Summary
Microglial fagocytose er avgjørende for vedlikehold av vev homeostase og utilstrekkelig fagocyttfunksjon har vært innblandet i patologi. Imidlertid vurdering av mikroglia funksjon in vivo er teknisk utfordrende. Vi har utviklet en enkel men robust teknikk for nøyaktig å overvåke og kvantifisering av fagocytisk potensialet av mikroglia i et fysiologisk miljø.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å nøyaktig vurdere og kvantifisere in vivo microglial fagocytose. Microglia er vevet bosatt makrofager i sentralnervesystemet (CNS). De utfører en rekke funksjoner for å sikre vedlikehold av vev homeostase. Disse inkluderer immune overvåking, sekresjon av neurotrofiske faktorer og, avgjørende betydning, fagocytose en. Microglial fagocytose er nøkkelen i flere viktige hendelser i utviklingen av hjernen og netthinnen, som for eksempel fagocytose av irrelevante synapser (synaptiske beskjæring) og fjerning av apoptotiske nevroner 2-4. Videre har microglial fagocytose av skadede eller apoptotiske nevroner, cellerester og invaderende mikrober vist seg å være avgjørende for å opprettholde CNS homeostase gjennom voksenlivet fem. Endelig har microglial fagocytose blitt implisert i patogenesen av en rekke neurodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom og aldersrelatertmakuladegenerasjon, hvor det har vært antydet at defekte eller manglende fagocytisk kapasitet kan bidra til oppbygging av amyloid-beta (Ap) plaques og drusen, henholdsvis 6,7.
Microglial funksjon er strengt regulert av deres mikromiljø, særlig av løselige faktorer, slik som tumor-vekstfaktor β eller celle-celle interaksjoner. Nerveceller konstitutivt uttrykke flere celleoverflate ligander, for eksempel CD200 og CX3CL1, mens microglia utelukkende uttrykker de respektive reseptorer CD200R og CX3CR1. Disse reseptorene inneholder immunoreceptor tyrosin-basert hemming motiver (ITIMs) i sin intracellulær del. Disse inhibitor reseptorer er kritisk for å hindre overstimulering av mikroglia, noe som kan bidra til nevroinflammasjon. Således, under normale fysiologiske betingelser, celle-celle interaksjoner mellom nevroner og mikroglia holde mikroglia i en hviletilstand. Under vevsskade, men nevroner kan nedregulerer expression av disse ligandene, fjerning av deres hemmende virkning på mikroglia aktivering. Microglial funksjon (inkludert fagocytose) blir dermed tett knyttet til deres mikromiljøet 8. Likevel, til dags dato, er det ingen standardiserte analyser for å studere microglia fagocytose i en fysiologisk sammenheng eller på en måte som fullt gjenskaper sin CNS mikromiljøet.
Flere analyser er blitt utviklet for å måle fagocytisk aktivitet av mikroglia in vitro, hvor primær mikroglia eller microglia cellelinjer blir dyrket med målceller (f.eks apoptotiske neuroner) eller fluorescerende merkede kuler. Target opptak blir deretter vurdert ved hjelp av fluorescerende bildebehandling mikroskopi eller flowcytometri 9-12. Disse analysene tillate testing av hvordan farmakologisk eller genetisk manipulasjon kan påvirke microglial fagocytose og mens informativ, ikke klarer å full replikere komplekse in vivo miljø. Indirekte metoder for å undersøke microglial fagocytosein vivo er rapportert: disse er oppnådd ved farging av molekyler antas å være involvert i fagocytose (f.eks CD68), vurdere fysisk nærhet av microglia og mål for fagocytose (f.eks kompromittert nevroner eller synaptic elementer), eller ved immunhistokjemisk påvisning av fagocytisk mål innenfor mikrogliaceller celler (f.eks Ap) 13-17. To studier har brukt mer direkte tilnærminger for å vurdere microglia fagocytose in vivo. Hughes og kolleger har brukt bildeteknikker for å måle microglial opptak av perler som leveres via intrakranielle rute 18. Sierra et al. Utviklet en raffinert metode for å vurdere kvantitativt microglia fagocytose av apoptotiske celler ved hjelp av komplekse bildeteknikker 4. Men disse metodene involverer kompliserte protokoller for vev forberedelse, seksjonering, bildebehandling og analyse. Vi har tidligere brukt flowcytometrisk analyse for å vurdere fagocytose av fotoreseptoren uteere segmenter av netthinnens pigmentert epitel (RPE) celler i kultur 19. Her beskriver vi en protokoll for raskt å vurdere opptak av fluorescensmerkede partikler med retinal mikroglia som et kvantitativt mål på in vivo mikroglia fagocytose.
