Abstract
منصة فحص التعبير الجيني يسمح لتقدير قوة وتكرار للغاية للتعبير عن ما يصل الى 800 محاضر (مرنا أو miRNAs) في رد فعل واحد. فحص ميرنا بحساب النصوص عن طريق التصوير مباشرة والعد رقميا جزيئات ميرنا التي وصفت مع الفلورسنت مجموعات التحقيق barcoded مرمزة (التحقيق الصحفي والتحقيق القبض). وتهجين الباركود مباشرة إلى أن تنضج miRNAs التي تم ممدود من ligating علامة النوكليوتيد فريدة (miRtag) إلى نهاية 3 '. ليس مطلوبا من النسخ العكسي والتضخيم من النصوص. تحقيقات مراسل تحتوي على سلسلة من ستة مواقع اللون بالسكان باستخدام مزيج من أربعة ألوان الفلورسنت. وتستخدم أربعة ألوان أكثر من ستة مواقع لبناء تسلسل اللون الباركود جين معين. هو الآلي معالجة ما بعد التهجين على محطة الإعدادية الروبوتية. بعد التهجين، يتم غسل تحقيقات الزائدة بعيدا، والهياكل الثلاثية (التقاط المواليةيكون ميرنا-مراسل يتم إصلاحها التحقيق) إلى شريحة streptavidin المغلفة عبر التقاط التحقيق المسمى البيوتين. ويتم التصوير والباركود العد باستخدام محلل رقمي. وتصور لmiRNAs barcoded يجمد والتقط باستخدام المجهر والكاميرا، ويتم فك الباركود فريدة من نوعها وعدها. ومما يسهل مراقبة الجودة البيانات (QC)، وتطبيع العلاقات، وتحليل من قبل معالجة البيانات مصمم خصيصا وبرامج التحليل الذي يصاحب برنامج الفحص. يوضح الفحص الخطي عالية على طائفة واسعة من التعبير، فضلا عن حساسية عالية. لا تنطوي على عينة وإعداد مقايسة التفاعلات الأنزيمية، النسخ العكسي، أو التضخيم. لديها خطوات قليلة. والآلي إلى حد كبير، والحد من الآثار المحقق ومما أدى إلى درجة عالية واستنساخ التقني. هنا، نحن تصف تطبيق هذه التكنولوجيا لتحديد تعميم الاضطرابات ميرنا في متلازمة القولون العصبي.
Introduction
متلازمة القولون العصبي (IBS) هو التشخيص للمرضى الخارجيين الأكثر شيوعا في الجهاز الهضمي، التي يعاني 10-15٪ من عامة السكان ويمثلون عبئا كبيرا على الخدمات الصحية. المؤشرات الحيوية التشخيصية حاليا، هناك مقبول عموما لIBS (أي، يستند التشخيص على الأعراض السريرية واستبعاد الاضطرابات العضوية الأخرى، مثل الورم الخبيث معهد جوته، والأمراض التهابية معي، والجهاز الهضمي (GI) العدوى). عند دراسة ملامح التعبير الجيني في ظروف مشتركة مع التشريح المرضي سريرية، مثل القولون العصبي، وحساسية عالية ودقة (استنساخ) هناك حاجة، واضطرابات في ملامح التعبير الجيني غالبا ما تكون خفية 1-3. وقد تم تحديد miRNAs كأهداف التشخيصية والوظيفية على حد سواء في IBS 4،5، ونحن مهتمون بشكل خاص في تقييم استخدامهم تعميم المؤشرات الحيوية للالمرتبطة IBS-الاضطرابات البيولوجية 3،4،6،7. استخدام السريري للcirculaالمؤشرات الحيوية تينغ هي من الفائدة الحالية نظرا لسهولة وطبيعة الغازية الحد الأدنى من مجموعة من مصدر المؤشرات الحيوية "(على سبيل المثال، الدم المحيطي) من المرضى.
الجينات منصة التعبير المقايسات، بسبب الكيمياء وفريدة من نوعها ومبسطة، وسير العمل الآلي في الغالب، وتوفير منصة ميكروأري أن يوفر تغطية واسعة وقابلة للتخصيص (800 أهداف في رد فعل واحد) من Transcriptome على لاكتشاف المستهدفة. كما أنها تعطي دقة عالية والخطي تغطي نطاقا واسعا من مستويات التعبير في القياس الكمي للأهداف transcriptomic. لا تتطلب الفحص والنسخ العكسي من الحمض النووي الريبي، والتضخيم من الناتج كدنا]، أو أي التفاعلات الأنزيمية الأخرى. وبالتالي، يتم تخفيض الأخطاء المحتملة التي أدخلها الأرقام دورة عالية من التضخيم من الأنواع RNA مع وفرة منخفضة أو المتغيرات لصق نادرة من عملية العد الرقمي. وهذا يعني أن مجموعة واسعة من أنواع العينات، مثل مجموع تنقيتهRNA (أي مرنا + ميرنا)، من الحمض النووي الريبي (FFPE) العينات الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين، وكذلك الأنسجة الخام والخلية لست]، ويمكن استخدامها مع المقايسات.
