Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Störningar av cirkulerande miRNAs i Irritable Bowel Syndrome detekteras med hjälp av en Multiplex hög kapacitet Gene Expression Platform

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54693

Abstract

Genuttryck plattform analysen möjliggör robust och mycket reproducerbar kvantifiering av uttrycket av upp till 800-transkript (mRNA eller miRNA) i en enda reaktion. Mirna analysen räknar transkriptioner genom direkt avbildning och digitalt räkna miRNA molekyler som är märkta med färgkodade fluorescerande streckkod probuppsättningar (en reporter sond och en infångningsprob). Streckkoder hybridiseras direkt till mogna miRNA som har långsträckta genom ligering av ett unikt oligonukleotidmarkör (miRtag) till 3'-änden. Omvänd transkription och amplifiering av transkripten är inte nödvändiga. Reportersonder innehålla en sekvens av sex färger positioner befolkade med användning av en kombination av fyra fluorescerande färger. De fyra färgerna över sex positioner används för att konstruera en gen-specifik färg streckkod sekvens. Post-hybridisering bearbetning är automatiserat på en robot prep station. Efter hybridisering överskjutande prober tvättas bort, och de trepartsstrukturer (infångnings provara-miRNA-reportersond) är fästa vid en streptavidin-belagd slid via biotinmärkt infångningsprob. Imaging och streckkod räkning sker med hjälp av en digital analysator. De immobiliserade streckkod miRNA visualiseras och avbildas med ett mikroskop och kamera, och de unika streckkoder avkodas och räknas. Data kvalitetskontroll (QC), normalisering och analys underlättas av en bearbetning och analys skräddarsydda uppgifter programvara som medföljer analysprogramvara. Analysen demonstrerar hög linjäritet över ett brett område av uttryck, samt hög känslighet. Prov och analys förberedelse inte innebär enzymatiska reaktioner, omvänd transkription, eller förstärkning; har några steg; och är till stor del automatiserad, vilket minskar utredare effekter och resulterar i hög koncentration och teknisk reproducerbarhet. Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik för att identifiera cirkulerande miRNA störningar i colon irritabile.

Introduction

Irritable Bowel Syndrome (IBS) är den vanligaste poli diagnos i Gastroenterology, drabbar 10-15% av befolkningen i allmänhet och representerar en betydande börda för hälso- och sjukvården. För närvarande finns det ingen allmänt accepterad diagnostiska biomarkörer för IBS (dvs. är diagnosen baserad på kliniska symptom och utesluta andra organiska sjukdomar, såsom GI malignitet, inflammatoriska tarmsjukdomar, och gastrointestinala (GI) infektioner). När man studerar genuttryck profiler i gemensamma villkor med subklinisk histopatologi, såsom IBS, hög känslighet och precision (reproducerbarhet) behövs, eftersom störningar i genuttryck profiler är ofta subtila 1-3. miRNA har identifierats som både diagnostiska och funktionella mål i IBS 4,5, och vi är särskilt intresserade av att bedöma deras användning som cirkulerande biomarkörer för IBS-associerade biologiska störningar 3,4,6,7. Den kliniska användningen av cirkulationsting biomarkörer är aktuellt på grund av den lätthet och minimalinvasiv karaktär insamlingen av biomarkörer "källa (t.ex. perifert blod) från patienter.

Genuttryck plattform analyser på grund av deras unika kemi och strömlinjeformad, mestadels automatiserat arbetsflöde ger en microarray plattform som ger brett och anpassnings täckning (800 mål i en enda reaktion) av transkriptom för målinriktad upptäckt. De ger också hög precision och linjäritet över ett brett spektrum av expressionsnivåer vid kvantifieringen av transcriptomic mål. Analysen kräver inte den omvända transkriptionen av RNA, amplifieringen av resulterande cDNA, eller andra enzymatiska reaktioner. Sålunda är potentiella fel som införs genom de höga cykelantal av amplifiering från RNA-species med låg förekomst eller sällsynta splitsvarianter minskas genom förfarandet av digital räkning. Detta innebär att ett stort antal olika provtyper, såsom renat totaltRNA (dvs mRNA + miRNA), RNA från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prover, såväl som rå vävnad och cell-lysat, kan användas med analyserna.