Protokollen vi beskriver her gir mulighet for pålitelig og kvantitativ måling av retinal microglial fagocytose i underkant av seks timer i tre kritiske trinn: (1) intravitreal levering av fluorescensmerket partikler, (2) høsting og utarbeidelse av retinal vev, og (3) flyt cytometri analyse. Metoden vi har utviklet er en robust metode for å vurdere microglial fagocytose i netthinnen, og det kan med hell brukes til å teste hvordan forskjellige forbindelser eller genetisk manipulasjon endre denne nøkkelen microglial funksjonen i fysiologiske innstillinger. Som et spesialisert område av CNS, er netthinnen en lett tilgjengelig modellsystem for å studere mikroglia funksjon 20. Selv om denne metoden ble utviklet i than øye, tror vi det kan være nyttig for alle nevrologer undersøker microglia fagocyttfunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene ble behandlet i henhold til de etiske retningslinjene fastsatt av Scripps Research Institute.
1. Utarbeidelse av materialer for injeksjon
- Sterilisere en 33 G nål og sprøyte: demontere og autoklav ved 115 ο C. Forbered nåler for injeksjon av stigende i steril fosfat saltvann (PBS).
- Tine fluorescensmerkede partikler ved romtemperatur i 5 - 10 min. Fremstille partikkelinjeksjonsvæske ved rekonstituering til en 50 mg / ml oppløsning i sterilt PBS med Ca2 + / Mg2 +.
MERK: AF488-merket partikler av sopp opprinnelse som er validert for fagocytose analyser er brukt i denne protokollen 21-23. For optimalt opptak, forberede partikler friskt og umiddelbart før injeksjon.
Note 2: Partikkelkonsentrasjonen kan optimaliseres for hvert enkelt eksperiment.
2. intravitreal injeksjon av Bead Solution
MERK: To people er nødvendig for å utføre injeksjonen, på en måte slik at den som utfører injeksjonen kan holde musen og opprettholde fokus på øyeeplet, mens den andre personen passerer det belastede sprøyten og skyver stempelet.
- Bedøver gnager ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg / ml ketamin og 10 mg / ml xylazin i en dose på 20 mL / 10 g kroppsvekt. Før injeksjon bruke tå klype for å vurdere nivået av anestesi.
MERK: Isofluran har en dyp effekt på myeloid celle funksjon, og dermed bruken i denne analysen bør unngås 24,25. - Load nål med 0,5 ul fluorescensmerkede partikkel løsning.
- Lå musen sidelengs under et kirurgisk mikroskop (figur 1A-B). Bruk et mykt materiale, for eksempel et gel pack, for bedre posisjonering av musen. For ung mus der øynene er ennå ikke åpne, forsiktig åpne øyelokkene med hjelp av fine 45 o vinklet pinsett ved å opprette en fissure langs sporet som øyelokkene vil etter hvert åpne.
- Med hjelp av fine 45 o vinklet pinsett forsiktig press rundt øyelokket, slik at øyeeplet spretter litt ut av stikkontakten. Hold hodet med to fingre like over øret og ved sin kjeve og forsiktig strekke huden parallelt med øyelokkene for å holde øye litt ut av stikkontakten. Vær forsiktig med å gripe for nær halsen (figur 1B).
- Å punktere øyeeplet, setter sprøyten er nålen i hornhinnen limbus (der hornhinnen og sclera koble). Dette er synlig som en grå sirkel i pigmenterte mus. Trekke nålen litt for å utvise et lite volum av glasslegemet væske og deretter injiseres. Personen som utfører injeksjon bør forsiktig holde musen med den ene hånden og nålen med den andre; den andre personen skal sakte presse stempelet.