تم الكشف عن الرنا ذات الاهتمام باستخدام زوج من المسابير (القبض والتحقيقات مراسل)، كل منها يحتوي على سلسلة محددة الهدف الذي يعترف المنطقة المقابلة على الحمض النووي الريبي الهدف. من أجل ضمان الكشف عن الرنا قصيرة (أي miRNAs)، هو ممدود تسلسل ميرنا ناضجة من قبل والصلب علامة النوكليوتيد فريدة (miRtag) إلى نهاية 3 'من الجزيء. والنوكليوتيد سد كخدمة مجانية لجزء من كل من الهدف ناضجة ميرنا وmiRtag ميرنا محددة، ويستخدم لضمان تسلسل خصوصية. القبض على ومراسل تحقيقات ligate إلى 3 'و 5' تنتهي من مجمع ميرنا miRtag ناضجة، على التوالي. تحقيقات التقاط لديها التسمية البيوتين في نهاية 3 '، والتي تسمح لهم أن نعلق على سطح شريحة زجاجية streptavidin المغلفة، fixiنانوغرام القبض التحقيق ميرنا-miRtag-مراسل مجمع التحقيق إلى الشريحة. ثم يتم استخدام التيار الكهربائي لتوجيه المجمع على سطح الشريحة، مما يسمح الباركود الفلورسنت نقلته والتحقيق الصحفي على نهاية 5 'أن تصور باستخدام المجهر وجهاز اقتران الشحنة (CCD) الكاميرا. تحسب الباركود وفك، مما أسفر عن عدد من miRNAs مستهدفة محددة. يتكون الباركود الفلورسنت من ست المواقف التي يمكن أن يشغلها واحد من أربعة ألوان الفلورسنت، والتي يمكن استخدامها لبناء أكثر من 4000 تركيبات الألوان الباركود، كل الترميز لRNA محددة.
إعداد نموذج (أي تنقية RNA أو خلية / الأنسجة إعداد المحللة)، وكذلك التهجين من القبض على ومراسل تحقيقات، تتم على مقاعد البدلاء. اثنا عشر عينات يمكن المضاعفة على شريحة واحدة. بعد التهجين بين عشية وضحاها، وتنفيذ كافة تحضير عينة أخرى من قبل محطة الإعدادية الروبوتية. ثم يتم نقل الشرائح تحميل الإعلانمحلل igital للتصوير، والفرز، فك، ومعالجة البيانات. يتم استيراد البيانات الناتجة إلى البرامج المصاحبة لها، حيث يتم معالجتها مع مزيد من درجة عالية من التحكم المستخدم. كيمياء فريدة من نوعها، وإعداد بسيط، والطبيعة الآلي، نوع بيانات بسيطة (التهم)، وتبسيط العمل الشامل للفحص تسهيل عالية الدقة التعبير الجيني الكمي، مما يجعله أداة مفيدة في دراسة تعميم ميرنا ملامح التعبير والتوقيعات في ظروف وظيفية مثل القولون العصبي.
Protocol
وتمت الموافقة على البحوث وصفها هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من المعاهد الوطنية للصحة (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. جمع عينات الدم الكاملة
- جمع عينات الدم الكامل (2.5 مل) من المشاركين في الدراسة عن طريق بزل الوريد في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على محلول الحمض النووي الريبي استقرار (السماح للتخزين طويل الأجل)، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تنقية الحمض النووي الريبي.
2. الحمض النووي الريبي مجموع تنقية
- ذوبان الجليد واحتضان أنابيب الدم لمدة 2 ساعة، ثم الطرد المركزي عليها باستخدام الدوار أرجوحة خارج لمدة 10 دقيقة في 5000 ز س. إزالة طاف بصب بعناية أو pipetting لتشغيله في أنبوب النفايات، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
- يغسل بيليه بإضافة 4 مل من الماء ريبونوكلياز خالية، استبدال الغطاء بإحكام، ودوامة حتى يذوب بيليه واضح. الطرد المركزي باستخدام البديل الدوار دلو في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة وإعادةنقل طاف، كما هو موضح في الخطوة 2.1.
- إضافة 350 ميكرولتر من العازلة BM1 (المقدمة) لبيليه. دوامة بيليه حتى يتم حل واضح وتحويلها إلى أنبوب معالجة 2 مل لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي الآلي.