RNA av intresse detekteras med användning av ett par av prober (infångning och reportersonder), var och en innehållande en målspecifik sekvens som känner igen en motsvarande region på mål-RNA. För att säkerställa detektering av korta RNA (dvs., miRNA), är den mogna miRNA sekvensen långsträckt genom glödgning en unik oligonukleotidmarkör (miRtag) till 3'-änden av molekylen. En överbryggande oligonukleotid, som är komplementär till en del av både den mogna mål miRNA och miRNA-specifika miRtag, används för att säkerställa sekvensspecificitet. Avskiljning och reportersonder ligera till 3'- och 5'-ändarna av den mogna miRNA-miRtag komplex, respektive. Infångningsproberna har en biotinmärkning vid 3'-änden, som tillåter dem att fästa på ytan av en streptavidinbelagd glasskiva, Fixing infångningsproben-miRNA-miRtag-reporter sond komplexet till bilden. En elektrisk ström används sedan för att orientera den komplexa på glidytan, vilket tillåter fluorescerande streckkoder som bärs av reportern sond på 5'-änden som skall visualiseras med ett mikroskop och laddningskopplad anordning (CCD) kamera. Streckkoder räknas och avkodas, vilket gav en räkning av de specifika mål miRNA. Den fluorescerande streckkod består av sex positioner som kan upptas av en av fyra fluorescerande färger, som kan användas för att konstruera över 4000 färg streckkod kombinationer, varje kodar för en specifik RNA.

Provberedning (dvs RNA rening eller cell / vävnads lysat preparat), liksom hybridisering av infångnings och reportersonder, görs på bänken. Tolv prover kan multiplexeras på en enda bild. Efter hybridisering över natt, all ytterligare provberedning som utförs av en robot prep station. De laddade diabilder överförs sedan till annonsdigital analysator för avbildning, räkning, avkodning, och databehandling. De resulterande data som importeras till den bifogade programvaran, där de bearbetas ytterligare med en hög grad av användarkontroll. Den unika kemi, enkel beredning, automatiserad natur, enkel datatyp (räknas) och övergripande effektivt arbetsflöde för analysen underlättar hög precision genuttryck kvantifiering, vilket gör det till ett användbart verktyg för att studera cirkulerande miRNA uttryck profiler och underskrifter i funktionella förhållanden såsom IBS.

Protocol

Forskningen som beskrivs här godkändes av Institutional Review Board av National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).

1. Insamling av helblodprover

  1. Samla helblodsprover (2,5 ml) från studiedeltagare via venpunktion i blodprovsrör som innehåller en RNA stabiliseringslösning (möjliggör långtidslagring) och förvara dem vid -80 ° C tills RNA rening.