- Trekk sprøyten sakte. Påfør øye fuktighetsgivende dråper for å holde øye hydrert. </ Li>
- La den gnager komme i et bur i løpet av en varmepute og fortsetter å overvåke dyret. Ved arbeid med unger, ikke returnerer dyret til et bur med andre varsel dyr før det er puste og i stand til spontan bevegelse. Hvis du arbeider med voksne, ikke returnerer gnager til et bur med andre varsel dyr før det gjenvinner sternal recumbence.
3. Høsting av Retinal Tissue
MERK: retinal vev fra øynene ikke injisert med fluorescensmerkede partikler skal samles som en kontroll for flowcytometrisk analyse. Selv om analysen kan utføres ved hjelp av en enkelt netthinnen, for best mulig ytelse, to netthinne bør samles sammen.
- Samle retinal vev tre timer etter intravitreal injeksjon av fluorescensmerkede partikler.
NB: Når tiden etter injeksjon av partikkel løsning kan være optimalisert for hvert enkelt eksperiment, har vi funnet at 3 timer etter injeksjon, kan partikkelopptak ses gjennom de fleste lag of netthinnen (figur 1C-D). - Sacrifice mus ved halshugging.
- Samle øyeepler ved å trykke forsiktig mot øyelokket ved hjelp av fine 45 o vinklet pinsett til proptose øyeeplet. Plasser tang bak øyeeplet og pull.
- Dissekere netthinnen under et dissekere mikroskop. Overfør øyeeplet til en petriskål inneholdende en liten mengde PBS med Ca2 + / Mg2 +. I et tørt område av petriskål, perforere øyeeplet i hornhinnen limbus med tuppen av Superfine tang.
- Hold øyeeplet ved hjelp av fine 45 o vinklet pinsett og bruke fjær saks for å klippe rundt hornhinnen limbus, inntil omtrent halvparten av det corneale limbus omkrets er kuttet.
- Hold øyeeplet med den fine 45 o vinklet pinsett og bringe øyeeplet inn i PBS. Med et andre par av fine 45 o vinklet tang rive hornhinnen og sclera fra hverandre. Linsen og netthinnen vil komme ut intact.
- Skill linsen og netthinnen. Samle netthinnen og overføre til et 5,4 ml polystyren-reagensrør inneholdende 2 ml PBS med Ca2 + / Mg2 +.
4. Forberede en enkelt cellesuspensjon
- Forbered enkeltcellesuspensjoner med en nervevev dissosiasjon kit med mindre modifikasjoner til produsentens instruksjoner. Kort, triturate netthinne ved pipettering opp og ned med en P1000 pipette og utføre en enzymatisk fordøyelse ved 37 o C uten risting.
5. Farging enkelt celle utestengelse for flowcytometrisk analyse
- Resuspender celler i 200 pl flekker buffer (Dulbeccos fosfat-bufret saltløsning med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,09% natriumazid) og overfør til et U-bunn 96-brønns plate. Sentrifuge i 5 min ved 130 x g.
MERK: Natriumazid er skadelig for mennesker og miljø. Bruk egnet personlig verneutstyr etnd kast avfall i henhold til lokale bestemmelser. - Snu platen over en vask til kast supernatanten. For å blokkere Fc-reseptorer, resuspender cellene i 25 ul av flekken buffer inneholdende 5 ug / ml av anti-mus CD16 / CD32-antistoff per brønn. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Legg 25 ul av flekker buffer inneholdende 0,5 ug / ml av anti-mus Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml anti-mus Ly6G-Pe-Cy7 og 2,5 ug / ml anti-mus CD11b-AF650. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Sentrifuge i 5 min ved 130 x g. Snu platen til kast supernatanten. Vask ved resuspendering-celler i 200 pl flekker buffer.
- Sentrifuge i 5 min ved 130 x g. Resuspender i 200 ul buffer inneholdende flekken 0,5 ug / ml propidiumjodid (PI). Overføring til 1,2 ml mikrotiterplater rør.
- Vask brønnene med ytterligere 100 ul av flekker buffer inneholdende 0,5 ug / ml PI og basseng med de foregående 200 ul i1,2 ml mikrotiter-rør. Et totalt volum på 300 ul av fargede cellene blir oppnådd.
