Introduction
La structure quaternaire d'une protéine joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. Les voies de signalisation, l' expression des gènes, et l' enzyme activation / désactivation tous comptent sur le bon assemblage des complexes protéiques 1-4. Ce procédé également connu sous le nom d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation est due à la liaison covalente irréversible ou des interactions protéine-protéine électrostatique et hydrophobe réversibles. Oligomérisation non seulement de diversifier les différents processus cellulaires sans augmenter la taille du génome, mais fournit également une stratégie de protéines pour construire des complexes stables qui sont plus résistantes envers une dénaturation et une dégradation 5. Défauts dans oligomérisation ont un impact sur la fonction des protéines et peuvent conduire au développement de maladies. Par exemple, l'enzyme phénylalanine hydroxylase forme un complexe tétramérique. Des mutations dans le complexe protéique peuvent affaiblir la formation du tétramère et conduire à la phénylcétonurie , la maladie 6.
7. Il appartient à la superfamille des grandes GTPases dynamine-like et a la capacité de former de grandes structures oligomériques in vitro 8. L' oligomérisation a été proposé de protéger contre une dégradation rapide MXA 9,10. En dépit des efforts intenses par de nombreux groupes de recherche, le mécanisme moléculaire d'action reste largement insaisissable et le rôle de l'état d'oligomérisation de MXA pour sa fonction antivirale est en débat 9,11,12. À cet égard, Gao et ses collègues ont proposé un modèle où MxA exerce son activité antivirale en interagissant avec des nucléoprotéines virales sous forme de grandes structures oligomériques 11 annulaires. Cependant, plus récemment, nous avons démontré que les dimères MxA présentent une activité antivirale et d' interagir avec la nucléoprotéine du virus grippal A 12. Belon sur la structure cristalline de la MXA, Gao et ses collaborateurs ont identifié plusieurs résidus d'acides aminés dans les régions d'interface qui sont essentielles pour son oligomérisation in vitro et sa fonction antiviral 11,13. Par conséquent, afin d'élucider ce qui oligomérique état de MXA exerce une activité antivirale, nous avons cherché à établir un protocole simple de déterminer rapidement l'état oligmeric de mutants d'interface MxA exprimées dans les cellules humaines, ainsi que endogènes MxA exprimé après IFNa stimulation.
Bien qu'il existe de nombreuses techniques qui sont couramment utilisés pour étudier l'interaction entre les protéines telles que la protéine split-Green Fluorescent (split-GFP) complémentation test 14, la résonance plasmonique de surface 15 et Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) 16, ils ne fournissent pas l'information de la stoechiométrie exacte d'un complexe protéique oligomère. Pour enquêter sur cet aspect particulier, des techniques telles quela diffusion multi-angle de la lumière (MALS) 17 et ultracentrifugation analytique 18 sont très utiles. Habituellement, les protéines analysées en utilisant ces procédés sont des protéines purifiées. procédés d'oligomérisation peuvent également dépendre d'autres facteurs cellulaires. Si ces facteurs sont inconnus, l'analyse est plus difficile. En outre, certaines protéines sont difficiles à exprimer dans E. coli et à purifier. Par conséquent, ces méthodes ne sont pas le choix optimal pour analyser la protéine oligomérisation dans l'environnement cellulaire. En outre, ces techniques nécessitent des instruments coûteux qui ne sont pas facilement disponibles.
Non-électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE), la chromatographie d'exclusion stérique ou la reticulation chimique suivie par le dodécylsulfate de sodium classique (SDS) -PAGE sont des outils utiles pour la caractérisation de la formation d'oligomères à partir de lysats de cellules 2,19,20. Ces méthodes ne nécessitent pas d'équipement spécialisé et peuvent être facilement performed dans un laboratoire standard. Nous avons d'abord évalué différents protocoles de reticulation chimiques qui invariante conduit à l'agrégation et la précipitation des MXA non spécifique. Par conséquent, nous avons ensuite testé les protocoles PAGE non dénaturants. Comme non-dénaturant PAGE exclut l'utilisation de SDS, la migration des protéines dépend de leur charge native. PAGE Blue-native utilise Coomassie G250 bleu brillant pour charger des protéines avec une charge globale négative, similaire à SDS, mais ne dénature pas la protéine 21. Malheureusement, le bleu brillant de Coomassie précipite en présence de sels élevées et des cations divalents (par exemple Mg 2+) qui sont souvent inclus dans les tampons de lyse. Selon les tampons utilisés, il peut être difficile d'analyser l'échantillon sans autre optimisation des mesures qui pourraient avoir un effet sur le complexe protéique oligomérique.