2. Total RNA Rening

  1. Tina och inkubera blodrören under 2 timmar, och sedan centrifugera dem med en swing-out-rotor under 10 minuter vid 5000 x g. Avlägsna supernatanten genom att försiktigt hälla eller pipettering den ut i en avfallsröret, försiktigt så att inte störa pelleten.
  2. Tvätta pelleten genom att tillsätta 4 ml RNas-fritt vatten, sätta tillbaka locket ordentligt och skaka tills pelleten synligt upplöst. Centrifug med hjälp av en svängrotor vid 5000 xg under 10 minuter och återflytta supernatanten, såsom beskrivs i steg 2,1.
  3. Lägg 350 pl BM1 buffert (medföljer) till pellets. Vortex pelleten tills den är synligt upplöst och överföra den till en 2-ml bearbetning rör för automatiserad total RNA-extraktion.
  4. Utför automatiserad rening av intracellulär RNA, inklusive miRNA, från helblod med användning av ett kommersiellt tillgängligt RNA-extraktion kit, som kan automatiseras på en robot RNA-extraktion systemet.
    OBS: Det automatiserade robotsystem vi använt kan bearbeta tolv prover vid en tid, och det tar tre timmar för RNA-reningsprotokoll för att slutföra.
    1. Ladda de förinstallerade pipettspetsar, centrifugrör, buffertar och reagens som finns i RNA-reningskit i robot RNA-extraktion systemet.
    2. Välj "Blood miRNA Del A" protokoll från protokollet menyval och starta körningen.
      OBS: Se kompletterande material för en beskrivning av de automatiserade rutiner.
    3. När roboten har completed del A i automatiserade miRNA reningsprotokoll, tömma avfallsbehållaren och ta bort de använda plast och reagensbehållare från robotsystemet.
    4. Stäng locken på alla mikro centrifugrör innehållande eluerade RNA och placera dem i shaker-adaptern. Välj "Blood miRNA del B" från protokollet valmenyn att inkubera proverna vid 65 ° C under 5 min.
    5. När roboten har avslutat kör del B i miRNA reningsprotokollet, omedelbart ta prover och kyla dem på is.
  5. Kvantifiera och utvärdera det renade RNA kvalitet med hjälp av en spektrofotometer.
    OBS: Per protokoll rekommendationer för miRNA analysen lägsta koncentration 33 ng / l krävs, och alla prover ska möta eller överträffa en 280/260 förhållandet mellan 1,9 och minst 260/230 förhållande av 1,8 för att säkerställa frånvaron betydande organiska föroreningar, som kan påverka analysens prestanda (se Referens 17).
  6. Förvara proverna vid -80 ° C

3. miRNA Provberedning

  1. Normalisera 12 RNA-prover till 33 ng / | j, l med användning av nukleasfritt vatten.
  2. Bered en 1: 500 utspädning av miRNA kontroller som föreskrivs i analyssatsen med användning av nukleasfritt vatten. Håll på is.
  3. Förbered glödgning Master Mix: kombinera 13 ul av glödgning buffert (medföljer), 26 pl miRtag reagens (medföljer), och 6,5 pl miRNA kontroller (som framställts i steg 3,2) med hjälp av 10- och 20-il pipetter.
  4. Med hjälp av en 10-l pipett, tillsätt 3,5 l av glödgning huvudblandning och 3 pl av prov-RNA (dvs 100 ng) till var och en av tolv 0,2 ml band rör. Flick att blanda, spinn ner med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg), och plats i termo (94 ° C under 1 minut, 65 ° C under 2 min, och 45 ° C under 10 minuter, håll vid 48 ° C) .
  5. Förbered ligering Master Mix genom att kombinera 3 μil av ligerings-buffert (som) och 19,5 | il av Polyetylenglykol (PEG; tillgänglig) med användning av en 20-l pipett. Tillsätt 2,5 | il av ligerings Master Mix till var och en av de band rören från steg 3,4 med användning av en 10-l pipett.
    1. Blanda försiktigt, centrifugera ner med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg), och återgå till termo vid 48 ° C under 5 min. Efter 5 min, under användning av en 10-l pipett tillsätts 1 | il ligas direkt till varje rör i termocykler och inkubera dem vid 48 ° C under 3 min, 47 ° C under 3 min, 46 ° C under 3 min, 45 o C i 5 min och 65 ° C 10 min; håll vid 4 ° C
  6. Ta bort rören från termocykler, blanda dem försiktigt, spinn ner dem med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg), och tillsätt 1 pl ligering sanering enzym (medföljer). Inkubera rören i termocykler (37 ° C i 1 h och 70 ° C under 10 min; håll vid 4 o
  7. Ta bort rören och med hjälp av en 100-l pipett, tillsätt 40 pl nukleasfritt vatten, blanda och centrifugera ner med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg).