6. flowcytometrisk analyse
- Ved hjelp av en konvensjonell tre laser (fiolett, blå og rød laser), unngå PE, PerCP-Cy5.5, BV510, og PI fargestoffer på grunn av betydelige ringvirkninger fra de ekstremt lyse fluorescerende AF488-partikler. Bruke en fjerde (gul) laser for å optimalisere denne analyse, som gjør det mulig for et PE-merkede antistoffer og PI (i mCherry kanal i stedet for den PerCP-Cy5.5 kanal) som skal benyttes (figur 2).
MERK: Hvis en gul laser ikke er tilgjengelig, kan du bruke en død celle utestenging fargestoff i en annen kanal. - Gate på PI negative celler (PI-) for å utelukke døde celler (figur 2B).
- Etter eksklusjon av døde celler, gate på CD11b positive celler (CD11b +), vil dette omfatte alle myeloide celler (Figur 2C).
- Innenfor CD11b + befolkningen, gate på Ly6C - / Ly6G - for å utelukkenøytrofile (CD11b + / Ly6G +) og monocytter (CD11b + / Ly6C +, figur 2D). Etter gating på microglia (her definert som CD11b + / Ly6C - / Ly6G - for enkelhets skyld), skal to store populasjoner være synlig; en negativ og en positiv for de fluorescerende merkede partikler. Fagocytiske celler vil ha tatt opp partikler og er derfor AF488 + (figur 2E).
MERK: Ly6C positiv eller Ly6G positive populasjoner kan også bli analysert for å måle partikkelopptak ved hjelp av denne farging tilnærming. Prosentandelen av fagocytiske CD11b + celler korrelerer godt med prosentandelen av fagocytisk mikroglia (figur 2F). For forskere uten strømningscytometri erfaring, kan en enklere analyse med CD11b farging alene skal utføres, om enn dette vil omfatte fagocyttiske neutrofiler og monocytter, samt mikroglia. Innenfor denne CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> populasjon, disse cellene er> 99% mikroglia som bedømt ved farging med markører F4 / 80 og CX3CR1; disse markørene kan legges, men er ikke nødvendig i våre hender.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en fremgangsmåte til hurtig og pålitelig måte å kvantifisere antallet fagocyterende retinal mikroglia i et fysiologisk miljø ved bruk av strømningscytometrisk analyse (Figur 2). Denne fremgangsmåten kan tilpasses for å teste effekten av forbindelser og / eller genetisk manipulasjon på den fagocytisk kapasitet mikroglia (figurene 3A, 3B). Den kan også brukes i unge (10 - 20 dager etter fødselen) eller voksen mus (figur 3C). Varierende doser av lipopolysakkarid (LPS) ble administrert intraperitonealt. 24 timer etter LPS-utfordring, ble den protokoll som er beskrevet her brukes for å vurdere retinal mikroglia fagocytisk funksjon (figur 3A). En dose på 1,42 mg / kg LPS induserte en signifikant økning i andelen av fagocytisk mikroglia når sammenlignet med vehikkel-kontroll (figur 3B), som ville være forventet 26.
Figur 1: intravitreal injeksjon Setup og representant Netthinne Seksjon viser fluorescensmerkede Partikler i netthinnens lag. (A) En gel pakke er plassert under disseksjon mikroskop. (B) En gnager holdes som vist for å posisjonere øye for intravitreal injeksjon. (C) Tre timer etter injeksjon fluorescensmerkede partikler kan sees gjennom det meste retinale lag. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP mus og partikler merket med en fluorofor rød ble brukt for å visualisere partikkel opptak av mikroglia. Mikroglia i den dypere (D) og (E) overflatiske lag ta opp partikler. Skala barer -. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gating Strategi velge fagocyterende Microglia (A) Enkeltceller suspensjoner fra retinal vev fra en p10 mus er analysert (B) Etter eksklusjon døde celler (PI +), (C) CD11b + celler er valgt (D) til... velge bare for mikroglia, CD11b + nøytrofiler (Ly6G +) og monocytter (Ly6C +) er ekskludert. (E) fagocytisk mikroglia vil ha tatt opp fluorescensmerkede partikler. (F) antallet fagocytiske CD11b + celler er lik den for mikroglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, samlet fra tre uavhengige