Nous présentons ici un protocole simple basé sur une méthode publiée précédemment 22 pour déterminer oligomérisationprotéine humaine MxA provenant de lysats cellulaires en utilisant non-dénaturant PAGE.
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Protocol
NOTE: Ce protocole est basé sur la non-dénaturant PAGE protocole précédemment publié 12. Dans cette étude, l'état oligomérique de la protéine MxA a été évaluée en utilisant soit des cellules Vero ou des cellules surexprimant MXA A549 IFN-a stimulée endogène exprimant MXA. Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour analyser l'état d'une quelconque protéine oligomérique en plus MXA. Cependant, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire.
1. Préparation de lysat cellulaire pour les non-dénaturant PAGE
NOTE: Pour analyser l'état oligomérique de la protéine MxA humaine dans des cellules Vero ou A549, 1,0 x 10 6 cellules ont été récoltées. En fonction du type cellulaire ou l'abondance de la protéine à analyser, le nombre de cellules doit être ajustée. Il est également important de protéger le tampon de lyse de l'exposition à la lumière, dès que l'iodoacétamide sensible à la lumière est ajouté.
- Graine de 0,3 x 10 6 A549 ou Vero cellules par puits dans6 bien-plats. Gardez les cellules dans 2 ml de milieu de croissance par puits (voir le tableau 1). Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2).
- Récolter les cellules par lavage avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) et séparer par addition de 0,5 ml de 0,25% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), 1x solution pendant environ 5 min à température ambiante.
- Dès que les cellules se détachent de la boîte, ajouter du milieu 0,5 ml de croissance et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas.
- Transférer les cellules de chaque puits dans un tube de 2 ml et le culot de les utiliser une centrifugeuse de dessus de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Retirez délicatement le surnageant par pipetage sans perturber le culot cellulaire.
- Laver les cellules avec du PBS 1 ml glacé par pipetage soigneusement la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas.
- cellules à granules dans une centrifugeuse de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Retirez délicatement le surnageant par pipetage wiThoout détacher le culot cellulaire.
- Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de lyse glacé (voir le tableau 1) par pipetage de haut en bas et de mettre sur la glace.
- Immédiatement, protéger lysat de la lumière, en recouvrant les tubes en utilisant une feuille d'étain et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
REMARQUE: Après incubation pendant 30 minutes sur de la glace, il est plus indispensable de protéger le lysat provenant de l'exposition lumineuse, étant donné que la protection des groupes thiol libres est irréversible. - Retirer les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de paillasse pré-refroidie (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
- Equilibrer les colonnes de dialyse dans un tampon de dialyse (tableau 1) dans la chambre froide à 4 ° C pendant 20 minutes au cours de l'étape de centrifugation. Utilisez une colonne avec un poids moléculaire de coupure de 10.000.
- Fixez les colonnes à une bouée flottante et les mettre dans un bécher rempli avec un tampon de dialyse. Pour assurer une agitation douce, utiliser un agitateur magnétique. Ne touchez pas la membrane.
NOTE: Dialyssont des colonnes peuvent être achetés ou préparés à partir de tubes de 1,5 ml selon le protocole décrit par 19 Fiala et coll.
- Fixez les colonnes à une bouée flottante et les mettre dans un bécher rempli avec un tampon de dialyse. Pour assurer une agitation douce, utiliser un agitateur magnétique. Ne touchez pas la membrane.
- Supprimer les colonnes de la mémoire tampon de dialyse et la bouée flottante. Transférer les lysats clarifiés dans la colonne de dialyse préparé par pipetage sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante et les remettre dans le bécher rempli avec un tampon de dialyse.