4. miRNA Hybridisering

  1. Tina reportern och infångningsproben set (medföljer) på is och centrifugera ner dem med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg).
  2. Med användning av en 200-l pipett, tillsätt 130 | il hybridiseringsbuffert till reportern koduppsättning röret (130 | il) för att skapa hybridisering Master Mix. Blanda och centrifugera ner med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg).
    NOT: Reporter och fångar prober är specifika och standard för varje miRNA ingår i panelen. Anpassade paneler och användar utformad för avskiljning och probuppsättningar kan utformas.
  3. I 12 nya 0,2 ml band rör, tillsätt 20 pl av hybridisering Master Mix med hjälp av en 20-l pipett.
  4. Denaturera Mirna prover från steg 3,7 vid 85 ° C for 5 min och kyla dem på is. Tillsätt 5 | il till vart och ett av rören från steg 4,3 med användning av en 10-l pipett.
  5. Programmera termo till 65 ° C vid en 30-il volym beräknade temperatur och uppvärmt lock på evigt tidsinställning (inte programmera den att rampa ner till 4 ° C vid slutet av körningen).
  6. Med hjälp av en 10-l pipett, tillsätt 5 pl infångningsproben satt till varje rör, blanda, spinn ner med hjälp av en bänk mini mikro (2000 xg), och placera omedelbart i termo vid 65 ° C Inkubera under inte mindre än 12 timmar och inte mer än 30 h.

5. Prep Station och Digital Analyzer

  1. Ladda prep station.
    1. Öppna dörren stationen och ladda reagensplattorna (medföljer), patron (medföljer), pipettspetsar (medföljer), beredda prover i tolv 0,2 ml band rör och tolv tomma 0,2 ml band rör (medföljer). Ta bort remsan rörslock och reagensplatta lock. Stäng prep-stationendörren och köra lämplig analys från kontrollpanelen.
      OBS: Post-hybridisering bearbetning är densamma, oavsett analysen som körs. Alla reagens och plastvaror är färdigförpackade och kräver ingen förberedelse, annat än att föra dem till rumstemperatur och spinning ner reagensinnehållande 96-brunnar vid 2000 xg under 2 minuter. Alla komponenter är laddade i klart definierade positioner i prep station. Se kompletterande material för en beskrivning av de automatiserade rutiner.
  2. Visualisera och räkna streckkoder av de immobiliserade och orienterade trepartsavtal komplex.
    1. Ta ut patronen ur prep station, försegla den med täckglas som, och placera den i den digitala analysatorn i spåret ovanför kameraoptiken.
    2. Välj lämplig analys (miRNA panel analys) och analys version anges på analyssatsen och kör programmet.
      OBS: Den digitala analysator tar sedan synfält bilder för varje provposition ent fyra excitationsvåglängder, gör det möjligt för fluorescerande streckkoder för att läsas och avkodas. Specifika streckkoder, som svarar mot en specifik miRNA, räknas.
    3. Exportera datafiler till en USB eller direkt till servern via en internetlänk.