forsøk; feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM.rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Microglia fagocyttfunksjon kan vurderes etter LPS Challenge og i Pups og voksne mus (A) Young mus (p10) ble utfordret med intraperitoneal LPS ved forskjellige doser, 24 timers før vurdere fagocytose (B) Challenge med 1,42 mg /. kg resulterte i en signifikant økning i prosentandel av fagocytisk retinal mikroglia i forhold til bærerkontroller (p = 0,0021). (C) Denne protokollen kan brukes til å måle retinal microglial fagocytisk funksjon i pup og voksne mus likt. Det er en vesentlig mindre andel av fagocytisk mikroglia i voksen mus sammenlignet med ung (P10) mus (p = 0,019) ikke utfordret med LPS. n = 9 -12, slått sammen fra tre til fireuavhengig eksperiment; feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er tre kritiske trinn i denne fremgangsmåten: (1) intravitreal injeksjon av fluorescensmerkede partikler; (2) høsting og forberedelse av retinal vev; og (3) flowcytometrisk analyse. Vi anbefaler at forskere øve intravitreale injeksjoner før gjennomføring av den metoden vi presenterer her. Albino-mus (for eksempel Balb / c) og en farget oppløsning (for eksempel fluorescerende merkede partikler) kan benyttes for enkel visualisering av nål og injisert løsning. Intravitreale injeksjoner er utfordrende og hvis ikke utføres riktig vil føre til partisk og variable resultater. Vanlige problemer forbundet med dårlig injeksjonsteknikken, er perforering av linsen og / eller skade på retina, noe som kan føre til blødning og betennelse. For å minimalisere risikoen for skade på øyet, skal gnager være i en stabil stilling med minimal bevegelse av hodet. Å trenge inn i øyeeplet, bør sprøyten settes inn langsomt og ikke presset for mye til å unngå å treffelinsen. En annen vanlig komplikasjon er tilbakeløp av det injiserte materiale ut av øyet. For å unngå dette, bør stempelet trykkes ned langsomt, og etter injeksjon bør øyeeplet tillates å trekke seg tilbake inn i øyehulen og sprøyten skal trekkes tilbake langsomt. De beste intravitreal injeksjon aktivere mikroglia ved lave nivåer, men klare forskjeller mellom ubehandlede og behandlede grupper kan måles. Det er viktig at hensiktsmessige kontroller (for eksempel ikke-utfordret mus) er brukt i hvert forsøk for å etablere basislinje fagocytiske nivåer. Et annet aspekt ved denne fremgangsmåte som krever praksis er det retinal disseksjon. For å sikre sammenlignbare enkeltcellepreparater over prøver, må retinal vev hentes raskt og med minimal mulig vev avbrudd. Utføre de siste trinnene av disseksjon i PBS (se 03.04 til 03.07) vil legge til rette for samlingen. Til slutt er det viktig å fremstille det retinale vevet til flowcytometri på riktig måte. Aktivert microglia oppregulere Fcreseptorer og således ikke-spesifikk binding til Fc-delen av antistoffer kan forekomme 7. Et Fc-blokk må utføres for å forhindre ikke-spesifikk farging. Valg av passende fluorophores og kompensasjon satt opp er også viktig 27.
Vi bruker rutinemessig mus i alderen 10 til 20 dager etter fødsel for disse eksperimentene. Imidlertid kan denne protokollen også brukes til å vurdere microglial fagocytisk funksjon i voksne mus (figur 3C). Av notatet, på grunn av tilstedeværelsen av hyaloid blodkar, populasjoner av eksogene myeloide celler (Ly6C + eller Ly6G +) er mer fremtredende i ung mus (ca. 40 - 50% av alle CD11b + celler) enn hos voksne (ca 5% av alt CD11b + celler). Forskere skal bestemme alderen mest hensiktsmessig for sine eksperimenter. Protokollen som presenteres her muliggjør robust deteksjon av nivået av fagocytisk mikroglia i netthinnen. Vi anbefaler imidlertid at 3:57 biologiskal replikerer bli brukt i hvert forsøk, og at minst tre uavhengige eksperimenter blir utført. Mens partiklene som brukes i denne protokollen er godkjent for fagocytiske assays 21-23, hvis ytterligere kontroll er nødvendig, immunohistokjemisk ko-lokalisering av partikler med bestemte fagocyttiske markører kan bli utført.
