Introduction
هيكل رباعي من بروتين يلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الخلوية. مسارات الإشارات والتعبير الجيني، وانزيم تفعيل / تعطيل كل تعتمد على التجميع السليم للمجمعات البروتين 1-4. ومن المقرر أن التساهمية لا رجعة فيها أو عكسها تفاعلات البروتين البروتين كهرباء ومسعور هذه العملية التي تعرف أيضا باسم هومو أو مغاير oligomerization. Oligomerization ليس فقط ينوع العمليات الخلوية المختلفة دون زيادة حجم الجينوم، ولكنها توفر أيضا استراتيجية للبروتينات لبناء المجمعات المستقرة التي هي أكثر مقاومة تجاه تمسخ وتدهور 5. عيوب في oligomerization لها تأثير على وظيفة البروتينات ويمكن أن يؤدي إلى تطور أمراض. على سبيل المثال، هيدروكسيلاز أنزيم فينيل الأنين يشكل مجمع رباعي القسيمات. بعض الطفرات داخل المجمع البروتين يمكن أن تضعف تشكيل tetramer وتؤدي إلى بيلة الفينيل كيتون المرض 6.
الصورة = "jove_content"> البروتين MXA الإنسان هو مضاد للفيروسات (IFN) -induced المضادة للفيروسات البروتين المستجيب تمارس نشاط مضاد للفيروسات واسع ضد مختلف RNA، فضلا عن الفيروسات الحمض النووي 7. انه ينتمي الى الفصيلة من GTPases كبيرة مثل dynamin ولديه القدرة على تشكيل الهياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة في المختبر 8. وقد اقترح Oligomerization لحماية MXA من التدهور السريع 9،10. وعلى الرغم من الجهود المكثفة من قبل العديد من المجموعات البحثية، الآلية الجزيئية العمل لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير ودور الدولة oligomerization من MXA عن وظيفتها المضادة للفيروسات هو قيد المناقشة 9،11،12. وفي هذا الصدد، اقترح قاو وزملاء العمل نموذجا حيث يمارس MXA نشاطها المضاد للفيروسات من خلال التفاعل مع البروتينيات الفيروسية في شكل هياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة تشبه حلقة 11. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن dimers MXA المعرض نشاط مضاد للفيروسات وتتفاعل مع البروتين النووي من فيروس إنفلونزا 12. بASED على التركيب البلوري للMXA، حدد غاو وزملاء العمل عدة مخلفات الأحماض الأمينية في المناطق اجهة التي تعتبر بالغة الأهمية لoligomerization في المختبر وظيفة مضادة للفيروسات في 11،13. ولذلك، من أجل توضيح التي تنص على بلازميدة قليلة القسيمات من MXA تمارس نشاط مضاد للفيروسات، سعينا إلى وضع بروتوكول بسيط لتحديد بسرعة الدولة oligmeric من المسوخ واجهة MXA أعرب في الخلايا البشرية وكذلك أعرب الذاتية MXA بعد التحفيز IFNα.
على الرغم من أن هناك العديد من التقنيات التي تستخدم عادة لتحقيق التفاعل بين البروتينات مثل بروتين تقسيم الفلوري الأخضر (تقسيم GFP) تكامل فحص 14، سطح مأكل بالرنين 15 و فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) 16، فإنها لا توفر معلومات رياضيات الكيمياء الدقيق للمجمع البروتين بلازميدة قليلة القسيمات. للتحقيق في هذا الجانب بالذات، تقنيات مثلمتعددة زاوية تشتت الضوء (ملس) 17 وتنبيذ فائق التحليلية 18 هي مفيدة جدا. عادة، والبروتينات تحليلها باستخدام هذه الأساليب هي بروتينات النقاء. قد تعتمد عمليات Oligomerization أيضا على عوامل الخلوية الأخرى. وإذا كانت هذه العوامل هي غير معروفة، وتحليل أكثر صعوبة. بالإضافة إلى ذلك، بعض البروتينات يصعب التعبير عنها في E. القولونية وتنقية. لذلك، وهذه الأساليب ليست هي الخيار الأمثل لتحليل oligomerization البروتين في البيئة الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات تتطلب الأدوات الباهظة الثمن التي لا تتوفر بسهولة.