- أداء تنقية الآلي من الحمض النووي الريبي داخل الخلايا، بما في ذلك ميرنا، من الدم الكامل باستخدام المتاحة تجاريا عدة استخراج الحمض النووي الريبي، والتي يمكن أن يكون آليا على نظام استخراج الحمض النووي الريبي الروبوتية.
ملاحظة: إن النظام الآلي الآلي كنا يمكن معالجة اثني عشر عينات في وقت واحد، ويستغرق 3 ساعات لبروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي لإكمال.- تحميل قبل تحميلها نصائح ماصة، أنابيب الطرد المركزي، ومخازن، والكواشف المنصوص عليها في عدة تنقية الحمض النووي الريبي في نظام استخراج الحمض النووي الريبي الروبوتية.
- حدد البروتوكول "الدم ميرنا الجزء أ" من القائمة اختيار بروتوكول وبدء التشغيل.
ملاحظة: انظر المواد التكميلية لوصفا للإجراءات الآلي. - مرة واحدة وقد شارك الروبوتmpleted الجزء ألف من بروتوكول الآلي تنقية ميرنا، تفريغ وعاء النفايات وإزالة المواد البلاستيكية المستخدمة والحاويات الكاشف من النظام الآلي.
- إغلاق الأغطية على جميع أنابيب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مزال ووضعها في محول شاكر. حدد "الدم ميرنا الجزء B" من القائمة اختيار بروتوكول لاحتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- وبمجرد الانتهاء من الروبوت تشغيل الجزء باء من بروتوكول تنقية ميرنا، على الفور بإزالة العينات والبرد منهم على الجليد.
- Quantitate وتقييم نوعية RNA النقاء باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
ملاحظة: وفقا لتوصيات بروتوكول لفحص ميرنا، والحد الأدنى لتركيز 33 نانوغرام / مطلوب ميكرولتر، وينبغي لجميع عينات تلبي أو تتجاوز نسبة 280/260 من 1.9 والحد الأدنى 260/230 نسبة 1.8 للتأكد من عدم وجود التلوث العضوي الكبير، والتي يمكن أن تؤثر على أداء الفحص (يرجى الرجوع إلى مرجع 17). - تخزين العينات في -80 درجة مئوية.
3. ميرنا إعداد نموذج
- تطبيع 12 عينات الحمض النووي الريبي إلى 33 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام nuclease خالية من المياه.
- إعداد 1: 500 التخفيف من الضوابط ميرنا المنصوص عليها في عدة الفحص باستخدام nuclease خالية من المياه. الحفاظ على الجليد.
- تحضير مزيج الرئيسي الصلب: الجمع بين 13 ميكرولتر من العازلة الصلب (المقدمة)، 26 ميكرولتر من miRtag كاشف (المقدمة)، و 6.5 ميكرولتر من الضوابط ميرنا (المعد في الخطوة 3.2) باستخدام 10- والماصات 20 ميكرولتر.
- باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، إضافة 3.5 ميكرولتر من مزيج الصلب الماجستير و 3 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (أي 100 نانوغرام) إلى كل من اثني عشر أنابيب الشريط 0.2 مل. نفض الغبار إلى المزيج، وتدور باستمرار باستخدام microcentrifuge لالفوق مصغرة (2000 x ج)، ومكان في thermocycler (94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، و 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، عقد في 48 درجة مئوية) .
- تحضير مزيج الرئيسي ربط من خلال الجمع بين 3 μلتر من المخزن المؤقت ربط (المقدمة) و 19.5 ميكرولتر من البولي إثيلين جلايكول (PEG، قدم) باستخدام ماصة 20 ميكرولتر. إضافة 2.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي ربط إلى كل من أنابيب الشريط من الخطوة 3.4 باستخدام ماصة 10 ميكرولتر.
- المزيج بلطف، وتدور باستمرار باستخدام microcentrifuge لمصغرة الفوق (2000 x ج)، والعودة إلى thermocycler في 48 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، وذلك باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، إضافة 1 ميكرولتر من يغاز مباشرة إلى كل أنبوب في thermocycler واحتضان لهم في 48 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 47 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 46 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 45 س مئوية لمدة 5 دقائق، و 65 درجة مئوية مدة 10 دقيقة. عقد في 4 درجة مئوية.
- إزالة الأنابيب من thermocycler، مزجها بلطف، وتدور عليهم باستخدام microcentrifuge لالفوق مصغرة (2000 x ج)، وإضافة 1 ميكرولتر من انزيم تنظيف ربط (المقدمة). احتضان الأنابيب في thermocycler (37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، عقد في 4 س
- إزالة الأنابيب و، وذلك باستخدام ماصة 100 ميكرولتر، إضافة 40 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه، مزيج، وتدور باستمرار باستخدام microcentrifuge لمصغرة الفوق (2000 x ج).