- Dialyser le lysat dans un bécher contenant un tampon de dialyse glacée (tableau 1) pendant au moins 4 heures (ou de préférence la nuit) à 4 ° C , tout en agitant soigneusement à l' aide d' un agitateur magnétique. Utiliser un tampon d'au moins 100 ml de dialyse pour un lysat de 200 ul.
- Transférer l'échantillon dialysé dans un tube de 1,5 ml. Retirer précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de dessus de table (13 000 xg, 4 ° C, 20 min). Pour empêcher la dissociation de la protéine oligomérique complexes continuent avec le protocole (section 2) immédiatement après la dialyse. Ne pas congelerles lysats préparés.
2. Electrophorèse
REMARQUE: L' électrophorèse a été réalisée comme décrit précédemment avec des modifications 22. Dans le protocole décrit ci-dessous, des gels de gradient préfabriqués ont été utilisés (4-15% gradient). En variante, les gels peuvent être préparés au laboratoire. Il est très important d'exclure tout agent dénaturant tel que le SDS pour empêcher la dissociation des complexes de protéines oligomériques. Le temps de l'électrophorèse a été optimisé pour les différents états oligomériques de la protéine MxA humaine. Cependant, elle peut varier pour d'autres protéines, en fonction de la taille du complexe oligomérique, ainsi que l'intervalle de séparation qui est censée être réalisée pour analyser le complexe. Par conséquent, la durée optimale de l'électrophorèse doit être déterminée de manière empirique. Pour une résolution optimale des oligomères à analyser le courant ne doit pas dépasser 25 mA.
- Assembler le gel PAGE non dénaturante dans la chambre de gel. Remplissez til chambre intérieure et extérieure avec un tampon de course pré-refroidie (tableau 1).
- Pré-exécuter le gel avec un tampon de course prérefroidi à 25 mA par gel pendant 15 min dans la chambre froide à 4 ° C.
- Mélanger 15 ul de lysats préparés ci - dessus avec 5 pi de tampon d'échantillon 4X (tableau 1). Ne pas faire bouillir l'échantillon.
- Chargez 15 ul d'échantillon et un étalon de protéine native de choix sur le gel. Exécutez le gel à 25 mA pendant 4 heures dans la chambre froide à 4 ° C.
Remarque: Pour des analyses semi-quantitatives, un protocole de quantification des protéines (par exemple un Bradford Protein Assay 23) peut être réalisée afin d'assurer le chargement des quantités égales de protéine totale par voie.
3. Western Blot
NOTE: Décrite ci-dessous est le protocole d'un système de western blot humide. Toute membrane buvard peut être utilisé. Activer le fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans les membranes 100% de methanol avant d'équilibration dans buf buvardfer. La technique de western blot semi-sec peut être utilisé alternativement, mais doit être optimisé pour les grands complexes oligomériques.
- Démonter le gel et le transfert avec précaution dans du tampon SDS (tableau 1).
- Incuber pendant 10 min à température ambiante en agitant doucement.
- Préparer 2 éponges, 4 feuilles de papier filtre de cellulose et une membrane de transfert par gel. Faites - les tremper dans buvard tampon (tableau 1).
- Assembler le sandwich comme suit (de bas en haut): 1 éponge, 2 cellulose feuilles de papier filtre, membrane, gel, 2 cellulose feuilles de papier filtre, 1 éponge.
- Mettez le sandwich dans le réservoir buvard. Assurez-vous que la membrane fait face au pôle positif tandis que le gel fait face au pôle négatif.
- Remplir le réservoir buvard avec un tampon buvard pré-réfrigérés.
- Éponger à 90 mA pendant une nuit à 4 ° C pour obtenir les meilleurs résultats de transfert de protéines.
- Démonter le sandwich et de visualiser la norme de protéine par incubation de la membrane dans PoncLa solution eau de 5 min à température ambiante.
- Destain la membrane par précaution lavage du Ponceau S avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que vous pouvez voir clairement les bandes de la norme de la protéine.
- Marquer les bandes de la protéine de référence à l'aide d'un stylo.