غير تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE)، اللوني حجم الإقصاء أو يشابك الكيميائية تليها التقليدية دوديسيل الصوديوم كبريتات (SDS) -PAGE هي أدوات مفيدة لتوصيف تشكيل الأوليغومرات من الخلية لست] 2،19،20. هذه الأساليب لا تتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون المؤسسة العامة بسهولةrformed في المختبر القياسية. قمنا بتقييم البداية مختلف البروتوكولات عبر ربط الكيميائية التي أدت invariantly إلى تجميع وترسيب MXA غير محددة. لذلك، نحن اختبار القادم بروتوكولات PAGE عدم تغيير طبيعة. كما تستثني عدم تغيير طبيعة-PAGE استخدام SDS، والهجرة من البروتينات يعتمد على تهمة وطنهم. يستخدم زرقاء أصلية PAGE coomassie G250 الزرقاء الرائعة لتحميل البروتينات مع شحنة سالبة العام، على غرار SDS، ولكن لا تفسد البروتين 21. للأسف، coomassie رواسب الزرقاء الرائعة في وجود الأملاح العالية والكاتيونات ثنائي التكافؤ (مثل المغنيسيوم 2+) التي غالبا ما يتم تضمينها في مخازن تحلل. اعتمادا على مخازن المستخدمة، قد يكون من الصعب لتحليل عينة من دون مزيد من التحسين من الخطوات التي يمكن أن يكون لها تأثير على بروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات.
هنا نقدم بروتوكول البسيط القائم على طريقة نشرت سابقا 22 لتحديد oligomerization منالبروتين MXA حقوق الإنسان مستمد من لست] الخلوية استخدام غير تغيير طبيعة-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يعتمد هذا البروتوكول على نشرها سابقا عدم تغيير طبيعة بروتوكول PAGE 12. في هذه الدراسة، تم تقييم حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA باستخدام خلايا الفيرو overexpressing MXA أو خلايا A549 تحفيز الإنترفيرون α، معربا عن الذاتية MXA. البروتوكول هو موضح أدناه يمكن استخدامها لتحليل حالة بلازميدة قليلة القسيمات من أي بروتين بالإضافة إلى MXA. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين.
1. إعداد الخلايا المحللة للPAGE عدم تغيير طبيعة،
ملاحظة: لتحليل حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA البشري في أي فيرو أو A549 الخلايا، كانت تحصد 1.0 × 10 6 خلايا. اعتمادا على نوع من الخلايا أو وفرة البروتين لتحليل، ينبغي تعديل عدد الخلايا. ومن المهم أيضا لحماية المنطقة العازلة تحلل من التعرض للضوء، في أقرب وقت يتم إضافة iodoacetamide حساسة للضوء.
- البذور 0.3 × 10 6 A549 أو فيرو خلايا لكل بئر فيإلى 6 جيدا الأطباق. إبقاء الخلايا في 2 مل متوسطة النمو لكل بئر (انظر الجدول 1). احتضان خلايا بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
- حصاد الخلايا عن طريق الغسيل مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل بإضافة 0.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 1X حل لحوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- في أقرب وقت فصل الخلايا من الطبق، إضافة 0.5 مل متوسطة النمو وتخلط بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- نقل الخلايا من كل بئر في واحدة أنبوب 2 مل وبيليه لهم باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول (5000 x ج، 4 درجات مئوية، 5 دقائق).
- إزالة بعناية طاف قبل pipetting دون إزعاج بيليه الخلية.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة من قبل pipetting بعناية تعليق الخلية صعودا وهبوطا.
- بيليه الخلايا في أعلى الجدول الطرد المركزي (5000 x ج، 4 درجات مئوية، 5 دقائق).
- إزالة بعناية طاف بواسطة pipetting وايthout فصل بيليه الخلية.
- Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر العازلة الجليد الباردة تحلل (انظر الجدول 1) من قبل pipetting صعودا وهبوطا وضعت على الجليد.
