microglia באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. עובדה ידועה היא כי איזורים מסויימים במוח יש רגישויות שונות למחלות. לדוגמה, אצל חולי פרקינסון, נוירונים nigra substantia מושפעים בעיקר, בעוד Alzמחלת היימר, הנוירונים בהיפוקמפוס הם בעיקר מושפעים 28. לכן, כאשר לומדים את הפתולוגיה של מחלה מסוימת, אזור במוח עשוי להיות גורם חשוב. פרוטוקול דומה לזו המתוארת כאן יכול להתבצע לאחר הזרקה תוך גולגולתי לחקור הבדלים אפשריים בין התגובה phagocytic בין microglia הרשתית והמוח. יש הרשתית רבות מאפיינים משותפים עם אזורים אחרים של המוח, וכן הנוכחות של דם-רשתית-מחסום 20. Microglia רשתית microglia המוח מקורם אבות באותו חלמון-צק ומופיעים מאוד דומה לזה הנוגע ביטוי סמן מורפולוגיה פני קרום תא 7,29. יתרה מזו, מספר מחלות מוח (למשל, מחלת אלצהיימר, שבץ, וטרשת נפוצה) יש גילויי עינית, המציין כי הרשתית היא השפיעה גם על 20. למרות שחוקרים צריכים להיות מודעים הבדלים אזוריים הפוטנציאל, אנו מאמינים כי זהו מודל אינפורמטיביכל מחקר microglia, ולהציע שכל מדעני המוח לומד phagocytosis microglial יכול להשתמש בפרוטוקול זה.
יתרון בולט ביצוע assay זה בעין הוא כי מספר רב של טכניקות פותחו כדי לגרום מדגיש נוירוגנית מגוון ברשתית, ואת תגובות הדחק ניתן לנטר in vivo לכמת באמצעות 30 פרוטוקולים סטנדרטיים. גרימת מתח נוירוגנית ולאחר מכן ביצוע assay המתואר כאן, חוקרים יכולים לנתח פונקצית microglia על פני קשת רחבה של עלבונות המשתנים בחומרתם. לבסוף, כאשר הוא משולב עם זרימת cytometry טכניקות מיון, פרוטוקול זה יש יתרון על פני אימונוהיסטוכימיה כי הוא עשוי לאפשר עומק בניתוח של microglia phagocytic (למשל, qPCR, תרבית תאים, פרוטאומיקה).
הספיגה של חלקיקים כבר השתמשה בעבר כדי למדוד את תפקוד phagocytic, היא במבחנה in vivo מערכות. הלוס אנג'לסtter מעורב הזרקה תוך גולגולתי של חלקיקים, קציר הקפאת רקמת המוח, cryosectioning, immunostaining, הדמיה ופוסט הדמיה ניתוח 18. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר כימות הרבה יותר מהר תפקוד phagocytic microglia הרשתית. יש לו היתרון על פני מערכות במבחנה כי microglia הרגישה מאוד לא יוסרו מן microenvironment שלהם, המאפשרת הערכה של תפקוד phagocytic בהקשר פיסיולוגי. באופן ספציפי, זה צריך לאפשר בדיקה של כמה פגמים סוגי תאים אחרים (למשל, אבלציה הגנטי של גנים בנוירונים) להשפיע על התפקוד phagocytic microglia. כמו כן, יש יתרון על פני הקודמת מבחני vivo כי היא משתמשת cytometry זרימה, המאפשר זיהוי מהיר, כמותי, ומדויק של אוכלוסיות תאים phagocytic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