NOTE: résiduelle Ponceau S peut interférer avec l'immunocoloration. Pour éviter cela, la membrane peut être décoloré en outre par une incubation dans du NaOH 0,1 M pendant 1 min, puis lavage avec de l'eau déminéralisée. - Bloquer la membrane avec un tampon de blocage (voir le tableau 1) pendant au moins 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Visualiser la protéine (s) d'intérêt par immunocoloration en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine à analyser.
REMARQUE: La protéine MxA humaine a été visualisée en utilisant l'anticorps polyclonal de lapin spécifique pour Mx1 humain dilué à 1: 1000 dans un tampon bloquant (tableau 1). La solution d'anticorps a été mis à incuber pendant une nuit à 4 ° C. En variante, l'anticorps monoclonal anti-MXA anticorps (clone 143) peut être utilisé (données non présentées) 24.
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Representative Results
Utilisation non-dénaturant PAGE, nous avons analysé l'état oligomérique de type sauvage humaine MXA, les dimères mutants d'interface MXA (R640A) et MXA (L617D), ainsi que le mutant d'interface monomère MXA (M527D) à partir de lysats cellulaires 12. Les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 1% d' octylphénoxypolyéthoxyéthanol (NP-40) et iodoacétamide pour assurer la solubilisation et la protection des groupes thiol libres protéine (voir figure 1). Comme décrit précédemment, le sel et les petits métabolites ont été éliminés par dialyse 19. la séparation des protéines a été réalisée par PAGE non dénaturante. Pour faciliter l'efficacité western blot, le gel a été incubé dans un tampon SDS avant buvard. Les protéines ont été visualisées MxA par immunocoloration en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre MxA. Le flux de travail est décrit dans la figure 2.
Pour comparer l'état oligomérique de protéine endogène MxA humaine de l'IFN-α ; Les cellules A549 stimulées, nous transfectées des cellules Vero (dépourvues endogène MXA) avec de type sauvage recombinant, des variants MxA monomères et dimères. Ce type sauvage recombinant, monomère et dimère MxA variantes formé tétramères stables, des monomères et dimères, respectivement, par rapport à un marqueur de protéine native unstained (figure 3A). Par conséquent, nous avons utilisé ces protéines recombinantes pour évaluer l'état oligomérique de protéine endogène MXA humain dérivé de l' IFN-α a stimulé les cellules A549. La figure 3B montre que la taille des MXA dans des lysats de cellules A549 IFN-a stimulée correspond à un tétramère.
Pris ensemble, nous décrivons une méthode pour déterminer l'état oligomérique de la protéine MxA humaine de lysat cellulaire. Notre approche PAGE non dénaturant peut également être utilisé pour évaluer l'état oligomérique d'autres complexes de protéines oligomériques.
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Figure 1. La structure et le schéma réactionnel de l' iodoacétamide iodoacétamide protège de manière irréversible le groupe thiol de cystéines libres en formant une liaison thioéther. Cette stabilité des résultats de modification de la substitution nucléophile de l'iode avec l'atome de soufre du cystéine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Diagramme des processus de non-dénaturant PAGE Une représentation systématique de l'approche PAGE non dénaturant de lysats cellulaires. Au cours de la lyse des cellules, des détergents solubiliser les protéines et thiol sont protégées par iodoacétamide pour empêcher l'agrégation des protéines. La dialyse élimine les petits métabolites et des sels qui pourraient interférer avec dénaturant non-PAGE
Figure 3: Détermination de l'état oligomérique de la protéine MxA humaine en utilisant non-dénaturant PAGE et Western blot (A) recombinant MxA variants ectopique exprimé dans des cellules Vero.. Les complexes de type sauvage MXA (tétramère) mutants d'interface MXA (R640A), MXA (L617D) (dimères) et MXA (M527D) migrent à leurs poids moléculaires attendus, confirmant leur état oligomérique. (B) Des cellules A549 ont été stimulées avec 1 000 UI par ml d'IFN-α pour induire l' expression MXA. Le sh MxA endogèneows un groupe qui correspond à la forme tétramérique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| nom Buffer | Contenu | commentaires | ||