- على الفور، وحماية المحللة من الضوء من خلال تغطية الأنابيب باستخدام رقائق القصدير واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد، فإنه لم يعد ضروريا لحماية المحللة من التعرض للضوء، لأن حماية المجموعات ثيول حرة لا رجعة فيه. - إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في قبل المبردة أعلى الجدول الطرد المركزي (13000 x ج، 4 درجات مئوية، 20 دقيقة).
- تتوازن أعمدة غسيل الكلى في المخزن غسيل الكلى (الجدول 1) في الغرفة الباردة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء خطوة الطرد المركزي. استخدام عمود مع الوزن الجزيئي قطع من 10،000.
- إرفاق الأعمدة إلى عوامة تطفو ووضعها في كوب مملوء عازلة لغسيل الكلى. لضمان التحريك لطيف، واستخدام محرك مغناطيسي. لا تلمس الغشاء.
ملاحظة: Dialysوالأعمدة يمكن شراؤها أو تحضيرها من 1.5 مل أنابيب وفقا لبروتوكول صفها فيالا وزملاء العمل 19.
- إرفاق الأعمدة إلى عوامة تطفو ووضعها في كوب مملوء عازلة لغسيل الكلى. لضمان التحريك لطيف، واستخدام محرك مغناطيسي. لا تلمس الغشاء.
- إزالة الأعمدة من المخزن المؤقت لغسيل الكلى وعوامة تطفو. نقل لست] مسح في العمود غسيل الكلى استعداد من قبل pipetting دون لمس الغشاء. إرفاق الأعمدة إلى عوامة تطفو ووضعها مرة أخرى في دورق مملوء عازلة لغسيل الكلى.
- Dialyze المحللة في دورق يحتوي على عازلة لغسيل الكلى المثلج (الجدول 1) لا يقل عن 4 ساعة (أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها) في 4 درجات مئوية مع التحريك بعناية باستخدام محرك مغناطيسي. استخدام لا يقل عن 100 مل العازلة غسيل الكلى لالمحللة 200 ميكرولتر.
- نقل العينة dialysed في أنبوب 1.5 مل. إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول (13000 x ج، 4 درجات مئوية، 20 دقيقة). لمنع تفكك البروتين بلازميدة قليلة القسيمات تستمر المجمعات مع البروتوكول (القسم 2) مباشرة بعد غسيل الكلى. لا تجمدولست] المعدة.
2. الكهربائي
تم تنفيذ الكهربائي كما هو موضح من قبل مع بعض التعديلات 22: ملاحظة. في البروتوكول هو موضح أدناه، استخدمت مسبقة الصب المواد الهلامية التدرج (4-15٪ التدرج). بدلا من ذلك، المواد الهلامية يمكن أن تكون مستعدة في المختبر. من المهم جدا لاستبعاد أي عامل تغيير طبيعة مثل SDS لمنع تفكك المجمعات البروتين بلازميدة قليلة القسيمات. تم تحسين وقت الكهربائي لدول بلازميدة قليلة القسيمات مختلفة من البروتين MXA البشري. ومع ذلك، يمكن أن تختلف عن غيرها من البروتينات، وهذا يتوقف على حجم مجمع بلازميدة قليلة القسيمات فضلا عن مجموعة من الانفصال التي من المفترض أن يتحقق لتحليل مجمع. ولذلك، فإن الوقت الأمثل لالكهربائي وينبغي أن تحدد تجريبيا. لحل الأمثل للالأوليغومرات ليتم تحليلها وينبغي ألا يتجاوز التيار 25 أمبير.
- تجميع جل PAGE عدم تغيير طبيعة في غرفة هلام. ملء ركان الغرفة الداخلية والخارجية مع العازلة تشغيل قبل المبردة (الجدول 1).
- قبل تشغيل هلام مع العازلة تشغيل قبل المبردة في 25 مللي أمبير في هلام لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
- مزيج 15 ميكرولتر من لست] أعدت المذكورة أعلاه مع 5 ميكرولتر من عينة العازلة 4X (الجدول 1). لا تغلي العينة.