4. ميرنا التهجين
- ذوبان الجليد مراسل ومجموعات القبض على التحقيق (المقدمة) على الجليد وتدور عليهم باستخدام microcentrifuge لمصغرة الفوق (2000 x ج).
- باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، إضافة 130 ميكرولتر من العازلة التهجين لمراسل أنبوب مجموعة الرمز (130 ميكرولتر) لإنشاء مزيج التهجين الرئيسي. مزيج وتدور باستمرار باستخدام microcentrifuge لمصغرة الفوق (2000 x ج).
ملاحظة: مراسل ويلتقط تحقيقات محددة وموحدة لكل ميرنا المدرجة في لوحة. لوحات مخصصة والقبض والتحقيق مجموعات مصممة المستخدم ويمكن تصميم. - في 12 أنابيب جديدة الشريط 0.2 مل، إضافة 20 ميكرولتر من مزيج التهجين سيد باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
- تفسد عينات ميرنا من الخطوة 3.7 في 85 درجة مئوية FOص 5 دقائق وتبريدها على الجليد. إضافة 5 ميكرولتر إلى كل من أنابيب من الخطوة 4.3 باستخدام ماصة 10 ميكرولتر.
- برنامج thermocycler إلى 65 درجة مئوية في درجة حرارة وغطاء ساخنة في الوقت الأبد وضع (لا البرنامج إلى منحدر أسفل إلى 4 درجة مئوية في نهاية المدى) محسوبة حجم 30 ميكرولتر.
- باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، إضافة 5 ميكرولتر من التحقيق القبض على تعيين كل أنبوب، مزيج، وتدور باستمرار باستخدام microcentrifuge لالفوق مصغرة (2000 x ج)، ووضع على الفور في thermocycler في 65 درجة مئوية. احتضان لمدة لا تقل عن 12 ساعة ولا تزيد عن 30 ساعة.
محطة 5. الإعدادية ومحلل الرقمية
- تحميل المحطة الإعدادية.
- فتح باب المحطة وتحميل لوحات كاشف (المقدمة)، خرطوشة (المقدمة)، نصائح ماصة (المقدمة)، وعينات مستعدة في اثنتي عشرة أنابيب الشريط 0.2 مل، واثني عشر الفارغة أنابيب الشريط 0.2 مل (المقدمة). إزالة قبعات أنبوب الشريط وغطاء لوحة كاشف. إغلاق محطة الإعداديةالباب وتشغيل الفحص المناسب من لوحة التحكم.
ملاحظة: معالجة مرحلة ما بعد التهجين هو نفسه، بغض النظر عن كونها المدى الفحص. جميع الكواشف والأواني البلاستيكية هي الجاهزة ولا تحتاج إلى إعداد، وغيرها من تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة والغزل أسفل لوحات 96-جيدا تحتوي على كاشف في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة. يتم تحميل كافة المكونات في وظائف محددة بوضوح في المحطة الإعدادية. انظر المواد التكميلية لوصفا للإجراءات الآلي.
- فتح باب المحطة وتحميل لوحات كاشف (المقدمة)، خرطوشة (المقدمة)، نصائح ماصة (المقدمة)، وعينات مستعدة في اثنتي عشرة أنابيب الشريط 0.2 مل، واثني عشر الفارغة أنابيب الشريط 0.2 مل (المقدمة). إزالة قبعات أنبوب الشريط وغطاء لوحة كاشف. إغلاق محطة الإعداديةالباب وتشغيل الفحص المناسب من لوحة التحكم.
- تصور والاعتماد على الباركود من المجمعات الثلاثية يجمد والمنحى.
- إزالة خرطوشة من محطة الإعدادية، وختم ذلك مع زلات غطاء المقدمة، ووضعه في المحلل الرقمي في فتحة فوق الكاميرا البصرية.
- حدد الفحص المناسب (ميرنا وحة الفحص) والإصدار فحص مبين على عدة فحص وتشغيل البرنامج.
ملاحظة: محلل رقمي ثم يأخذ مجال عرض الصور لكل عينة موقف لر أربع موجات الإثارة، والسماح للالباركود الفلورسنت يمكن ان تقرأ وفك. الباركود محددة، المقابلة لميرنا محددة، تحسب. - تصدير ملفات البيانات إلى USB أو مباشرة إلى الخادم عن طريق وصلة الإنترنت.
6. معالجة وتحليل البيانات
- انقر فوق علامة التبويب "البيانات الخام" واختر "استيراد مجلس قيادة الثورة الملفات". حدد المجلد الذي يحتوي على ملفات مجلس قيادة الثورة (ملفات البيانات الخام) من USB.
- انقر على زر "التالي"، حدد كافة خانات مراقبة الجودة، وانقر فوق "استيراد".
- انقر فوق علامة التبويب "دراسة جديدة". اسم ووصف الدراسة وحفظ.
- في الدراسة الجديدة، حدد "تجربة جديدة" علامة التبويب واسم ووصف تجربة جديدة. انقر على زر "التالي" وحدد المجلد RLF من الجزء الأيمن الذي يحتوي على ملفات البيانات الخام ذات الصلة التي تم تحميلها. مرة واحدة وقد تم تحديده، انقر على "إبقاء مختارة"، ثم انقر فوق "التالي".
- إضافةشروح إذا المطلوبة ثم انقر فوق "التالي".
- حدد طريقة خلفية الطرح؛ يمكن اختيار إما السيطرة السلبية، لم تحدد الطرح حارة، أو الطرح المعرفة من قبل المستخدم. مرة واحدة محددة، انقر فوق "التالي".
ملاحظة: تحديد نهج التصحيح خلفية الأنسب بناء على المعايير الفنية والسياق البيولوجي من الدراسة.
ملاحظة: التهم هي أقل دقة لأهداف وفرة منخفضة. لأغراض الدراسة وصفنا هنا، تمت معالجة البيانات لأول مرة دون تصحيح الخلفية من أجل دراسة معايير مراقبة الجودة ولدراسة التباين في التهم عن ميرنا من وفرة مختلفة عبر مكررات التقنية. ثم تعاد معالجة البيانات باستخدام عتبة خلفية 25 تهمة. - حدد "توب 100" التطبيع، ومن ثم انقر فوق "التالي".
- للحصول على البيانات النسبة، حدد المعلمات النسبة، ومن ثم انقر فوق "التالي".
- انقر على "انتهى".
- انقر على اسمه السابقملصقة في الجزء الأيمن لتكشف عن وجود قائمة منسدلة تحتوي على "الخام"، "تطبيع"، "المجمعة"، "نسبة البيانات"، و "تحليل البيانات".
- انقر على "البيانات الخام" ويلاحظ تقرير مراقبة الجودة في الجزء الأيسر. مراقبة علم المقبل للعينات التي لا تمر المعلمات مراقبة الجودة الافتراضية. بناء "دراسة" الجديدة والتي لا تشمل العينات التي ترفع علم وإعادة معالجة كما هو موضح، أو ببساطة استبعاد عينات ضبط الجودة التي يتم الإبلاغ عنها من خطوة تحليل البيانات عن طريق اختيار "استبعاد العينات من قبل مراقبة الجودة العلم / التطبيع".
- تصدير "الخام"، "تطبيع"، أو ملفات البيانات "المجمعة" في CVS أو شكل آخر ملف متوافق للتحليل في البرامج الإحصائية أو ميكروأري آخر.
- حدد "تطبيع البيانات" من الجزء الأيمن واختيار العينات ليتم تضمينها في التحليل في الجزء الأيسر.
- انقر على "تحليل" وحدد نوع التحليل المطلوب (على سبيل المثال، "هيت خريطة & #34 ؛، "الكمان مؤامرة"، "صندوق الأرض"، "مؤامرة مبعثر"، أو "الرسم البياني مؤامرة"). حدد خانات معايير الاستبعاد المطلوب (على سبيل المثال، استبعاد العينات النموذجية أو الجينات، واستبعاد العينات من قبل الأعلام مراقبة الجودة، واستبعاد الجينات السيطرة، و / أو استبعاد تحقيقات التطبيع من تحليل البيانات).
- اختيار عينات فردية لاستبعادها من التحليل على النحو المطلوب.
- تحديد الجينات الفردية سيتم استبعادها من أو تضمينها في التحليل كما تريد.
- حدد المعلمات للتلاعب إحصائي أو التصور البيانات المحددة وانقر على "إنهاء".