6. databehandling och analys

  1. Klicka på "Rådata" -fliken och välj "Import RCC filer". Välj den mapp som innehåller RCC filer (RAW-datafiler) från USB.
  2. Klicka på "Nästa", välj alla QC rutor, och klicka på "Importera".
  3. Klicka på "Den nya studien" -fliken. Namnge och beskriva studien och spara.
  4. I den nya studien, välj "Nytt experiment" -fliken och namn och beskriva nya experiment. Klicka på "Nästa" och välj RLF mappen från den vänstra rutan som innehåller de relevanta rå datafiler som har överförts. När det har valts, klicka på "Behåll vald", och klicka sedan på "Nästa".
  5. Lägg tillanteckningar om så önskas och klicka på "Nästa".
  6. Välj bakgrundssubtraktion metoden; antingen negativ kontroll, tom körfält subtraktion, eller en användardefinierad subtraktion kan väljas. När du har valt, klicka på "Nästa".
    OBS: Bestäm det lämpligaste sättet bakgrundskorrigering baserad på tekniska parametrar och biologiska sammanhang av studien.
    OBS: Räknar är mindre exakt för låg-överflöd mål. Vid tillämpningen av studien som beskrivs här, var data först behandlas utan bakgrundskorrigering för att undersöka QC parametrar och undersöka variation i räknas för miRNA olika förekomster över tekniska replikat. Uppgifterna har sedan bearbetas med hjälp av en 25-count bakgrundströskel.
  7. Välj "Top 100" normalisering, och klicka sedan på "Nästa".
  8. För att få de relationstal, välja bildparametrar, och klicka sedan på "Nästa".
  9. Klicka på "Kom".
  10. Klicka på den namngivna exexperimentera i vänstra rutan för att avslöja en rullgardinsmeny som innehåller "Raw", "normaliserad", "Grupperade", "relationstal" och "Analys data".
  11. Klicka på "Rådata" och observera en QC rapport i den högra rutan. Observera en flagga bredvid proverna som inte klarar standard QC parametrar. Bygga en ny "Study" som inte omfattar de flaggade prover och upparbeta såsom beskrivits, eller helt enkelt utesluta flaggade QC prover från dataanalys steg genom att välja "Uteslut prover från QC / normalisering flagga".
    1. Export "Raw", "normaliserad", eller "grupperade" datafiler i CVS eller annan kompatibel filformat för analys i en annan statistisk eller microarray programvara.
  12. Välj "normaliserade data" från den vänstra rutan och välj prover som skall ingå i analysen i den högra rutan.
  13. Klicka på "analys" och välj önskad analys (t.ex., "Heat Map & #34 ;, "violin Plot", "Box Plot", "Scatter Plot", eller "Histogram Plot"). Markera önskade uteslutningskriterier lådor (t.ex. utesluta utanförliggande prov eller gener, utesluta prover genom QC flaggor, utesluter styr gener och / eller utesluta normaliserings sönder från dataanalys).
  14. Välj enskilda prover som ska undantas från analys som önskas.
  15. Välj enskilda gener som skall undantas från eller ingår i analysen om så önskas.
  16. Välj parametrarna för den valda statistiska eller datavisualisering manipulation och klicka på "Finish".

Representative Results

Transcriptomic störning i funktionsstörningar kan vara subtil, och för att på ett tillförlitligt sätt upptäcka de subtila förändringar i uttryck, behöver kvantifiering av genuttryck för att vara exakt. Genuttryck plattform analyssystem reducerar teknisk buller genom sin högautomatiserad natur, och den unika kemi den använder ger hög precision genuttryck data. Teknisk replikat visas i figur 1 visar hög reproducerbarhet i både endogena (blå prickar) och viral miRNA (orange prickar, housekeeping-gener representeras av gula prickar) uttryck kvantifiering som är möjlig med denna metod. Med denna metod, virus (Figur 2a) och endogena (figur 2b) miRNAs som visar avvikelse från förväntad uttryck, som definierats av friska studiedeltagare, kan identifieras som mål av intresse i IBS. Det bör noteras att det är oklart huruvida de virala miRNAupptäcks här härrör från virusgener integrerade i det mänskliga genomet eller från virusmängd. Som analysen räknas bara mogna miRNA med enkel nukleotid specificitet, är det osannolikt korshybridisering med liknande endogena mänskliga miRNA. Ändå differential steady-state-nivåer av dessa molekyler är av intresse som biomarkörer. Precisionen av metoden tillåter störningar bland lågt uttryck mål som skall detekteras, så exakt detektering av dessa transkript inte översvämmas genom rikligare transkript. Subtila störningar kan också på ett tillförlitligt sätt observeras. Figurerna 3 och 4 visar en del av dessa störningar i cirkulerande miRNA i IBS och IBS-subtyper jämfört med friska kontroller, och figurerna 5 och 6 (båda anpassad från 3) visar de två mest signifikanta differentiellt förhöjda miRNA (Figur 5: miRNA 342-3p, Figur 6: miRNA 150). i IBS deltagarna figur 6 är ett exempel på den grafiska utmatningen från resultaten som genereras av den tillhörande programvaran.