- تحميل 15 ميكرولتر من العينة ومستوى البروتين الأصلي من خيار في هلام. تشغيل هلام في 25 مللي أمبير لمدة 4 ساعة في غرفة باردة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: للحصول على التحليلات شبه الكمية، وبروتوكول البروتين الكمي (مثل برادفورد البروتين فحص 23) لا يمكن أن يؤديها من أجل ضمان تحميل من كميات متساوية من البروتين الكلي في الممر.
3. ويسترن وصمة عار
ملاحظة: هو موضح أدناه بروتوكول نظام صمة عار الغربي الرطب. أي غشاء النشاف يمكن استخدامها. تفعيل فلوريد البولي فينيل (PVDF) الأغشية في الميثانول بنسبة 100٪ قبل موازنة في النشاف BUFفر. تقنية لطخة غربية شبه الجافة يمكن استخدامها بدلا من ذلك، ولكن لابد الأمثل للمجمعات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة.
- تفكيك جل ونقل بعناية في عازلة SDS (الجدول 1).
- احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين يهز بلطف.
- إعداد 2 الإسفنج، 4 ورقة ورقة فلتر السليلوز وغشاء النشاف في هلام. نقع عليها في النشاف عازلة (الجدول 1).
- تجميع ساندويتش على النحو التالي (أسفل إلى أعلى): 1 الاسفنج، 2 السليلوز ورقة ورقة الترشيح، غشاء، هلام، 2 السليلوز ورقة ورقة فلتر، 1 الاسفنج.
- وضع شطيرة في خزان النشاف. تأكد من أن غشاء يواجه القطب الإيجابي في حين يواجه هلام القطب ناقص.
- ملء خزان النشاف مع العازلة النشاف قبل المبردة.
- وصمة عار في 90 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية حصول على أفضل النتائج نقل البروتين.
- تفكيك شطيرة وتصور مستوى بروتين التي يحتضنها الغشاء في Poncماء S حل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يزيل اللون الغشاء عن طريق غسل بعناية قبالة الشقائقية S مع الماء منزوع الأيونات حتى يمكنك أن ترى بوضوح الفرق في مستوى البروتين.
- بمناسبة عصابات من مستوى البروتين باستخدام القلم.
ملاحظة: المتبقية الشقائقية S يمكن أن تتداخل مع المناعية. لتجنب هذا، يمكن للغشاء مزيد destained التي كتبها حضانة في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 دقيقة وغسل لاحق مع الماء منزوع الأيونات. - منع الغشاء مع عازلة تمنع (انظر الجدول 1) لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تصور بروتين (ق) من الفائدة عن طريق المناعية باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد البروتين ليتم تحليلها.
ملاحظة: البروتين MXA البشري وتصور باستخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة المحددة لMX1 الإنسان المخفف 1: 1000 في عرقلة العازلة (الجدول 1). وقد حضنت الحل الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، وحيدة النسيلة لالمعهد القومي للاتصالات-MXA الأجسام المضادة (استنساخ 143) ويمكن استخدام (لا تظهر البيانات) 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام غير تغيير طبيعة-PAGE، قمنا بتحليل الدولة بلازميدة قليلة القسيمات من النوع البري البشري MXA، ومثنوي المسوخ واجهة MXA (R640A) وMXA (L617D)، فضلا عن واجهة أحادى الطور MXA (M527D) من الخلية لست] 12. كانت هي lysed الخلايا في العازلة التي تحتوي على 1٪ octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) وiodoacetamide لضمان ذوبان البروتين وحماية الفئات ثيول مجانية (انظر الشكل 1). كما هو موضح من قبل، تم إزالة الملح والأيض الصغيرة عن طريق غسيل الكلى 19. وجرى فصل البروتين بها PAGE عدم تغيير طبيعة. لتسهيل النشاف الغربي كفاءة، وحضنت هلام العازلة SDS قبل النشاف. وتصور البروتينات MXA بواسطة المناعية باستخدام الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل الموجهة ضد MXA. ووصف سير العمل في الشكل 2.