Representative Results
اضطراب Transcriptomic في اضطرابات وظيفية قد تكون خفية، ومن أجل الكشف عن موثوق تلك التغييرات الطفيفة في التعبير والكمي في التعبير الجيني يجب أن يكون دقيقا. نظام التعبير الجيني منصة فحص يقلل من الضوضاء التقني من خلال طبيعته الآلي للغاية، وكيمياء فريدة من نوعها أنه يستخدم تنتج بيانات التعبير الجيني عالية الدقة. التقنية مكررات هو مبين في الشكل 1 تدليل على استنساخ عالية في كل من الذاتية (النقاط الزرقاء) والفيروسية ميرنا (نقطة البرتقال، وتمثل الجينات التدبير المنزلي عن طريق النقاط الصفراء) التعبير الكمي التي من الممكن استخدام هذا الأسلوب. باستخدام هذه الطريقة، الفيروسي (الشكل 2A) والذاتية (الشكل 2B) miRNAs التي تظهر انحراف عن التعبير المتوقع، على النحو المحدد من قبل المشاركين في الدراسة صحي، يمكن حصرها في أهداف الفائدة في القولون العصبي. وتجدر الإشارة إلى أنه من غير الواضح ما إذا كان miRNAs الفيروسيةالكشف عن هنا تستمد من الجينات الفيروسية دمجها في الجينوم البشري أو من الحمل الفيروسي. كما فحص التهم فقط miRNAs ناضجة مع خصوصية-النووية المنفردة، التهجين الصليب مع مماثلة miRNAs الإنسان الذاتية من غير المحتمل. ومع ذلك، مستويات ثابتة للدولة التفاضلية من هذه الجزيئات هي التي تهم والمؤشرات الحيوية. دقة من الأسلوب يسمح للاضطرابات بين أهداف التعبير منخفضة ليتم الكشف عن، كما لا يتم اغراق كشف دقيق لهذه النصوص من قبل النصوص أكثر وفرة. ويمكن أيضا أن الاضطرابات خفية ملاحظتها بشكل موثوق. أرقام 3 و 4 تظهر بعض هذه الاضطرابات في تعميم miRNAs في الرابطة وIBS-فرعية مقارنة مع الاصحاء، وأرقام 5 و 6 (كلا مقتبس من 3) عرض اثنين من أهم miRNAs مرتفعة بشكل مختلف (الشكل 5: ميرنا 342-3p، الشكل (6): ميرنا 150). في المشاركين IBS الشكل 6 مثال على الناتج رسومية من النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج المرتبطة بها.
. الشكل 1: التهم تطبيع من اثنين مكررات التقنية الفنية مكررات تعمل على اثنين من خراطيش منفصلة تظهر علاقة خطية عالية (ص 2 = 0.90، ص = 1.03x - 0.4) على نطاق تطبيع (تطبيع لأكبر 100 شركة عبر عن miRNAs) ميرنا التهم (التهم log2 على X- ومحور y). وتشمل هذه المؤامرة مبعثر البيانات لmiRNAs الإنسان الذاتية في الأزرق (654 miRNAs)، miRNAs الفيروسية الذاتية باللون البرتقالي (80 miRNAs)، والجينات التدبير المنزلي في الصفراء (8 الجينات). كانت miRNAs الفيروسية الذاتية المتاحة على الإصدارات السابقة من الفحص (كانت تستخدم الإصدار 1.4 هنا)، ولكن لم يعد يتم إدراجها في الفحص القياسية، على الرغم من أنها متوفرة كإضافات المخصصة./54693fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التهم تطبيع الفيروسية والذاتية miRNAs الإنسان في IBS-الإمساك (IBS- C) مقابل الاصحاء الاضطرابات في الفقرة (أ) الفيروسي (البرتقال) و (ب) miRNAs الإنسان الذاتية (الأزرق) واضحة في هذا المثال، حيث وتراجع التهم ميرنا (تحولت log2) من المشاركين IBS-C (المحور الصادي) ضد التهم ميرنا (log2 تحويلها) من الاصحاء (محور س). معظم miRNAs تعبر بطريقة مماثلة جدا في كل من السكان، ولكن بعض تحيد خاصة من الارتباط. هذه الانحرافات واضحة بين كل من الأهداف النادرة وأعرب بوفرة. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): يتم بشكل ملحوظ وبشكل موحد تفاضلي أعرب miRNAs في IBS بالمقارنة مع الاصحاء وأعرب تفاضلي وكشف miRNAs في IBS باستخدام التمايز طريقة حجم تأثير التحليل الخطي، والذي يجمع بين الاختبارات ذات دلالة إحصائية مع الشيكات من أجل التناسق ضمن فئات. الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): يتم بشكل ملحوظ وبشكل موحد تفاضلي أعرب miRNAs في IBS الأنواع الفرعية بالمقارنة مع الاصحاء miRNAs كانت ديوأعرب fferentially في IBS-فرعية (-D: الإسهال، -C: الإمساك). مقارنة مع الاصحاء باستخدام التمايز طريقة حجم تأثير التحليل الخطي، والذي يجمع بين الاختبارات ذات دلالة إحصائية مع الشيكات من أجل التناسق ضمن فئات الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
الرقم 5: التعبير التفريقي للميرنا 342-3p آلام في البطن المزمن مجهول السبب هو عرض من أعراض القولون العصبي الرئيسي. معارض المؤامرة المربع الذي مير 342-3p (التهم تطبيع على المحور ص)، ميرنا المرتبطة آلام المثانة المزمن مجهول السبب، وجدت أن يكون حاضرا في الدورة الدموية في التهم أعلى في جميع أنواع فرعية IBS مقارنة مع الاصحاء. القضبان تمثل النطاق غير المنحرف، مربعوفاق نطاق بين الربع والمربع الأزرق العد المتوسط. تعديل من 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التعبير التفريقي للميرنا-150 مؤامرة كمان تبين أن المشاركين IBS زيارتها أعلى بكثير تعميم مير 150 تهمة مقارنة مع الاصحاء (log2 التهم تحولت على المحور ص). منحنيات تشير إلى تردد من التهم في هذه الفئة، وأشرطة عمودية تمثل الواحد 1 و 3 الربعية الثالثة، والساحة الحمراء ويشير عدد المتوسط. تعديل من 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
لفحص ميرنا على وجه الخصوص، فمن الأهمية بمكان عدم استخدام لست] غير المكرر (وهذه يمكن استخدامها في مرنا والمقايسات بروتين)، كما لم يتم الأمثل الكواشف لاستخدامها مع لست]، ومن المرجح أن تحول دون ردود فعل إعداد العينات. بالإضافة إلى ذلك، قامت الملوثات على من الخطوات تحلل والحمض النووي الريبي تنقية (على سبيل المثال، مركبات guanidinium، والإيثانول، والفينول) يمكن أن تحول دون ربط وتنقية العينة ردود الفعل. ذات نوعية جيدة RNA ولذلك بالغ الأهمية لحساسية ودقة الفحص ميرنا.
باستخدام thermocycler بغطاء ساخنة أمر بالغ الأهمية لضمان التحكم في درجة الحرارة المناسبة لتحسين أداء جميع خطوات التفاعل. خلال خطوة 3.5.1، فمن المهم عدم إزالة شرائح من thermocycler من أجل الحفاظ على درجة الحرارة خلال إضافة يغاز. إزالة شرائط لإضافة يغازلن نساوم على رد الفعل. عند تنفيذ الخطوات التهجين، فمن الأهمية بمكان لتجنب اهتزاز قوية، pipetting ل، أو عبها عند خلط المواد الكيميائية في الأنابيب، لأن هذا قد القص تحقيقات المراسل. لضمان الأداء الأمثل والاتساق، من المهم أن تخلط جيدا الكواشف في أنابيب من قبل عبها لطيف. تدور دائما إلى أسفل ردود الفعل بعد الاختلاط، واستخدام ماصة جديدة تنقلب كل مرة يتم فيها الاستغناء كاشف لضمان pipetting لدقيقة وتجنب عرضي انتقال التلوث.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
مجموعات رمز يمكن أن تكون مخصصة لتشمل أهدافا الوحيدة المثيرة للاهتمام. وبهذه الطريقة، والتكاليف يمكن أن تكون متوازنة للسماح لاختبار مجموعات عينة كبيرة عند مواصلة التحقيق أو التحقق من صحة التوقيع الحيوي. ويمكن تصميم تحقيقات مخصصة للجينات أو أهداف غير متوفرة من والانتقائي القائمة. حساسية للأهداف أقل وفرة أو الحمض النووي الريبي تركيز منخفض يمكن أن يكونالتلاعب من خلال السماح لفترة أطول التهجين و / أو باستخدام دقة عالية العد الرقمي.
في دراستنا استخدمنا 800 هدفا لوحة ميرنا محددة مسبقا مع الحمض النووي الريبي مجموع من الدم الكامل. ومع ذلك، يمكن أن تكون مخصصة لفحوصات لتشمل عددا أقل من miRNAs إذا كانت هناك حاجة إلى نهج أكثر استهدافا. ما مجموعه 24 عينة يمكن أن تكون على استعداد في يوم واحد، متداخلة في مجموعتين من 12، لأن اثنين من خراطيش يمكن بسهولة أن تنتقل من خلال معالجة ما بعد التهجين في المحطة الإعدادية الروبوتية وتصوير على تحليل رقمي في اليوم التالي. معالجة متداخلة من العينات على دفعات من 12 مهم لتوحيد وقت التهجين. الخراطيش التي تم تصويرها يمكن حفظ وتخزين عند 4 درجة مئوية لإعادة فحص إذا تشير تحليلات البيانات إلى أن قرار مسح العالي قد يحسن من الكشف عن miRNAs نادرة. ويمكن أيضا تحسين الكشف عن جزيئات أكثر ندرة من التهجين عينات لفترة أطول. ومع ذلك، قد بالنتيجه التهجين لفترات طويلةتي في oversaturation وقد يحسن نتائج إلا إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي ابتداء منخفضة (كما هو الحال في خارج الخلية RNA المستمدة من حويصلة). حساسية للمنبر والدقة تسمح نسبيا miRNAs-وفرة منخفضة لتحسب بشكل موثوق.
القيود المفروضة على تقنية
التعبير الجيني منصة فحص وصفه يستوعب فقط ما يصل الى 800 اهداف لكل صفيف. ولذلك لا مناسبة لمدة كله ميرنا Transcriptome على / دراسات Transcriptome على كلها. يعرف فقط، وصفها، ويمكن الكشف عن أهداف محددة باستخدام منصة، لذلك ليست مناسبة لاكتشاف الأنواع الجزيئية الجديدة. أساليب أخرى، مثل RNASeq أو غيرها من وسائل ميكروأري التقليدية، هي أكثر ملاءمة للدراسات استكشافية Transcriptome على كله.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
تتميز الرابطة من قبل مجموعة من الأعراض، طابعاتبما في ذلك cipally آلام في البطن. فرط الحساسية الحشوية. والتغيرات في عادات الأمعاء مثل الإسهال المتكرر، والإمساك، أو مزيج من الاثنين معا 9،10. أعراض القولون العصبي ليس لها سبب عضوي معروف، والمرضى لا تقدم مع التهاب هامة سريريا، الاضطرابات المرضية في أنسجة الجهاز الهضمي، أو علامات النظامية 9-12. وتشير البحوث إلى أن التقلبات البيولوجي في IBS هو خفية، تحت الإكلينيكي، وغير متجانسة، مع المواضيع المشتركة الناشئة حول الالتهاب والمناعة 10 وظيفة. لذلك، نحن بحاجة للسيطرة على الاختلاف، قدم مجرب واستخدام منصة التي كانت قادرة على الكشف بشكل موثوق الاضطرابات الطفيفة في التعبير الجيني. السمات الفريدة للفحص ونظام توحيد أسلوب تجهيز العينات وتقلل مجرب التعامل مع من خلال المكننة، وتقليل التباين الفني لإنتاج بيانات استنساخه للغاية. وتسمح هذه المزايا للتحقيقات مركزة وإنتاج عالية الدقة وRالبيانات eplicable. وهذا يسمح للكشف عن الاضطرابات واضطرابات خفية بين أهداف التعبير المنخفض التي يمكن التغاضي عنها أو اغراق إشارات من الأهداف أكثر وفرة عند استخدام intensity- أو القائم على التضخيم الأساليب. ميكروأرس PCR القائم وأساليب RNAseq هي بدائل قابلة للتطبيق لاستخدام منصة وصفها ويمكن أن تكون جذابة كبديل عندما يطلب الانتاجية العالية أو عندما يكون الهدف هو تميز Transcriptome على كامل أو للبحث عن جزيئات جديدة. ومع ذلك، بدائل قد لا تؤدي وكذلك في دقة وحساسية كشف وquantitating أهداف النادرة والاضطرابات الطفيفة.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
أظهر تعميم التعبير ميرنا في المشاركين IBS عدد من الاضطرابات التي تم العثور عليها على حد سواء كبيرة ومتناسقة ضمن فئات. ترافقت miRNAs التي تم تحديدها مع pathwa ذات صلةيس والحالات المرضية، بما في ذلك حالة وظيفية الألم (مير 342-3p: ألم المثانة المزمن) (8) والتهاب (مير-150) (13). واستندت الدراسة مثال على الفوج الاستكشافية تستخدم لتحديد الأهداف ونظم الفائدة. ثم شيد أكثر استهدافا، أصغر مجموعة ميرنا، وتخفيض في تكلفة العينة والسماح للأفواج أكبر من ذلك بكثير ليتم تحليلها بطريقة فعالة من حيث التكلفة من أجل التحقق من صحة وصقل التوقيعات والمؤشرات الحيوية. نظام منصة فحص التعبير الجيني توازنا بين طبيعة استكشافية التقليدية من ميكروأري وأكثر استهدافا، يحركها فرضية جمع البيانات لصقل واختبار التوقيعات الجزيئية والمؤشرات الحيوية 14-16. وسوف تستخدم هذه الطريقة لفحص اضطرابات الجزيئية والبروتين في الجسم الحي في ونماذج في المختبر حيث miRNAs الهدف وصفها هي تجريبيا الإفراط في التعبير عن أو مستعمل. فحوصات جديدة تسمح لتقدير وقت واحد من mRNAs وصroteins مباشرة من الخلية والأنسجة لست]. وعلاوة على ذلك، عن طريق تحسين تنقية الكسور محددة من الدم المحيطي والفضلات (على سبيل المثال، البول) وتخصيص وتحسين معايير معينة الفحص، وملامح الجزيئية وتواقيع منخفضة كسور التركيز الجزيئي (على سبيل المثال، والكسور exosomal) سيتم فحصها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