Figur 1
. Figur 1: Normaliserade Räknar från två tekniska replikat teknisk replikat köras på två separata patroner visar hög linjär korrelation (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) över intervallet av den normaliserade (normaliserad till toppen 100 uttryckt miRNA) miRNA räkningar (log2 räknar på x- och y-axeln). Den spridningsdiagram inkluderar data för endogena humana miRNAs i blått (654 miRNA), endogena virala miRNA i orange (80 miRNA) och housekeeping-gener i gult (8 gener). Endogena virala miRNA fanns på tidigare versioner av analysen (version 1.4 användes här), men som inte längre ingår i standardanalysen, även om de är tillgängliga som anpassade tillägg./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Normaliserade räkningar av Viral och Endogenous Human miRNA i IBS-förstoppning (IBS- C) kontra friska kontroller Perturbations i (a) virala (orange) och (b) endogena humana miRNA (blå) är uppenbara i detta exempel, där miRNA räknas (log2 trans) av IBS-C deltagare (y-axel) är regredierat mot miRNA räknas (log2 trans) friska kontroller (x-axeln). Majoriteten av miRNA uttryck på samma sätt i båda populationerna, men några särskilt avvika från korrelationen. Dessa avvikelser är uppenbara bland både sällsynta och rikligt uttryckta mål. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. MiRNA avsevärt och enhetligt differentiellt uttryckta i IBS jämfört med friska kontroller differentiellt uttryckt miRNA i IBS avslöjas med hjälp av linjär diskriminantanalys effektstorlek metod, som kombinerar test av statistisk signifikans med kontroller för enhetlighet inom kategorierna. Klicka här för att en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. MiRNA avsevärt och enhetligt differentiellt uttryckta i IBS subtyper jämfört med friska kontroller miRNA var differentially uttryckt i IBS-subtyper (D: diarré, -C: förstoppning). jämfört med friska kontrollpersoner med hjälp av linjär diskriminantanalys effektstorlek metod, som kombinerar test av statistisk signifikans med kontroller för enhetlighet inom kategorierna Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Differentiellt uttryck av miRNA-342-3p Kronisk buksmärta av okänd etiologi är en huvud symptom på IBS. Rutan Diagrammet visar att MIR-342-3p (normaliserade räknas på y-axeln), en miRNA i samband med kronisk smärta i urinblåsan av okänd etiologi, befanns vara närvarande i omlopp i högre räknas i alla IBS subtyper jämfört med friska kontrollpersoner. Staplarna representerar icke-avvikande intervall, lådanes mellan kvartilen område och den blå rutan median räkningen. Modifierad från 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: differentiellt uttryck av miRNA-150 en fiol diagram som visar att IBS deltagarna hade signifikant högre cirkulerande miR-150 räknas jämfört med friska kontroller (log2 trans räknar på y-axeln).. Kurvorna visar frekvensen av räkningar i kategorin, de vertikala staplarna representerar den 1: a och 3: e kvartil och den röda fyrkanten indikerar median räkningen. Modifierad från 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Kritiska steg i protokollet

För miRNA analys i synnerhet är det viktigt att inte använda orenade lysat (dessa kan användas i mRNA och proteinanalyser), eftersom reagenserna inte har optimerats för användning med lysat, och provberedning reaktioner kan komma att hämmas. Dessutom kontaminanter som överförts från lysering och RNA-reningssteg (t.ex. guanidiniumsalter föreningar, etanol, och fenoler) kan hämma ligerings- och provreningsreaktioner. God kvalitet RNA är därför avgörande för känsligheten och noggrannheten hos miRNA analysen.