المقارنة بين دولة بلازميدة قليلة القسيمات من الذاتية البروتين MXA البشري من الإنترفيرون α . خلايا A549 حفز، نحن transfected خلايا فيرو (تفتقر الذاتية MXA) مع wildtype المؤتلف، أحادى ومثنوي المتغيرات MXA. هذه النوع البري المؤتلف، المتغيرات أحادى ومثنوي MXA تشكيل tetramers مستقرة، أحادية وdimers، على التوالي، بالمقارنة مع علامة البروتين الأم غير ملوثين (الشكل 3A). ولذلك، فإننا استخدام هذه البروتينات المؤتلف لتقييم حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA الإنسان الذاتية المستمدة من الإنترفيرون α حفز خلايا A549. الشكل 3B يكشف أن حجم MXA في لست] من خلايا A549 تحفيز الإنترفيرون α-يتوافق مع tetramer.
معا، نحن تصف طريقة لتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA البشري من المحللة الخلية. ويمكن أيضا أن نهجنا PAGE عدم تغيير طبيعة-أن تستخدم لتقييم حالة بلازميدة قليلة القسيمات من المجمعات البروتين بلازميدة قليلة القسيمات أخرى.
83 / 54683fig1.jpg "/>
الشكل 1: هيكل ورد فعل مخطط iodoacetamide Iodoacetamide لا رجعة فيه تحمي مجموعة ثيول من cysteins المجاني عن طريق تشكيل السندات أثير ثيولي. هذا مستقرة النتائج التعديل من استبدال محب النواة من اليود مع ذرة الكبريت من سياستين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل الرسم من الصفحة غير تغيير طبيعة-A التمثيل المنهجي للنهج PAGE عدم تغيير طبيعة من الخلية لست]. خلال تحلل الخلية، المنظفات إذابة البروتينات وجماعات ثيول محمية من قبل iodoacetamide لمنع تراكم البروتين. غسيل الكلى يزيل الأيض والأملاح الصغيرة التي يمكن أن تتداخل مع غير تغيير طبيعة PAGE
الشكل (3): تحديد ولاية بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين MXA البشري باستخدام PAGE عدم تغيير طبيعة والغرب النشاف (A) المؤتلف MXA المتغيرات أعرب ectopically في خلايا الفيرو. المجمعات من النوع البري MXA (tetramer) المسوخ واجهة MXA (R640A)، MXA (L617D) (dimers) وMXA (M527D) تهاجر في الأوزان الجزيئية المتوقعة منها، مؤكدا دولتهم بلازميدة قليلة القسيمات. وحفز (ب) خلايا A549 مع 1000 وحدة دولية لكل مل من الإنترفيرون α للحث على التعبير MXA. وش MXA الذاتيةالدودة الحلزونية الفرقة التي تتطابق مع شكل رباعي القسيمات. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم عازلة | محتوى | تعليقات | ||
| تحلل العازلة | 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl 2، 100 iodoacetamide ميكرومتر، 50 ملي ناف، 1 ملم نا 3 VO 4، 1٪ NP-40، 50 ملي β-سكرولي، 1 قرص لكل 50 مل تحلل عازلة من EDTA مجانا، كوكتيل مثبط البروتياز | إضافة iodacetamide، ناف، نا 3 VO 4، octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40)، β-سكرولي والبروتيني inhibiتور حق كوكتيل قبل تحلل الخلية Iodacetamide غير حساسة للضوء وغير مستقر في حين حل. منع التعرض للضوء وتذوب الحق قبل الاستخدام. | ||
| عازلة غسيل الكلى | 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ CHAPS، 0.5 ملي DTT | CHAPS يمكن raplaced بواسطة المنظفات غير تغيير طبيعة أخرى | ||
| عازلة تشغيل | 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.3)، 192 ملي الجلايسين، 0.1٪ CHAPS، 0.5 ملي DTT | في الرقم الهيدروجيني 8.3، واتهم سلبا على معظم البروتينات. ومع ذلك، من أجل البروتينات الأساسية، ينبغي أن تستخدم درجة الحموضة الحمضية. خلاف ذلك، سيتم تشغيل البروتينات في الاتجاه المعاكس، وسوف تضيع. يمكن استبدال CHAPS بواسطة المنظفات غير تغيير طبيعة أخرى | ||