| Le tampon de lyse | 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 100 uM d'iodoacétamide, 50 mM de NaF, 1 mM de Na 3 VO 4, 1% de NP-40, mM de β-glycérophosphate 50, 1 comprimé par 50 ml de tampon de lyse de l'EDTA libre, cocktail inhibiteur de protease | Ajouter iodoacétamide, NaF, Na 3 VO 4, octylphénoxypolyéthoxyéthanol (NP-40), β-glycérophosphate et de la protéase inhibitor cocktail juste avant la lyse cellulaire Iodoacétamide est sensible à la lumière et instable en solution. Prévenir exposition à la lumière et de dissoudre juste avant l'utilisation. | ||
| un tampon de dialyse | 20 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% de glycerol, 0,1% de CHAPS, 0,5 mM de DTT | CHAPS peuvent être raplaced par d'autres détergents non dénaturants | ||
| tampon Exécution | 25 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM de glycine, 0,1% de CHAPS, 0,5 mM de DTT | A pH 8,3, la plupart des protéines sont chargées négativement. Cependant, pour des protéines basiques, un pH acide doit être utilisé. Dans le cas contraire, les protéines se déroulera dans la direction opposée et seront perdues. CHAPS peuvent être remplacés par d'autres détergents non dénaturants | ||
| tampon d'échantillon | 310 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 0,05% de bleu de bromophénol, 50% de glycérol | |||
| tampon SDS | 25 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM de glycine, SDS à 0,1% | |||
| tampon buvard | 25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 20% de methanol | Pour de très grands complexes, le méthanol peut être ignoré | ||
| un tampon de blocage | 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) 150 mM de NaCl 0,05% de Tween 20 5% de poudre de lait | |||
| Un milieu de croissance | Le milieu modifié de Dulbecco 1x Pénicilline / Streptomycine 2 mM de glutamine 10% de sérum de veau fœtal | |||
Tableau 1: Recettes tampons nécessaires pour les non-dénaturant PAGE.
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Discussion
Ici, nous décrivons une méthode simple qui permet la détermination rapide de l'état oligomérique des protéines exprimées dans des cellules de mammifères par PAGE non dénaturante suivie d'une analyse par transfert de Western. L'avantage majeur de cette approche est que l'état oligomérique d'une protéine donnée peut être déterminée à partir de lysats de cellules entières sans purification protéique préalable. Cela peut être important pour des protéines qui oligomériser ou exercent leur fonction en association avec des facteurs auxiliaires. En outre, les protéines sont encore dans leur état natif, et si en outre on extrait à partir du gel, l'activité enzymatique ou d'autres fonctions de la protéine peut être déterminée et corrélée à l'état oligomérique.
Un aspect essentiel de ce protocole est le choix des détergents lors de la préparation de l'échantillon. Ceci est d'une importance particulière pour les protéines associées aux membranes cellulaires. MXA semble être principalement associée à des membranes du réticulum endoplasmique lisse 25 19 la présence de 0,1% de 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) est nécessaire pour éviter la précipitation de MXA lors du gel électrophorèse. En outre, CHAPS ne pas interférer avec l'activité enzymatique de MXA telle que déterminée avec une protéine MxA recombinante purifiée exprimée dans E. coli 12. Il est très important que le détergent ne dénature pas les protéines ou à perturber les interactions protéine-protéine lors de la lyse. détergents non dénaturants tels que NP40, octoxinol 9, digitonine et CHAPS sont appropriés pour la solubilisation. Le choix du détergent et sa concentration doit être déterminée de manière empirique. Le détergent peut également influer sur les expériences en aval , par exemple pour certains essais du détergent doit êtreenlevé qui est facilement réalisé avec le CHAPS par dialyse, mais pas avec octoxinol 9 26.