Med hjälp av en termo med en uppvärmd lock är avgörande för att säkerställa en korrekt temperaturkontroll för att optimera prestanda för alla reaktionssteg. Under steg 3.5.1, är det viktigt att inte ta bort remsorna från termo för att hålla temperaturen under tillsatsen av ligas. Ta bort remsorna att lägga ligaskommer att kompromissa reaktionen. När du utför hybridiserings steg, är det viktigt att undvika kraftig skakning, pipettering, eller snärta vid blandning reagens i rören, eftersom detta kan klippa reportersonder. För att säkerställa optimal prestanda och konsekvens, är det viktigt att blanda reagens i rören genom försiktig rulla. snurra alltid ner reaktioner efter blandning, och använda en ny pipettspets varje gång ett reagens dispens att säkerställa korrekt pipettering och för att undvika oavsiktlig korskontaminering.

Ändringar och felsökning

De koduppsättningar kan anpassas till att omfatta endast mål av intresse. På detta sätt kan kostnaderna balanseras för att möjliggöra testning av stora provmängder när ytterligare utredning eller validering av en bio-signatur. Anpassade prober kan utformas för gener eller mål inte är tillgängliga från à la carte-meny. Känslighet för mindre rikliga mål eller låg koncentration RNA kan varamanipuleras genom att tillåta en längre hybridisering tid och / eller genom att använda högre upplösning digital räkning.

I vår studie har vi använt den fördefinierade 800 mål miRNA panel med total RNA från helblod; dock kan analyserna anpassas till att omfatta färre miRNAs om det behövs en mer målinriktad strategi. Sammanlagt 24 prover kan framställas på en enda dag, förskjutna i två uppsättningar av 12, eftersom två patroner kan bekvämt föras genom efter hybridisering bearbetning på robot prep stationen och avbildas på den digitala analysatorn nästa dag. Staggered bearbetning av proverna i satser av 12 är viktigt att standardisera hybridisering tiden. Patroner som har avbildade kan sparas och lagras vid 4 ° C till skannas in på nytt om dataanalyser tyder på att en högre skanningsupplösning kan förbättra upptäckten av sällsynta miRNA. Detektion av sällsynta molekyler kan också förbättras genom hybridisering prover för längre; kan dock långvarig hybridisering Result i övermättnad och kan bara förbättra resultat om start RNA koncentrationerna är låga (som i extracellulärt blås härledda RNA). Plattformen känslighet och precision tillåter relativt låg överflöd miRNA tillförlitligt räknas.

Begränsningar av tekniken

Den beskrivna genuttryck analysplattform rymmer endast upp till 800 mål per matris. Det är därför inte lämpade för hela miRNA-transkriptom / hela transkriptom studier. Endast kända, beskrivna och angivna mål kan detekteras med hjälp av plattformen, så det är inte lämpade för upptäckten av nya molekylära arter. Andra metoder, såsom RNASeq eller andra traditionella microarray metoder, är mer lämpade för hela transkriptom förberedande studier.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

IBS karaktäriseras av en kombination av symptom, principally inklusive buksmärtor, visceral överkänslighet; och förändringar i tarmvanor, såsom ofta diarré, förstoppning, eller en kombination av båda 9,10. IBS symtom har ingen känd organisk orsak, och patienter inte uppvisa kliniskt signifikant inflammation, histopatologiska störningar av gastrointestinala vävnader eller system markörer 9-12. Forskning tyder på att den biologiska dysreglering i IBS är subtil, subklinisk och heterogen, med gemensamma teman framväxande runt inflammation och immunförsvar 10. Därför behövde vi för att kontrollera försöks introducerade variation och använder en plattform som kunde tillförlitligt detektera subtila störningar i genuttryck. De unika egenskaperna hos analysen och systemet standardisera urval bearbetning och minska försökshantering genom automatisering, minska tekniska varians att producera mycket reproducerbara data. Dessa funktioner gör det möjligt för fokuserade undersökningar och producerar mycket exakt och replicable data. Detta gör det möjligt för detektion av subtila störningar och störningar bland låg-expressions mål som kan förbises eller översvämmas av signalerna i rikligare mål när man använder intensity- eller amplifierings-baserade metoder. PCR-baserade microarrays och RNAseq metoder är livskraftiga alternativ till användning av den beskrivna plattformen och kan vara attraktiva som alternativ när högre genomströmningar som krävs eller när syftet är att karakterisera hela transkriptom eller att leta efter nya molekyler. Emellertid kan alternativen inte fungerar lika bra i noggrant och känsligt att detektera och kvantifiera sällsynta mål och subtila störningar.