| عينة العازلة | 310 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH6.8)، 0.05٪ أزرق برموفينول، 50٪ الجلسرين | |||
| العازلة SDS | 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.3)، 192 ملي الجلايسين، 0.1٪ SDS | |||
| عازلة النشاف | 25 ملي تريس، 192 ملي الجلايسين، 20٪ ميثانول | للمجمعات كبيرة جدا، الميثانول يمكن ommitted | ||
| عازلة تمنع | 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة) 150 مم كلوريد الصوديوم 0.05٪ توين 20 مسحوق الحليب 5٪ | |||
| متوسطة النمو | متوسطة Dulbecco لتعديل 1X البنسلين / الستربتوميسين 2 مم الجلوتامين 10٪ الجنين العجل المصل | |||
الجدول 1: المخزن المؤقت وصفات المطلوبة لPAGE عدم تغيير طبيعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف طريقة بسيطة التي تسمح بتحديد السريع للدولة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات التي PAGE عدم تغيير طبيعة-يليه تحليل لطخة غربية. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن الدولة بلازميدة قليلة القسيمات من بروتين معين يمكن تحديده من لست] خلية كاملة دون تنقية البروتين السابقة. قد يكون هذا هاما للبروتينات التي oligomerize أو ممارسة وظيفتها بالاشتراك مع عوامل مساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتينات لا تزال في حالتها الأصلية، وإذا استخراج مزيد من هلام، والنشاط الأنزيمي أو وظائف البروتين أخرى يمكن تحديدها وربطها الدولة بلازميدة قليلة القسيمات.
وثمة جانب بالغ الأهمية من هذا البروتوكول هو اختيار المنظفات أثناء إعداد العينات. ولهذا الأمر أهمية خاصة بالنسبة للبروتينات المرتبطة الأغشية الخلوية. يبدو MXA أن يرتبط في المقام الأول مع أغشية الشبكة الإندوبلازمية الملساء 25 19 وجود 0.1٪ 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] كان مطلوبا -1-propanesulfonate (الفصول) لمنع ترسب MXA خلال هلام الكهربي. وبالإضافة إلى ذلك، لا CHAPS لا تتدخل في النشاط الأنزيمي MXA على النحو الذي تحدده مع تنقية البروتين MXA المؤتلف وأعرب في E. القولونية 12. ومن الأهمية بمكان أن المنظفات لا تفسد البروتينات أو يعطل تفاعلات البروتين البروتين خلال تحلل. المنظفات تغيير طبيعة غير مثل NP40، Octoxinol 9، ديجيتونين وCHAPS هي مناسبة للذوبان. ينبغي تحديد اختيار المنظفات وتركيزه تجريبيا. المنظفات قد تؤثر أيضا على التجارب المصب على سبيل المثال لبعض المقايسات المنظفات يجب أن يكونإزالة الذي يتحقق بسهولة مع CHAPS من غسيل الكلى، ولكن ليس مع Octoxinol 9 26.
منذ الطريقة الموصوفة تحليل البروتينات المستمدة من الخلية لست] في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، لا يحتاج تنقية مسبقة من البروتينات. هذه هي ميزة منذ تنقية البروتينات المؤتلف يتطلب أحيانا أمثل العازلة من خلال إضافة الأملاح العالية وإضافات أخرى لمنع البروتين من تجميع أو هطول الأمطار. ومع ذلك، هذه المضافات وتركيزات عالية من الملح قد يكون لها تأثير على oligomerization من البروتين الذي قد لا تشبه بالضرورة حالته الطبيعية. لا سيما في حالة من البروتين MXA البشري، وتركيز الملح وجود النيوكليوتيدات تلعب دورا حاسما في تشكيل الدول بلازميدة قليلة القسيمات أعلى 27. في الخلية لست]، واستقرت البروتينات بسهولة أكبر لأن عوامل الاستقرار الخلوية لا تزال موجودة. ولذلك فمن الممكن تحليل العلاقات العامةالمجمعات otein في ظل الظروف الفسيولوجية المزيد من الخلايا (مثل تركيز الملح الفسيولوجية، ودرجة الحموضة). وينبغي أيضا أن يكون هذا البروتوكول ينطبق على غيرها من البروتينات تشكيل الأوليغومرات، على سبيل المثال لMXB أو dynamin 8 مرتبطة هيكليا.