Én potensiell begrensning ved denne metoden er differensial adgang av mikroglia til partiklene. I den normale netthinnen, mikroglia oppholde seg i to lag, det dypere ytre plexiform lag og det mer overfladiske indre plexiform lag, som er nærmere til den glasslegemet 7. Ved stimulering, eller under aldring, microglia kan migrere gjennom alle netthinnens lag. I denne metoden, blir fluorescerende merkede partikler sprøytes inn i glasslegemet. Tre timer etter injeksjon dette resulterer i partikkelen opphopning i hele netthinnen og spesielt langs den vitreal overflate. Forskere kan ytterligere optimalisere concentratipå av partikler eller tid etter injeksjon for sine eksperimenter. Det er sannsynlig at microglia i større nærhet til glasslegemet vil ha enklere tilgang til partiklene. Ikke desto mindre viser vi at partiklene spres over retina og tas opp av mikroglia i alle lag, men ikke i retinale pigmentert epitel (RPE) celler, sannsynligvis på grunn av begrenset tilgang til vulsten (figur 1C-E). Vi har ennå til å avgjøre om subretinal microglia (som kan hope seg opp med alderen) vil få tilgang til partiklene. Hvis dette er viktig for forskeren, kan denne protokollen bli utført etter nøye subretinal injeksjon av partiklene. En annen viktig faktor er at det kan være naturlig ulik atferd mellom retinal microglia og microglia i andre regioner av CNS. Det er vel kjent at bestemte områder av hjernen har forskjellige mottagelighet for sykdom. For eksempel, ved Parkinsons sykdom, nerveceller i substantia nigra er for det meste berørt, mens i AlzHeimer sykdom, er hippocampus nevroner mest påvirket 28. Således, når man studerer patologien av en spesifikk sykdom, er hjerneregion sannsynlig å være en viktig faktor. En tilsvarende protokoll til det som er beskrevet her kan utføres etter intrakran injeksjon for å oppdage eventuelle forskjeller i fagocyttiske reaksjon mellom retinal og hjerne mikroglia. Netthinnen har mange fellestrekk med andre regioner av hjernen, inkludert tilstedeværelse av en blod-retina-barriere 20. Retina microglia og hjerne microglia stammer fra de samme plommesekkstamfedre og vises veldig likt med hensyn til morfologi og celleoverflaten markør uttrykk 7,29. Videre er det flere hjernesykdommer (f.eks Alzheimers sykdom, slag, og multippel sklerose) har okulære manifestasjoner, noe som indikerer at netthinnen er også påvirket 20. Mens forskere bør være oppmerksom på mulige regionale forskjeller, mener vi dette er en informativ modell foralle microglia forskning, og foreslår at alle nevrologer studerer microglial fagocytose kunne bruke denne protokollen.
En klar fordel å utføre denne analysen i øyet er det flere teknikker er blitt utviklet for å fremkalle forskjellige nevrogene spenninger i netthinnen, og stressresponser kan overvåkes in vivo og kvantifiseres ved hjelp av standardiserte protokoller 30. Ved å fremkalle nevrogen stress og deretter utføre analysen beskrevet her, kan forskerne analysere microglia funksjon over et bredt spekter av fornærmelser som varierer i alvorlighetsgrad. Til slutt, når kombinert med flowcytometri sorteringsteknikker, har denne protokollen den fordel i forhold immunohistokjemi at den kan gi rom for grundig analyse av fagocytisk mikroglia (f.eks qPCR, cellekultur, proteomikk).
Opptak av partiklene har tidligere blitt brukt til å måle fagocytisk funksjon, både i in vitro og in vivo systemer. den latter involvert intrakraniell injeksjon av partikler, høsting og frysing av hjernevev, cryosectioning, farging, bildebehandling og post-bildeanalyse 18. Protokollen presenteres her åpner for mye raskere kvantifisering av retinal microglia fagocyttfunksjon. Det har den fordel i forhold til in vitro-systemer at de svært følsomme mikroglia ikke blir fjernet fra deres mikromiljø, slik at for vurdering av fagocytisk funksjon i en fysiologisk sammenheng. Spesielt bør det gjøre det mulig for testing av hvordan feil i andre celletyper (for eksempel genetisk ablasjon av gener i nevroner) påvirker microglia fagocyttfunksjon. Det har også den fordel i forhold til tidligere in vivo-analyser at den bruker flowcytometri, slik at for hurtig, kvantitativ, og nøyaktig deteksjon av fagocyttiske cellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
