Summary
Микроглии фагоцитоза имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и недостаточной фагоцитарной функции были замешаны в патологии. Тем не менее, оценки функции микроглии в естественных условиях является технически сложной задачей. Мы разработали простой, но надежный метод для точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарной потенциала микроглии в физиологической обстановке.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в точной оценки и количественного определения в естественных условиях микроглии фагоцитоза. Микроглии являются резидентные макрофаги ткани центральной нервной системы (ЦНС). Они выполняют различные функции, чтобы обеспечить поддержание гомеостаза тканей. К ним относятся иммунного надзора, секрецию нейротрофических факторов и, ключевое значение, фагоцитоз 1. Микроглии фагоцитоза играет ключевую роль в нескольких важных событий во время развития головного мозга и сетчатки глаза, такие как фагоцитоз несущественных синапсов (синаптических подрезке) и удаление апоптотических нейронов 2-4. Кроме того, микроглии фагоцитоз поврежденных или апоптотических нейронов, клеточных остатков и нарушало микробов было показано, что необходимо для поддержания гомеостаза ЦНС до зрелого возраста 5. Наконец, микроглии фагоцитоза участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и связанных с возрастомдегенерация желтого пятна, где было высказано предположение , что неисправны или недостаточная пропускная способность фагоцитарной может способствовать накоплению амилоида-бета (A & beta ; ) бляшек и друз, соответственно 6,7.
Микроглии функция жестко регулируется их микросреды, в частности растворимых факторов, таких как фактор роста опухоли-бета или межклеточных взаимодействий. Нейроны конститутивно экспрессируют несколько клеточной поверхности лиганды, такие как CD200 и CX3CL1, в то время как микроглии исключительно выражают соответствующие рецепторы CD200R и CX3CR1. Эти рецепторы содержат иммунорецептора ингибирования на основе тирозина мотивы (ITIMs) в их внутриклеточной части. Эти рецепторы ингибитора имеют решающее значение для предотвращения чрезмерной стимуляции микроглии, которая может способствовать нейровоспаления. Таким образом, при нормальных физиологических условиях, межклеточные взаимодействия между нейронами и микроглии держать микроглии в состоянии покоя. Во время повреждения ткани, однако, нейроны могут понижающей регуляции ехрression этих лигандов, удаление их ингибирующее действие на активацию микроглии. Микроглии функции ( в том числе фагоцитоза), таким образом , тесно связана с их микросреды 8. Тем не менее, на сегодняшний день не существует стандартизированные тесты для изучения микроглии фагоцитоза в физиологическом контексте, или таким образом, чтобы полностью повторяющей их микросреду ЦНС.
Несколько анализы были разработаны для измерения фагоцитарную активность микроглии в пробирке, где первичные микроглии или линии микроглии клеточные культивировали с клетками - мишенями (например, апоптотических нейронов) или флуоресцентно меченных бусинок. Целевое поглощение затем оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии изображений или проточной цитометрии 9-12. Эти анализы позволяют тестирование как фармакологические или генетические манипуляции могут повлиять на микроглии фагоцитоза и, в то время как информативный, не в полной мере повторить комплекс в естественных условиях окружающей среды. Косвенные методы изучения микроглии фагоцитозав естественных условиях сообщалось: они выполняются с помощью окрашивания молекул как полагают, участвуют в фагоцитозе (например, CD68), оценка физической близости микроглии и мишеней для фагоцитоза (например, скомпрометированных нейронов или синапсов элементов), или с помощью иммуногистохимического обнаружения фагоцитирующих целевые задачи в клетках микроглии (например, A & beta ; ) 13-17 лет. Два исследования использовали более прямые подходы к оценке микроглии фагоцитоза в естественных условиях. Хьюз и его коллеги использовали методы визуализации для измерения микроглии поглощение гранул доставленных через внутричерепного маршруту 18. Sierra и др. Разработали точный метод для количественной оценки микроглии фагоцитоз апоптотических клеток с использованием сложных методов визуализации 4. Тем не менее, эти методы включают сложные протоколы для подготовки ткани, секционирование, визуализации и анализа данных. Ранее мы использовали анализ проточной цитометрии для оценки фагоцитоза фоторецептора изэр сегменты по пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) клеток в культуре 19. Здесь мы опишем протокол для быстрой оценки поглощения флуоресцентно меченных частиц микроглии сетчатки глаза в качестве количественной меры в естественных условиях микроглии фагоцитоза.
Протокол мы описываем здесь обеспечивает надежное и количественное измерение сетчатки микроглии фагоцитоза в чуть менее шести часов в трех важных этапов: (1) поставки интравитреального флуоресцентно меченый частиц, (2) сбора и подготовки ткани сетчатки, и (3) потока цитометрии анализ. Метод, который мы разработали это надежный метод для оценки микроглии фагоцитоза в сетчатке, и она может быть успешно использован для тестирования, как различные соединения или генетические манипуляции изменяют этот ключ микроглиальную функцию в физиологических условиях. В специализированной области ЦНС, сетчатка легко доступной модели системы для изучения функции микроглии 20. В то время как этот метод был разработан в Tон глаз, мы считаем, что это может быть полезно для всех неврологов, расследующих функции микроглии фагоцитарную.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными научно-исследовательским институтом Скриппса.
1. Подготовка материалов для инъекций
- Стерилизовать 33 G иглы и шприца: разобрать и автоклаве при 115 ° С ο Подготовка иглы для инъекций ростом в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).
- Растаяйте флуоресцентно меченных частиц при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. Приготовьте раствор для инъекций частиц путем восстановления до 50 мг мл раствора / в стерильной PBS с Ca 2+ / Mg 2+.
Примечание: AF488-меченые частицы грибного происхождения , которые были проверены для фагоцитоза анализов используются в данном протоколе 21-23. Для оптимального поглощения, подготовить частицы свежей и непосредственно перед инъекцией.
Примечание 2: Particle концентрации могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента.
2. Интравитреальная Инъекция Бусина Solution
Примечание: Два рюди необходимы для выполнения инъекции, таким образом, таким образом, что человек, выполняющий инъекции может держать мышь и сохранить фокус на глазное яблоко, в то время как другой человек проходит загруженный шприц и толкает поршень.
- Анестезировать грызуна путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина в дозе 20 мкл / 10 г веса тела. Перед инъекцией, использовать носок щепотку для оценки уровня анестезии.
Примечание: Isoflurane оказывает глубокое воздействие на функции клеток миелоидного, таким образом, его использование на протяжении всего этого анализа следует избегать 24,25. - Нагрузка игла с 0,5 мкл раствора флуоресцентно меченых частиц.
- Положите мышь в сторону под операционным микроскопом (рис 1A-B). Используйте мягкий материал, например, пакет геля, для лучшего позиционирования мыши. Для молодых мышей , у которых глаза еще не открыты, аккуратно открыть веки при помощи тонких 45 O под углом щипцов путем создания fissuповторно вдоль щели, из которых в конечном итоге веки открытыми.
- С помощью тонких 45 O под углом пинцетом осторожно применять давление вокруг веко, так что глазное яблоко выскакивает слегка из гнезда. Держите голову двумя пальцами чуть выше уха и его челюсти и осторожно растягивать кожу параллельно веки слегка держать глаз из розетки. Будьте осторожны , чтобы не понять слишком близко к горлу (рис 1В).
- Для того, чтобы проколоть глазного яблока, вставить иглу шприца в роговичного лимба (где роговица и склеры подключиться). Это видно, как серый круг в пигментированных мышей. слегка Отвести иглу, чтобы изгнать небольшой объем стекловидного жидкости, а затем вводят. Лицо, осуществляющее инъекцию следует осторожно держать мышь с одной стороны, и иглы с другой стороны; второй человек должен медленно толкать поршень.
- Отвести шприц медленно. Нанесите увлажняющий глаз капли, чтобы держать глаза увлажненной. </ Li>
- Пусть грызун восстанавливаться в клетке над тепловым площадку и продолжать следить за развитием животного. При работе с мышат, не возвращают животное в клетку с другими животными оповещения, пока он не дышит и способные к самопроизвольному движению. При работе со взрослыми, не возвращают грызуна в клетку с другими животными оповещения, пока он не восстановит грудины отдохновение.
3. Заготовка ткани сетчатки
Примечание: ретинальной ткани из глаз не инъецировали флуоресцентно меченый частицами должны быть собраны в качестве контроля для анализа методом проточной цитометрии. Хотя анализ может быть выполнен с использованием одного сетчатку, для обеспечения наилучшей производительности двух сетчаток должны быть объединены вместе.
- Собирают ткани сетчатки 3 ч после инъекции в стекловидное флуоресцентно меченых частиц.
Примечание: В то время как время после введения раствора частиц могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента, мы обнаружили, что 3 ч после инъекции, поглощение частиц можно было видеть на протяжении многих слоев OF сетчатки (рис 1C-D). - Жертвоприношение мышей путем смещени шейных позвонков.
- Соберите глазные яблоки, слегка нажав на веко с помощью тонких 45 O угловыми щипцов proptose глазного яблока. Расположите щипцов позади глазного яблока и тянуть.
- Проанализируйте сетчатки глаза под микроскопом рассекает. Перенести глазное яблоко в чашку Петри , содержащую небольшое количество PBS с Ca 2+ / Mg 2+. В сухом месте чашки Петри, перфорировать глазное яблоко в роговице лимба с кончика высокодисперсных щипцов.
- Держите глазное яблоко с помощью тонких 45 O под углом пинцетом и использовать пружинные ножницы , чтобы вырезать вокруг роговицы лимба, пока примерно половина окружности лимба роговицы не вырезается.
- Держите глазное яблоко с изобразительным 45 о наклоненными пинцетом и довести глазного яблока в PBS. С второй парой тонких 45 O под углом щипцов рвать роговицы и склеры друг от друга. Хрусталик и сетчатка выйдет яntact.
- Отделите объектив и сетчатки глаза. Соберите сетчатку и передать пробирку 5,4 мл полистирола , содержащую 2 мл PBS с Ca 2+ / Mg 2+.
4. Подготовка суспензии отдельных клеток
- Подготовка суспензии отдельных клеток с использованием набора для нервной ткани диссоциации с незначительными модификациями инструкциями изготовителя. Вкратце, растирают сетчатка пипетированием вверх и вниз с P1000 пипетки и выполняя ферментативного расщепления при температуре 37 ° С без встряхивания.
5. Окрашивание Суспензии отдельных клеток для анализа потока Cytometric
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл окрашивающего буфера (фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко, с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,09% азида натрия) и переноса в U-дно 96-луночного планшета. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г.
Примечание: азид натрия вреден для человека и окружающей среды. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты оборудования аго отказаться от отходов в соответствии с местными правилами. - Переверните планшет над раковиной, чтобы отбросить супернатант. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы, ресуспендирования клеток в 25 мкл буфера, содержащего краситель 5 мкг / мл анти-мышиного CD16 / CD32 антитела на каждую лунку. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 25 мкл окрашивающего буфера, содержащего 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6C-Арс-Cy7, 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6G-Пе-Cy7 и 2,5 мкг / мл анти-мышиной CD11b-AF650. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Переверните планшет, чтобы отбросить супернатант. Промыть ресуспендирования клеток в 200 мкл буфера для окрашивания.
- Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего краситель 0,5 мкг / мл йодистого пропиди (PI). Переезд в микротитровальных пробирки 1,2 мл.
- Промыть лунки с дополнительными 100 мкл окрашивания буфера, содержащего 0,5 мкг / мл PI и бассейн с предыдущими 200 мкл в1,2 мл микротитровальные трубки. Общий объем 300 мкл окрашенных клеток получается.
6. Анализ проточной цитометрии
- При использовании обычного три лазера (фиолетовый, синий и красный лазер), во избежание PE, PerCP-Cy5.5, BV510 и PI красители из-за значительного перелива из очень ярких флуоресцентных AF488-частиц. Используйте четвертый (желтый) лазер для оптимизации этого анализа, так как она позволяет PE-меченых антител и PI (в канале mCherry вместо канала PerCP-Cy5.5) , которые будут использоваться (рисунок 2).
Примечание: Если желтый лазер не доступен, использовать мертвые клетки исключения красителя в другом канале. - Ворота на PI отрицательные клетки (PI-) , чтобы исключить мертвые клетки (рис 2б).
- После исключения мертвые клетки, ворота на CD11b - положительных клеток (CD11b +), это будет включать в себя все миелоидных клеток (рис 2С).
- В популяции CD11b +, ворота на Ly6C - / Ly6G - исключитьнейтрофилы (CD11b + / Ly6G +) и моноциты (CD11b + / + Ly6C; Рисунок 2D). После того, как стробирования на микроглии (здесь определяется как CD11b + / Ly6C - / Ly6G - для простоты), две четкие группы населения должны быть видны; один отрицательный и один положительный для флуоресцентно меченых частиц. Фагоциты будут рассмотрены частицы и, следовательно , AF488 + (рис 2E).
Примечание: Ly6C положительный или Ly6G положительные популяции также могут быть проанализированы для измерения поглощения частиц с помощью этого окрашивания подход. Процент фагоцитарных CD11b - клеток хорошо коррелирует с процентом фагоцитарной микроглии (рис 2F). Для исследователей без опыта проточной цитометрии, более простой анализ с одним только CD11b окрашивания может быть выполнена, хотя и это будет включать в себя фагоцитарную нейтрофилы и моноциты, а также микроглии. В рамках этого CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ SUP> популяции, эти клетки> 99% микроглии, о чем судили с помощью окрашивания маркеров F4 / 80 и CX3CR1; Эти маркеры могут быть добавлены, но не нужны в наших руках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы опишем метод , чтобы быстро и надежно определить число фагоцитирующих микроглии ретинальных в физиологическом условиях с использованием анализа методом проточной цитометрии (рисунок 2). Этот метод может быть адаптирован для тестирования эффекта соединений и / или генетических манипуляций на фагоцитарную способности микроглии (Фигуры 3А, 3В). Он также может быть использован в молодых (10 - 20 дней) или послеродового взрослых мышей (рис 3C). Различные дозы липополисахарида (LPS) вводили внутрибрюшинно. 24 ч после инъекции ЛПС, протокол , описанный здесь , был использован для оценки функции сетчатки микроглии фагоцитарную (фиг.3А). Доза 1,42 мг / кг LPS вызывала статистически значимое увеличение процента фагоцитарного микроглии по сравнению с контролем - носителем (рисунок 3б), как и следовало ожидать 26.
Рисунок 1: Интравитреальная установки впрыска топлива и представитель сетчатке Раздел показывающий флуоресцентно меченных Частицы в сетчатке слоев. (А) Гель пакет устанавливается под микроскопом рассечение. (В) грызуном проводится , как показано положение глаз для инъекции в стекловидное тело. (С) Через три часа после инъекции флуоресцентно меченных частиц можно увидеть слои на протяжении большей сетчатке. (Д , E) CX3CR1 GFP / GFP мышей и частицы метят с красным флуорофором были использованы для визуализации поглощения частиц с помощью микроглии. Микроглия в более глубоком (D) и поверхностные (Е) слои занимают частицы. Шкала баров -. 20 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: стробирование Стратегия выбрать фагоцитарную микроглии (А) Отдельные клетки суспензии из ткани сетчатки из p10 мыши анализируются (В) После исключения отмершие клетки (PI +), выбираются (C) CD11b + клетки (D) к... выбрать только для микроглии, CD11b + нейтрофилы (Ly6G +) и моноцитов (Ly6C +) исключаются. (Е) Фагоцитарная микроглии будет рассмотрен флуоресцентно меченных частиц. (F) количество фагоцитирующих CD11b - клеток аналогична микроглии (CD11b + Ly6G - Ly6C -). п = 9, объединяли из трех независимых экспериментов; Столбики ошибок обозначают среднее значение ± SEM.rget = "_blank"> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Микроглия фагоцитарной функции могут быть оценены после инъекции ЛПС и щенят и взрослых мышей (A) молодых мышей (p10) заражали внутрибрюшинно LPS в различных дозах, 24 часа в сутки , прежде чем оценки фагоцитоза (B) Вызов с 1,42 мг /. кг приводило к значительному увеличению процент фагоцитоза микроглии сетчатки глаза при сравнении с контрольной группой транспортных средств (р = 0,0021). (C) Этот протокол может быть использован для измерения ретинальной микроглиальную фагоцитарной функции у детенышей и взрослых мышей , так. Существует значительно меньший процент фагоцитоза микроглии у взрослых мышей по сравнению с молодыми (P10) мышей (р = 0,019) не ставится под сомнение с LPS. п = 9 -12, объединяли от трех до четырехНезависимый эксперимент; Столбики ошибок обозначают среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существуют три важных шагов в этом способе: (1) инъекции в стекловидное флуоресцентно меченый частиц; (2) сбор и подготовка ткани сетчатки; и (3) Цитометрический анализ. Мы рекомендуем, чтобы исследователи практике Интравитреальная инъекции перед выполнением метода мы представляем здесь. Мышей - альбиносов (например, BALB / C) и окрашенный раствор (например, флуоресцентно меченных частицы) могут быть использованы для облегчения визуализации иглы и введенного раствора. Интравитреальная инъекции являются сложными, и если не выполнены правильно приведет к необъективным и переменных результатов. Общие проблемы, связанные с плохой техникой инъекции являются перфорация линзы и / или повреждения сетчатки, что может привести к кровотечению и воспаления. Для того, чтобы свести к минимуму риск травмы глаз, грызун должен находиться в устойчивом положении с минимальным движением головы. Для того, чтобы проникнуть в глазное яблоко, шприц должен быть вставлен медленно и не зайдет слишком далеко, чтобы избежать удараОбъектив. Еще одним распространенным осложнением является рефлюкс впрыскиваемого материала из глаза. Чтобы избежать этого, поршень должен быть подавлен медленно и, после того, как инъекции, глазное яблоко должно быть разрешено втягиваться в глазницы и шприц должен быть втянут медленно. Лучшие интравитреальные инъекции активировать микроглии на низких уровнях, но четкие различия между необработанными и обработанными группами могут быть измерены. Крайне важно , чтобы соответствующие средства контроля (например, не оспорена мыши) используются в каждом эксперименте для установления базовых уровней фагоцитоза. Другой аспект этого способа, который требует практики является рассечение сетчатки глаза. Для того, чтобы обеспечить сопоставимые препараты одноклеточ- через образцах ткани сетчатки глаза должны быть собраны быстро и с минимально возможным разрушение ткани. Выполнение последние шаги рассечение в PBS (см 3.4 - 3.7) будет способствовать сбору. И, наконец, важно, чтобы подготовить ткани сетчатки для проточной цитометрии правильно. Активированные микроглии апрегулируются Fcрецепторы и , таким образом , неспецифическое связывание с Fc - части антител может произойти 7. Блок Fc должен быть выполнен, чтобы предотвратить неспецифическое окрашивание. Выбор соответствующих флуорофоров и компенсации , созданной также имеет важное значение 27.
Мы обычно используют мышей в возрасте от 10 до 20 дней послеродового для этих экспериментов. Тем не менее, этот протокол также может быть использован для оценки микроглиальную фагоцитарной функции у взрослых мышей (рис 3C). Следует отметить, что из - за наличия гиалоидной сосудистую систему , популяции экзогенных миелоидных клеток (Ly6C + или Ly6G +) более выражены у молодых мышей (примерно 40 - 50% всех CD11b + клеток) , чем у взрослых (примерно 5% от всех CD11b + клетки). Исследователи должны определить возраст наиболее подходящий для своих экспериментов. Протокол, представленные здесь, обеспечивает надежную обнаружения уровня фагоцитарной микроглии в сетчатке. Тем не менее, мы рекомендуем три-четыре биологическихаль реплицируется использоваться в каждом эксперименте и что по крайней мере трех независимых экспериментов выполняются. В то время как частицы , используемые в настоящем протоколе, были утверждены для фагоцитирующих анализов 21-23, если требуется дополнительная проверка, иммуногистохимическое совместная локализация частиц со специфическими фагоцитирующих маркерами может быть выполнена.
Одним из потенциальных ограничений этого метода является дифференцированный доступ микроглии к частицам. В нормальной сетчатки, микроглии находятся в двух слоях, тем глубже наружного плексиформной слоя и более поверхностный внутренний слой плексиформной, который находится ближе к стекловидного 7. При стимуляции или в процессе старения, микроглии могут мигрировать через все слои сетчатки. В этом методе, флуоресцентно меченных частицы вводят в стекловидное тело. Через три часа после инъекции это приводит к накоплению частиц по всей сетчатке и особенно вдоль поверхности витреальной. Исследователи могут дополнительно оптимизировать Концентрацна частиц или после инъекции для своих экспериментов. Вполне вероятно, что микроглии в большей близости к стекловидное тело будет иметь более легкий доступ к частицам. Тем не менее, мы покажем , что частицы распределены по сетчатке и подхватывает микроглии во всех слоях , но не в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) клеток, вероятно , из - за ограниченного доступа к бисерной (Рисунок 1С-E). Нам еще предстоит определить, является ли субретинальная микроглии (который может накапливаться с возрастом) получат доступ к частицам. Если это важно для исследователя, этот протокол может быть выполнено после тщательного субретинальной инъекции частиц. Еще одним важным фактором является то, что может быть по своей природе различное поведение между микроглии сетчатки и микроглии в других областях ЦНС. Хорошо известно, что определенные области мозга имеют разные восприимчивостью к болезни. Например, при болезни Паркинсона, нейроны черной субстанции, в основном, зависит, в то время как в AlzБолезнь Хаймер, в нейронов гиппокампа в основном пострадали 28. Таким образом, при изучении патологии конкретного заболевания, область мозга, вероятно, будет важным фактором. Аналогичный протокол к описанному здесь может быть выполнена после того, как внутричерепной инъекции для изучения потенциальных различий в фагоцитарной реакции между микроглии ретинальных и головного мозга. Сетчатка имеет много общих черт с другими областями мозга, в том числе при наличии крови Retina-барьера 20. Сетчатка микроглии и микроглии мозга происходят из тех же желточного мешка клеток - предшественников и очень похожи в отношении экспрессии 7,29 маркеров морфологии и клеточной поверхности. Кроме того, несколько заболеваний головного мозга (например, болезнь Альцгеймера, инсульт, рассеянный склероз) имеют офтальмологические проявления, указывая , что сетчатка также влияет 20. В то время как исследователи должны быть осведомлены о потенциальных региональных различий, мы считаем, что это информативное модельвсе микроглии исследования, и предполагают, что все нейробиологи, изучающие микроглии фагоцитоза может использовать этот протокол.
Явное преимущество выполнения этого анализа в глаза, что несколько методов были разработаны , чтобы вызвать различные нейрогенные напряжения в сетчатке, а также реакции на стресс можно наблюдать в естественных условиях и количественно с использованием стандартных протоколов 30. Путем индукции нейрогенный стресс, а затем проведения анализа, описанного здесь, исследователи могут анализировать функцию микроглии в широком спектре оскорблений, которые различаются по степени тяжести. И, наконец, в сочетании с методами проточной цитометрии сортировки, этот протокол имеет преимущество перед иммуногистохимии , что она может позволить углубленного анализа фагоцитарной микроглии (например, КПЦР, клеточной культуры, протеомики).
Усвоение частиц ранее использовался для измерения фагоцитарную функцию, как в в пробирке и в естественных условиях системах. лаолучатель участвует внутричерепное инжекции частиц, сбора и замораживания ткани головного мозга, cryosectioning, иммунное окрашивание , визуализации и анализа 18 пост-обработки изображений. Протокол, представленные здесь, позволяет гораздо быстрее количественного сетчатки глаза функции микроглии фагоцитоза. Он имеет преимущество по сравнению с системами в пробирке , что высокочувствительные микроглии не удаляются из их микроокружения, что позволяет для оценки фагоцитарной функции в физиологическом контексте. В частности, он должен позволить испытывать как дефекты в других типах клеток (например, генетическая абляции генов в нейронах) влияют на микроглии функцию фагоцитов. Это также имеет преимущество по сравнению с предыдущими в анализах естественных условиях , которые она использует проточной цитометрии, что позволяет для быстрого, количественного и точного обнаружения популяций фагоцитирующих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