جانب آخر مهم من البروتوكول هو حماية الفئات ثيول الحرة لمنع تشكيل جسور ثاني كبريتيد الاصطناعية للبروتينات هيولي خلال تحلل (الشكل 1). وأظهرت التجارب الأولية أن إضافة 1،4-dithiothreitol (DTT) أو β-mercaptethanol ليست كافية للحيلولة دون تشكيل السندات ثاني كبريتيد الاصطناعية خلال إعداد العينات. كلا الاختزال حماية مجموعة ثيول عكسية من تشكيل جسور ثاني كبريتيد. هذه الحماية عكسها قد لا تكون كافية لحماية جميع الفئات ثيول بشكل دائم. في حالة من البروتين MXA، وهذا يؤدي إلى تراكم لا رجعة فيه من البروتين. ومع ذلك، إضافة iodoacetamide أن irreversibly يحمي المجموعات ثيول خالية من cysteines تقلص إلى حد كبير تجميع البروتين MXA وعلاوة على ذلك، والعلاج iodoacetamide من لست] أعدت من MXA معربا عن خلايا الثدييات ليس له أي تأثير على النشاط GTPase من immunoprecipitated MXA بالمقارنة مع MXA من لست] تعامل مع التلفزيون الرقمي الأرضي (لا تظهر البيانات ).
اعتبارات هامة أخرى لتحديد الدقيق لعدد من protomers في قليل وحدات هي اختيار مجموعة تركيز بولي أكريلاميد وكذلك البروتين الجزيئية إشارة الوزن. وينبغي وضع مجموعة من تركيز بولي أكريلاميد أولا للسماح للفصل القصوى من العصابات في الجماهير الجزيئية المتوقعة من الأوليغومرات. لا يحتوي غير تغيير طبيعة-PAGE أي SDS. تفتقر SDS، التهمة، الكتلة الجزيئية وشكل البروتين يحدد حركيتها الكهربي. ولذلك، فإن اختيار علامة البروتين الوزن الجزيئي أمر بالغ الأهمية. من الناحية المثالية، فإن الوزن الجزيئي إشارة يكون ARشكل منقى ecombinant من البروتين في المصالح مع الدول بلازميدة قليلة القسيمات المعروفة. لأن هذا غير متوفر دائما، يجب استخدام غير التشويه والتحريف أو الأم البروتين علامة. حيث تبين MXA لربط مع البروتينات الخلوية الأخرى مثل UAP56 أو البروتينيات الفيروسية من Thogotovirus، لاكروس فيروس أو فيروس الأنفلونزا 12،28-30، ونحن اختبار أيضا المناعية باستخدام أجسام مضادة محددة سواء UAP56 أو الأنفلونزا A البروتين النووي ستشارك فى منفصلة مع MXA على المواد الهلامية غير تغيير طبيعة السلطة الفلسطينية. ومع ذلك لم نعثر على أي دليل لتشكيل MXA مغاير الأوليغومرات. وهذا ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن MXA-UAP56 والتفاعلات MXA-البروتين النووي هي من انخفاض تقارب 12،24. وعلاوة على ذلك، جزء من البروتين MXA ربط مع UAP56 أو البروتينيات الفيروسية قد تكون منخفضة للغاية وبالتالي يصعب اكتشافها بواسطة هذه الطريقة.
وعلاوة على ذلك، من المهم أن تأخذ في الاعتبار الباكاف الحمضية من البروتين ليتم تحليلها. في وصفها غير ديناتبروتوكول PAGE أورينغ، يتم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي في درجة الحموضة 8.3. وتحمل معظم البروتينات سلبا على هذا الرقم الهيدروجيني. ومع ذلك، والبروتينات الأساسية يحمل تهمة صافي إيجابي في الرقم الهيدروجيني 8.3، وبالتالي سوف تعمل في الاتجاه المعاكس. ونتيجة لذلك، من المهم، لتحليل البروتينات الأساسية لضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت تشغيل لضمان شحنة سالبة العام للبروتين.
معا نقدم هنا بروتوكول للتقييم السريع للدولة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات من دون الحاجة إلى تنقية سابقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC wear gloves and protect eyes |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 µl | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 µl/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1,000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10,000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