Etant donné que le procédé décrit analyse des protéines provenant de lysats de cellules dans des conditions non dénaturantes, aucune purification préalable des protéines est nécessaire. Ceci est un avantage étant donné que la purification de protéines recombinantes nécessite parfois des optimisations du tampon par addition de sels élevées et d'autres additifs pour empêcher l'agrégation de la protéine ou la précipitation. Cependant, ces additifs et les concentrations en sel élevées pourraient avoir un impact sur l'oligomérisation de la protéine qui ne serait pas nécessairement ressembler à son état naturel. En particulier dans le cas de la protéine MxA humaine, la concentration en sel et la présence de nucleotides jouent un rôle crucial dans la formation des états oligomères supérieurs 27. Dans les lysats cellulaires, les protéines sont plus facilement stabilisée car les facteurs de stabilisation cellulaires sont encore présents. Par conséquent, il est possible d'analyser prcomplexes otein sous plus cellulaires conditions physiologiques (par exemple les concentrations salines physiologiques et pH). Ce protocole doit également être applicables à d' autres protéines formant des oligomères, par exemple pour la dynamine MxB ou 8 structurellement apparentés.
Un autre aspect important du protocole est la protection des groupes thiol libres pour empêcher la formation de ponts disulfures artificiels de protéines cytoplasmiques lors de la lyse (Figure 1). Des expériences initiales ont montré que l'addition de 1,4-dithiothréitol (DTT) ou le β-mercaptethanol ne suffit pas à empêcher la formation de liaisons disulfures artificiels au cours de la préparation des échantillons. Les deux agents réducteurs de protéger le groupe thiol réversiblement de former des ponts disulfure. Cette protection réversible pourrait ne pas être suffisante pour protéger tous les groupes thiol de façon permanente. Dans le cas de la protéine MxA, ce qui conduit à une agrégation irréversible de la protéine. Cependant, l'addition d'iodoacétamide qui irreversProtège ibly les groupes thiol libres des cystéines considérablement réduit l'agrégation de la protéine MxA En outre, le traitement iodoacétamide des lysats préparés à partir MXA exprimant des cellules de mammifère n'a eu aucune influence sur l'activité GTPase de immunoprécipité MXA par rapport à MXA à partir de lysats traités avec DTT (données non représentées ).
D'autres considérations cruciales pour la détermination exacte du nombre de protomères dans un oligomère sont le choix de la gamme de concentration de polyacrylamide, ainsi que la référence de la protéine de poids moléculaire. La gamme de concentration de polyacrylamide doit être d'abord mis en place pour permettre une séparation maximale des bandes au niveau des masses moléculaires attendues des oligomères. Non-dénaturant PAGE ne contient pas de SDS. Manquant SDS, la charge, la masse moléculaire et la forme de la protéine détermine sa mobilité électrophorétique. Par conséquent, le choix du marqueur de poids moléculaire de la protéine est essentielle. Idéalement, une référence de poids moléculaire serait arforme purifiée ecombinant de la protéine d'intérêt avec les Etats oligomères connus. Étant donné que ce ne sont pas toujours disponibles, un marqueur de la protéine non dénaturée ou native doit être utilisé. Etant donné que MXA a été montré à associer avec d' autres protéines cellulaires telles que UAP56 ou nucléoprotéines virales Thogotovirus, La Crosse virus ou virus de la grippe 12,28-30, nous avons également testé par immunocoloration en utilisant des anticorps spécifiques si UAP56 ou la grippe A nucléoprotéine serait co-distincte avec MxA sur les gels non dénaturants PA. Cependant, nous avons trouvé aucune preuve de la formation de MxA hétéro-oligomères. Ceci est probablement dû au fait que MXA-UAP56 et interactions MXA-nucléoprotéine sont de faible affinité 12,24. En outre, la fraction de la protéine MxA associant UAP56 ou nucléoprotéines virales pourrait être très faible et donc difficile à détecter par cette méthode.
En outre, il est important de prendre en considération le pKa de la protéine à analyser. Dans le non-denat décritendant protocole PAGE, les protéines sont séparées par électrophorèse à pH 8,3. La plupart des protéines sont chargées négativement à ce pH. Toutefois, les protéines de base présentent une charge nette positive à pH 8,3 et par conséquent se déroulera dans la direction opposée. En conséquence, il est important, pour l'analyse des protéines basiques pour ajuster le pH du tampon en cours afin d'assurer une charge négative globale de la protéine.
Pris ensemble, nous présentons ici un protocole pour l'évaluation rapide de l'état oligomérique des protéines exprimées dans les cellules de mammifères, sans la nécessité de sa purification préalable.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC wear gloves and protect eyes |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 µl | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 µl/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1,000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10,000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
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