Framtida tillämpningar eller riktningar efter Mastering denna teknik

Cirkulerande miRNA uttryck i IBS deltagarna visade ett antal störningar som konstaterades vara både betydande och konsekvent inom kategorierna. De identifierade miRNAs var förknippade med relevant pathways och patologiska tillstånd, inklusive en funktionell smärttillstånd (MIR-342-3p: kronisk smärta i urinblåsan) 8 och inflammation (MIR-150) 13. Exemplet Studien bygger på en förberedande kohort används för att definiera mål och system av intresse. Ett mer målinriktat, mindre miRNA array konstruerades sedan, sänka per prov kostnaden och möjliggör mycket större kohorter som skall analyseras i ett kostnadseffektivt sätt för att validera och förfina signaturer och biomarkörer. Genuttryck plattform analyssystem skapar en balans mellan det traditionella förberedande karaktär microarray och mer riktade, hypotesdriven datainsamling att förfina och testa molekylära signaturer och biomarkörer 14-16. Den metod som ska användas för att undersöka molekylära och protein störningar i in vivo och in vitro-modeller där de beskrivna mål miRNA är experimentellt överuttrycks eller hämmas. Nya analyser tillåter samtidig kvantifiering av mRNA och proteins direkt från cell- och vävnads lysat. Genom att optimera reningen av specifika fraktioner av perifert blod och avföring (t.ex. urin) och genom att anpassa och optimera vissa analysparametrarna, molekylära profiler och underskrifter låga fraktioner molekylär koncentration (t.ex. exosomal fraktioner) kommer att undersökas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nCounter Prep-Station Nanostring N/A Essential
nCounter Digital Analyzer Nanostring N/A Essential
Spectrophotometer NanoDrop ND-1000 Can use suitable equivalent
Centrifuge Any N/A Can use suitable equivalent
MiniMicroCentrifuge Any N/A Can use suitable equivalent
Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) Any N/A Can use suitable equivalent
Qiacube Qiagen 9001292 Can use suitable equivalent
PAXgene Blood miRNA Kit Qiagen 763134 Can use suitable equivalent
PAXgene Blood Tubes VWR 77776-026 Can use suitable equivalent
nCounter Human miRNA Assay Kit Nanostring 150625 Essential
nCounter Master Kit Nanostring 100050 Essential
nSolver Nanostring N/A Essential

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
  2. Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
  3. Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
  4. Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
  5. Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
  6. Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
  7. Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
  8. Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
  9. Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
  10. Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
  11. Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
  12. Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
  13. Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
  14. Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
  15. Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
  16. Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
  17. nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).

Tags

Genetik Irritable Bowel Syndrome MicroRNA Multiplex analys Gene Expression Cirkulerande microarray high-throughput screening molekylär streckkod
Störningar av cirkulerande miRNAs i Irritable Bowel Syndrome detekteras med hjälp av en Multiplex hög kapacitet Gene Expression Platform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fourie, N. H., Peace, R. M., Abey,More

Fourie, N. H., Peace, R. M., Abey, S. K., Sherwin, L. B., Wiley, J. W., Henderson, W. A. Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform. J. Vis. Exp. (117), e54693, doi:10.3791/54693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter