Abstract
Genexpressie platform test maakt robuuste en zeer reproduceerbare kwantificering van de expressie van maximaal 800 transcripten (mRNA of miRNAs) in een enkele reactie. De miRNA test telt transcripten door direct beeldvorming en digitaal tellen miRNA moleculen die gelabeld zijn met een kleurcode fluorescerende barcode probe sets (een verslaggever sonde en een capture probe). Barcodes direct gehybridiseerd miRNAs die zijn verlengd door het ligeren van een unieke oligonucleotide tag (miRtag) naar het 3 'uiteinde rijpen. Reverse transcriptie en amplificatie van de transcripten zijn niet vereist. Reporter probes bevatten een sequentie van zes kleuren posities wordt gevuld door een combinatie van vier fluorescerende kleuren. De vier kleuren over zes posities worden gebruikt om een gen-specifieke kleur barcode sequentie te construeren. Post-hybridisatie verwerking geautomatiseerd op een robot prep station. Na hybridisatie, de overtollige sondes worden weggespoeld, en de tripartiete structuren (capture probe-miRNA-reporter probe) zijn bevestigd aan een met streptavidine beklede slide via de biotine-gelabelde vangprobe. Beeldvorming en barcode telling wordt gedaan met behulp van een digitale analyser. Het geïmmobiliseerde barcode miRNAs worden gevisualiseerd en afgebeeld met behulp van een microscoop en camera, en de unieke barcodes worden gedecodeerd en geteld. kwaliteit van de gegevens (QC), normalisatie, en de analyse worden gefaciliteerd door een speciaal ontworpen data verwerking en analyse software die de test software begeleidt. Het onderzoek toont hoge lineariteit over een groot bereik van expressie, evenals hoge gevoeligheid. Monster en test voorbereiding niet enzymatische reacties, reverse transcriptie, of versterking te betrekken; heeft enkele stappen; en is grotendeels geautomatiseerd, waardoor de onderzoeker effecten en resulteert in een hoge consistentie en technische reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de toepassing van deze technologie voor het identificeren circulerende miRNA verstoringen in prikkelbare darmsyndroom.
Introduction
Irritable Bowel Syndrome (IBS) is de meest voorkomende ambulante diagnostiek in Gastroenterology, treft 10 - 15% van de algemene bevolking en die een zware last op de gezondheidszorg. Op dit moment zijn er geen algemeen aanvaarde diagnostische biomarkers voor IBS (dat wil zeggen, is de diagnose op basis van klinische symptomen en het uitsluiten van andere organische aandoeningen, zoals GI maligniteit, inflammatoire darmziekten, en gastro-intestinale (GI) infecties). Bij het bestuderen van genexpressie profielen in normale met subklinische histopathologie, zoals IBS, een hoge gevoeligheid en precisie (reproduceerbaarheid) nodig zijn, zoals verstoringen in genexpressie profielen zijn vaak subtiel 1-3. miRNAs zijn geïdentificeerd als zowel diagnostische en functionele doelen in IBS 4,5, en we zijn vooral geïnteresseerd in de beoordeling van het gebruik ervan als circulerende biomarkers van IBS-geassocieerde biologische verstoringen 3,4,6,7. Het klinische gebruik van circulatieTing biomarkers is van lopende rente als gevolg van het gemak en de minimaal invasieve karakter van de collectie van de bron van de biomarkers '(bijvoorbeeld, perifere bloed) van patiënten.
Genexpressie platform assays, vanwege hun unieke chemische en gestroomlijnde, grotendeels geautomatiseerd workflow te microarray platform die breed en aanpasbare bereik (800 doelen in een enkele reactie) van de transcriptoom voor gerichte ontdekking biedt. Ze geven ook een hoge nauwkeurigheid en lineariteit over een breed spectrum van expressieniveaus in de kwantificering van transcriptoom doelen. De assay niet de reverse transcriptie van RNA, de amplificatie van cDNA verkregen, of andere enzymatische reacties vereisen. Aldus mogelijke fouten geïntroduceerd door de hoge cyclus aantal amplificatie van RNA species met lage abundantie of zeldzame splice varianten worden verminderd door de werkwijze van digitale tellen. Dit betekent dat diverse soorten monsters, zoals gezuiverd totaleRNA (mRNA miRNA +) RNA uit formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) specimens, evenals ruwe weefsels en cellysaten, kan worden gebruikt bij de assays.
RNA's van belang worden gedetecteerd met een paar proben (capture en reporter probes), die elk een doelwitspecifieke sequentie die een overeenkomstig gebied laat zien van het doel-RNA. Om de detectie van korte RNA's (dat wil zeggen miRNAs) waarborgen, is de rijpe miRNA sequentie verlengd door hybridiseren van een unieke oligonucleotide tag (miRtag) aan het 3'-uiteinde van het molecuul. Een overbruggen oligonucleotide, dat complementair aan een gedeelte van zowel de rijpe miRNA doelwit en het miRNA-specifieke miRtag wordt gebruikt om sequentiespecificiteit waarborgen. Vangen en reporter probes ligeren aan de 3 'en 5' uiteinden van het rijpe miRNA-miRtag complex, respectievelijk. De capture probes hebben een biotine label aan het 3 'uiteinde, waardoor zij hechten aan het oppervlak van een met streptavidine beklede glasplaatje, Fixing de capture probe-miRNA-miRtag-reporter probe complex aan de dia. Een elektrische stroom wordt dan gebruikt om het complex op het glijoppervlak oriënteren, zodat fluorescent barcodes door de reporter probe aan het 5 'uiteinde uitgevoerd worden gevisualiseerd met behulp van een microscoop en ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera. Barcodes worden geteld en gedecodeerd, waardoor een telling van het specifieke doel miRNAs. De fluorescerende barcode bestaat uit zes posities die worden ingenomen door een van de vier fluorescerende kleuren, die kan worden gebruikt om meer dan 4000 kleuren-barcode combinaties, elk codeert voor een specifiek RNA construct.
Monstervoorbereiding (dwz RNA zuivering of cel / weefsel lysaat preparaat), en hybridisatie van het vangen en reporter probes worden gedaan bij de bank. Twaalf monsters kunnen worden gemultiplexed op één dia. Na de overnachting hybridisatie, wordt alle verdere prepareren uitgevoerd door een robot prep station. De geladen objectglaasjes worden vervolgens overgebracht naar advertentieigitale analysator voor imaging, tellen, decoderen, en dataverwerking. De verkregen data worden ingevoerd naar de bijgaande software, waar ze verder worden verwerkt met een hoge gebruiksvriendelijkheid controle. De unieke chemie, eenvoudige bewerkingen, geautomatiseerde natuur, eenvoudig data type (tellingen), en de algehele gestroomlijnde workflow van de test te vergemakkelijken high-precision genexpressie kwantificeren, waardoor het een handig hulpmiddel bij het bestuderen van circulerende miRNA expressie profielen en handtekeningen in functionele aandoeningen zoals IBS.
Protocol
Het hier beschreven onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Het verzamelen van volbloed Samples
- Verzamel onbehandelde bloedmonsters (2,5 ml) van deelnemers via venapunctie in bloedafnamebuizen bevattende een RNA-stabiliserende oplossing (waardoor langdurige opslag) en bewaar ze bij -80 ° C tot RNA zuivering.
2. Totaal RNA Purification
- Ontdooi en incubeer de bloedbuisjes voor 2 uur en centrifugeer ze met een swingoutrotor gedurende 10 min bij 5000 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof door voorzichtig te gieten of pipetteren het af in een afval buis, zorg dat u de pellet te verstoren.
- Was de pellet door het toevoegen van 4 ml RNase-vrij water, veilig plaats de dop, en vortex tot de pellet zichtbaar is opgelost. Centrifuge met behulp van een swing-bucket rotor bij 5000 xg gedurende 10 min en opnieuwbeweeg de supernatant, zoals beschreven in stap 2.1.
- Voeg 350 ul van BM1 buffer (meegeleverd) op de korrel. Vortex de pellet tot het zichtbaar opgelost en overgebracht naar een 2 ml behandelingsbuis geautomatiseerde totale RNA-extractie.
- Geautomatiseerde zuivering van intracellulair RNA, inclusief miRNA, van het volbloed met behulp van een commercieel verkrijgbare RNA-extractie kit, die kan worden geautomatiseerd op een robot RNA extractiesysteem.
NB: De geautomatiseerde robotsysteem gebruikten we kunnen twaalf monsters tegelijk te verwerken, en het duurt 3 uur voor de RNA-zuivering protocol in te vullen.- Laad de pre-loaded pipetpunten, centrifugebuizen, buffers en reagentia die in de RNA zuivering kit in de robot RNA afzuigsysteem.
- Selecteer de "Blood miRNA Deel A" protocol van het protocol keuzemenu en start de run.
OPMERKING: Zie aanvullende materialen voor een beschrijving van de geautomatiseerde procedures. - Zodra de robot completed Deel A van de geautomatiseerde miRNA zuivering protocol, leeg de afvalbak en verwijder de gebruikte kunststoffen en reagens containers uit het robotsysteem.
- De deksels van alle micro-centrifugebuizen bevattende geëlueerde RNA en plaats deze in de shaker adapter. Selecteer "Blood miRNA Deel B" van het protocol keuzemenu de monsters geïncubeerd bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
- Zodra de robot is voltooid lopende deel B van het miRNA zuiveringsprotocol, onmiddellijk in de monsters en chill ze op ijs.
- Kwantificeren en evalueren van het gezuiverde RNA kwaliteit met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: Volgens de aanbevelingen protocol voor de miRNA test een minimale concentratie van 33 ng / ul vereist, en alle monsters moet tenminste aan een 280/260-verhouding van 1,9 en een minimum 260/230 verhouding van 1,8 de afwezigheid waarborgen belangrijke organische vervuiling, die assay prestaties kunnen beïnvloeden (zie Referentie 17). - Bewaar de monsters bij -80 o C.
3. miRNA Monstervoorbereiding
- Normaliseren 12 RNA-monsters tot 33 ng / ul met behulp van nuclease-vrij water.
- Maak een 1: 500 verdunning van het miRNA controles in de testkit behulp nuclease-vrij water. Houd op het ijs.
- Bereid de gloeien master mix: combineer 13 pl gloeien buffer (meegeleverd), 26 pl miRtag reagens (meegeleverd), en 6,5 pl miRNA controles (bereid in stap 3.2) met behulp van 10- en 20-pl pipetten.
- Met behulp van een 10-ul pipet 3,5 ul van de annealing master mix en 3 pl van het RNA monster (dat wil zeggen, 100 ng) aan elk van de twaalf 0,2-ml buisjes strip. Flick te mengen, spin down met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 xg), en plaats in de thermocycler (94 o C gedurende 1 minuut, 65 ° C gedurende 2 minuten en 45 ° C gedurende 10 min, te houden op 48 o C) .
- Bereid de ligatie master mix door het combineren van 3 μl van de ligatiebuffer (ontvangen) en 19,5 pl van de polyethyleenglycol (PEG; ontvangen) met een 20-ul pipet. Voeg 2,5 gl van de ligatie master mix aan elk van de strook buizen uit stap 3.4 onder toepassing van een 10-ul pipet.
- Meng voorzichtig, spin down met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 xg), en terug te keren naar de thermocycler bij 48 ° C gedurende 5 minuten. Na 5 minuten, met een 10-ul pipet wordt 1 ui ligase direct aan elke buis in de thermocycler en incubeer ze op 48 ° C gedurende 3 min, 47 ° C gedurende 3 min, 46 ° C gedurende 3 min, 45 o C gedurende 5 min, en 65 ° C 10 min; te houden op 4 o C.
- Haal de buizen uit de thermocycler, meng ze zachtjes, draai ze naar beneden met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 xg) en voeg 1 pl ligatie clean-up enzym (meegeleverd). Incubeer de buizen in de thermocycler (37 ° C gedurende 1 uur en 70 ° C gedurende 10 min, houden op 4 o
- Verwijder de buizen en, met behulp van een 100-ul pipet, voeg 40 ul van nuclease-vrij water, meng en spin down met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 x g).
4. miRNA hybridisatie
- Ontdooi de verslaggever en capture probe sets (meegeleverd) op ijs en spin ze neer met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 x g).
- Met behulp van een 200-ul pipet, voeg 130 ul van hybridisatie buffer om de verslaggever code set buis (130 pi) om de hybridisatie master mix te creëren. Mix en spin down met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 x g).
LET OP: Reporter en vangt probes zijn specifiek en standaard voor elke miRNA opgenomen in het panel. Custom panelen en door de gebruiker ontworpen afvang en probe sets kunnen worden ontworpen. - In 12 nieuwe 0,2-ml strip buizen, voeg 20 ul van de master mix hybridisatie onder toepassing van een 20-ul pipet.
- Denatureren de miRNA monsters uit stap 3.7 bij 85 o C for 5 min en koel ze op ijs. Voeg 5 ul aan elk van de buizen uit stap 4.3 onder toepassing van een 10-ul pipet.
- Programmeer de thermocycler tot 65 ° C in een 30 pl volume berekende temperatuur en verwarmd deksel op de altijd tijdinstelling (niet programmeren om uitlopen tot 4 ° C aan het einde van de run).
- Met behulp van een 10-ul pipet, voeg 5 ul van de vangprobe ingesteld op elke buis, mengen, spin down met behulp van een benchtop mini microcentrifuge (2000 xg), en onmiddellijk plaatsen in de thermocycler bij 65 o C. Incubeer voor niet minder dan 12 uur en niet meer dan 30 uur.
5. Prep Station en Digital Analyzer
- Laad de prep station.
- Open het station deur en laad het reagens platen (meegeleverd), cartridge (meegeleverd), pipetpunten (meegeleverd), bereid monsters in twaalf 0,2-ml strip buizen, en twaalf lege 0,2 ml-strip buizen (meegeleverd). Verwijder de strip buis caps en reagens plaat deksel. Sluit de prep-stationdeur en voer de geschikte test vanaf het bedieningspaneel.
OPMERKING: Post-hybridisatie verwerking is hetzelfde, ongeacht de test wordt uitgevoerd. Alle reagentia en Aluminium producten worden voorverpakt en vereisen geen voorbereiding, anders dan de tijdige kamertemperatuur en stoppen met draaien het reagens dat 96-well platen bij 2000 xg gedurende 2 minuten. Alle componenten zijn geladen in duidelijk omschreven posities in de prep station. Zie aanvullende materialen voor een beschrijving van de geautomatiseerde procedures.
- Open het station deur en laad het reagens platen (meegeleverd), cartridge (meegeleverd), pipetpunten (meegeleverd), bereid monsters in twaalf 0,2-ml strip buizen, en twaalf lege 0,2 ml-strip buizen (meegeleverd). Verwijder de strip buis caps en reagens plaat deksel. Sluit de prep-stationdeur en voer de geschikte test vanaf het bedieningspaneel.
- Visualiseren en tel de barcodes van de geïmmobiliseerde en georiënteerd tripartiete complexen.
- Verwijder de cartridge uit de prep station, sluit deze af met het deksel slips voorzien, en plaats het in de digitale analysator in het slot boven de camera optiek.
- Selecteer de juiste assay (miRNA panel test) en test-versie aangegeven op de testkit en start het programma.
LET OP: De digitale analyzer neemt dan gezichtsveld beelden voor elk monster de positie van eent vier excitatie golflengten, waardoor de fluorescerende barcodes worden gelezen en gedecodeerd. Specifieke streepjescodes, overeenstemt met een bepaalde miRNA, geteld. - Exporteren gegevensbestanden naar een USB of rechtstreeks aan de server via een internet verbinding.
6. Data Processing and Analysis
- Klik op het tabblad 'Raw Data "en selecteer" Import RCC Files ". Selecteer de map met RCC-bestanden (raw data-bestanden) van de USB.
- Klik op "Next", selecteert u alle QC dozen, en klik op "Import".
- Klik op het tabblad "Nieuwe studie". Noem en beschrijf de studie en op te slaan.
- In de nieuwe studie, selecteert u het tabblad "Nieuwe Experiment" en de naam en een beschrijving van de nieuwe experiment. Klik op "Next" en selecteer de map RLF van het linkervenster dat de relevante ruwe data bestanden die zijn geüpload bevat. Zodra deze is geselecteerd, klikt u op "Keep geselecteerd", en klik vervolgens op "Next".
- Toevoegenannotaties indien gewenst en klik op "Next".
- Selecteer de achtergrond aftrekken methode; hetzij negatieve controle, leeg laan aftrekken, of een door de gebruiker gedefinieerde aftrekking kan worden geselecteerd. Eenmaal geselecteerd, klikt u op "Next".
OPMERKING: Bepaal de meest geschikte achtergrond correctie aanpak op basis van de technische parameters en biologische context van het onderzoek.
LET OP: Tellingen zijn minder precies voor lage-overvloed targets. Ten behoeve van deze studie beschrijven we hier werden de gegevens eerst verwerkt zonder achtergrondcorrectie om QC parameters te onderzoeken en de variatie in tellingen voor miRNA verschillende dichtheden in technische replicaten onderzoeken. De gegevens werden vervolgens verwerkt onder toepassing van een 25-count achtergrond drempelwaarde. - Selecteer de "Top 100" normalisatie, en klik vervolgens op "Next".
- Om de verhouding tussen gegevens te verkrijgen, selecteert u de verhouding parameters en klik op "Next".
- Klik op "Finished".
- Klik op de genoemde experiment in het linkervenster om een drop-down menu met "Raw" onthullen, "genormaliseerde", "gegroepeerde", "Ratio Data" en "Analyse Data".
- Klik op "Raw Data" en observeer een QC verslag in het rechterpaneel. Let op een vlag naast de monsters die niet de standaard QC parameters kunnen gaan. Bouw een nieuwe "Studie", die de vlag monsters niet is opgenomen en opnieuw verwerken zoals beschreven, of gewoon uit te sluiten markeerde QC monsters van de data-analyse stap "Uitsluiten samples door QC / normalisering flag" selecteren.
- Export "Raw", "genormaliseerde", of "gegroepeerde" data-bestanden in CVS of een andere compatibele bestandsindeling voor analyse in een andere statistische of microarray software.
- Selecteer "genormaliseerde Data" uit het linker paneel en selecteer de monsters moeten worden opgenomen in de analyse in het rechterpaneel.
- Klik op "Analysis" en selecteer het gewenste type analyse (bijvoorbeeld: 'Heat Map & #34 ;, "Viool Plot", "Box Plot", "Scatter Plot" of "Histogram Plot"). Selecteer de gewenste uitsluitingscriteria dozen (bijvoorbeeld uitsluiten outlier monsters of genen uitsluiten monsters door QC vlaggen, exclusief de besturing genen en / of uitsluiten normalisatie probes van data-analyse).
- Selecteer individuele monsters moeten worden uitgesloten van de analyse zoals gewenst.
- Selecteer afzonderlijke genen worden uitgesloten of in de analyse wens.
- Selecteer de parameters voor de geselecteerde statistische of datavisualisatie manipulatie en klik op "Finish".
Representative Results
Transcriptoom perturbatie in functionele stoornissen subtiel zijn en om deze subtiele veranderingen in expressie betrouwbaar detecteren, kwantificeren van genexpressie moet nauwkeurig zijn. De genexpressie platform assay systeem reduceert technische geluid via haar sterk geautomatiseerde karakter, en de unieke chemie maakt gebruik produceert high-precision genexpressie data. Technische repliceert in figuur 1 tonen de hoge reproduceerbaarheid zowel endogene (blauwe stippen) en virale miRNA (oranje stippen; housekeeping genen worden vertegenwoordigd door gele stippen) expressie kwantificeren dat mogelijk is met deze methode. Met behulp van deze methode, virale (Figuur 2a) en endogene (figuur 2b) miRNAs die afwijkingen vertonen van de verwachte expressie, zoals gedefinieerd door gezonde deelnemers aan de studie, kunnen worden geïdentificeerd als doelwit van belang bij IBS. Opgemerkt wordt dat het onduidelijk of de virale miRNAsHier gedetecteerd afkomstig van virale genen geïntegreerd in het humane genoom of viral load. Als de test alleen telt volwassen miRNAs met single-nucleotide specificiteit, kruishybridisatie met gelijkaardige endogene humane miRNAs is onwaarschijnlijk. Toch differentiële steady-state niveaus van deze moleculen van belang zijn als biomarkers. De precisie van de methode zorgt voor verstoringen onder lage doelstellingen expressie te detecteren, zo nauwkeurig detectie van deze transcripties niet door overvloediger transcripten worden overspoeld. Subtiele verstoringen kunnen ook nauwkeurig geobserveerd. Figuren 3 en 4 tonen enkele van deze verstoringen in circulerende miRNAs bij IBS en IBS-subtypes vergeleken met gezonde controles, en figuren 5 en 6 (beide aangepast van 3) tonen de twee belangrijkste differentieel verhoogde miRNAs (Figuur 5: miRNA 342-3p Figuur 6: miRNA 150). IBS deelnemers in figuur 6 is een voorbeeld van de grafische weergave van resultaten die door de bijbehorende software.
. Figuur 1: De genormaliseerde tellingen van twee technische replicaten Technische replicaties uitgevoerd op twee verschillende patronen vertonen hoge lineaire correlatie (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) over het bereik van de genormaliseerde (genormaliseerd boven 100 uitgedrukt miRNAs) miRNA tellingen (log2 rekent op de x- en y-as). De scatter plot bevat gegevens voor de endogene humane miRNAs in blauw (654 miRNAs), endogene virale miRNAs in oranje (80 miRNAs), en het huishouden genen in geel (8 genen). Endogene virale miRNAs beschikbaar waren op eerdere versies van de test (versie 1.4 werd hier gebruikt), maar worden niet langer opgenomen op de standaard test, hoewel ze zijn beschikbaar als aangepaste toevoegingen./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Genormaliseerde graven van virale en endogene humane miRNAs in IBS-constipatie (IBS- C) versus gezonde controles Storingen in (a) virale (oranje) en (b) endogene humane miRNAs (blauw) zijn duidelijk in dit voorbeeld, waar de miRNA tellingen (log2 getransformeerde) van IBS-C deelnemers (y-as) zijn teruggerekend tegen miRNA tellingen (log2 getransformeerde) van gezonde controles (x-as). De meerderheid van miRNAs te uiten zeer gelijke wijze in beide populaties, maar sommige met name afwijken van de correlatie. Deze afwijkingen zijn duidelijk onder zowel zeldzame en overvloedig uitgedrukt targets. Gelieveklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. MiRNAs zijn aanzienlijk en uniform verschillend tot expressie in IBS Vergeleken met gezonde controles verschillend tot expressie miRNAs in IBS worden onthuld met behulp van de lineaire discriminantanalyse effect size methode, die het testen van statistische significantie met controles op de consistentie binnen categorieën combineert. Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4:. MiRNAs zijn aanzienlijk en uniform verschillend tot expressie in IBS Subsoorten Vergeleken met gezonde controles miRNAs waren differentially uitgedrukt in IBS-subtypes (-D: diarree, -C: obstipatie). in vergelijking met gezonde controles met behulp van de lineaire discriminantanalyse effect size methode, die het testen van statistische significantie met controles op de consistentie binnen de categorieën combineert Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Figuur 5:. Differentiële expressie van miRNA-342-3p Chronische buikpijn van onbekende oorzaak is een van de belangrijkste symptoom van IBS. De box grafiek toont dat miR-342-3p (genormaliseerde tellingen op de y-as), een miRNA geassocieerd met chronische pijn in de blaas van onbekende etiologie, werd aangetroffen in omloop hogere tellingen voor alle IBS subtypes vergeleken met gezonde controles zijn. De balken geven de niet-uitschieter bereik, de dooses de inter-kwartiel range en het blauwe vierkant de mediaan tellen. Gewijzigd ten opzichte van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Differentiële expressie van miRNA-150 Een viool grafiek die dat IBS deelnemers significant hoger circulerende miR-150 tellingen vergeleken met gezonde controles (log2 getransformeerd rekent op de y-as).. De curven geven de frequentie van de tellingen in de categorie, de verticale balken geven de 1 e en 3 e kwartiel en het rode vierkant geeft de mediaan tellen. Gewijzigd ten opzichte van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Voor het miRNA assay bijzonder kritisch gezuiverde lysaten (deze kunnen worden gebruikt in mRNA en eiwit assays) niet te gebruiken, omdat de reagentia niet geoptimaliseerd voor gebruik met lysaten en monstervoorbereiding reacties waarschijnlijk worden geremd. Bovendien verontreinigingen overgedragen van lysis en RNA zuiveringsstappen (bijvoorbeeld guanidinium verbindingen ethanol en fenolen) kunnen ligatie en voorbeeld zuiveringsreacties remmen. Goede kwaliteit RNA is derhalve kritisch voor de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van de assay miRNA.
Met behulp van een thermocycler met een verwarmd deksel is essentieel voor een goede temperatuurregeling om de prestaties van alle reactiestappen optimaliseren waarborgen. Tijdens stap 3.5.1, is het belangrijk de strips uit de thermocycler om de temperatuur te handhaven gedurende de toevoeging van het ligase te verwijderen. Verwijderen van de stroken aan de ligase toevoegende reactie compromitteren. Bij het uitvoeren van de hybridisatie stappen, is het essentieel om krachtig schudden, pipetteren of tikken vermijden bij het mengen reagentia in de buizen, omdat dit de reporter probes scheren. Om optimale prestaties en consistentie te waarborgen, is het belangrijk om de reagentia in de buizen goed te mengen door voorzichtig te vegen. draaien altijd naar beneden reacties na het mengen, en het gebruik van een nieuwe pipet tip elke keer dat een reagens wordt afgegeven om nauwkeurige pipetteren te waarborgen en toevallige kruisbesmetting te voorkomen.
Wijzigingen en problemen oplossen
De code sets kunnen worden aangepast om alleen doelstellingen van belang zijn. Op deze manier kunnen de kosten worden afgewogen mogelijk te maken voor het testen van grote sample sets wanneer nader onderzoeken of valideren van een bio-handtekening. Custom sondes kunnen worden ontworpen voor genen of doelen niet beschikbaar zijn van het à la carte menu. Gevoeligheid voor minder-overvloedige targets of lage concentratie RNA kan zijngemanipuleerd doordat langere tijd hybridisatie en / of met hogere resolutie digitale tellen.
In onze studie gebruikten we de vooropgestelde 800 doelgroep miRNA paneel met totaal RNA uit volbloed; echter, kan de testen worden aangepast om minder miRNAs onder meer als een meer gerichte aanpak nodig. Een totaal van 24 monsters kunnen worden bereid op één dag, versprongen twee sets van 12, omdat twee patronen kunnen gemakkelijk worden door post-hybridisatie behandelingen op de robot prep station doorgegeven en afgebeeld op de digitale analyser de volgende dag. Gefaseerde van de monsters in batches van 12 is belangrijk voor de hybridisatietijd standaardiseren. Cartridges die zijn afgebeeld kunnen worden opgeslagen en bewaard bij 4 ° C te worden gescand als data analyses suggereren dat een hogere resolutie scan het opsporen van zeldzamere miRNAs kunnen verbeteren. Detectie van zeldzamer moleculen kunnen ook worden verbeterd door het hybridiseren monsters langer; kan echter langdurige hybridisatie Result in oververzadiging en kunnen alleen maar beter de resultaten als de startende RNA concentraties zijn laag (zoals in extracellulaire blaasjes afgeleid RNA). gevoeligheid en precisie van het platform mogelijk te maken relatief lage-overvloed miRNAs betrouwbaar te tellen.
Beperkingen van de Techniek
De beschreven genexpressie test platform is geschikt voor slechts tot 800 doelen per array. Het is dan ook niet geschikt voor het hele miRNA-transcriptoom / hele transcriptoom studies. Enige bekende, beschreven en specifieke doelstellingen kunnen worden gedetecteerd met behulp van het platform, dus het is niet geschikt voor de ontdekking van nieuwe moleculaire species. Andere methoden, zoals RNASeq of andere traditionele methoden microarray, zijn meer geschikt voor hele transcriptoom experimentele studies.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
IBS wordt gekenmerkt door een combinatie van symptomen, principally waaronder buikpijn; viscerale overgevoeligheid; en veranderingen in de darm, zoals vaak diarree, constipatie, of een combinatie van beide 9,10. IBS-symptomen hebben geen bekende organische oorzaak, en patiënten niet presenteren met klinisch significante ontsteking, histopathologische verstoringen van gastro-intestinale weefsels, of systemische markers 9-12. Uit onderzoek blijkt dat biologische ontregeling in IBS is subtiel, subklinische en heterogeen, met gemeenschappelijke thema's in opkomst rond de ontsteking en het immuunsysteem 10. Daarom moesten we-onderzoeker geïntroduceerd variatie controle en gebruik van een platform dat in staat is op betrouwbare wijze te detecteren subtiele verstoringen in genexpressie was. De unieke eigenschappen van de test en het systeem te standaardiseren monster verwerking en vermindering van experimentator hanteren door middel van automatisering, waardoor de technische variantie tot zeer reproduceerbare data te produceren. Deze kenmerken zorgen voor gerichte onderzoeken en produceren van zeer nauwkeurige en replicable data. Dit maakt de detectie van subtiele verstoringen en verstoringen onder lage expressie doelen die kunnen worden genegeerd of overspoeld door de signalen van overvloediger doelwitten bij gebruik intensity- of amplificatie gebaseerde werkwijzen. PCR-gebaseerde methoden microarrays en RNAseq levensvatbare alternatieven voor het gebruik van de beschreven platform en kunnen aantrekkelijk alternatief zijn wanneer hogere verwerkingscapaciteit vereist of wanneer het doel is om de hele transcriptoom te karakteriseren of om te zoeken naar nieuwe moleculen. Echter, alternatieven niet zo goed presteren in nauwkeurig en gevoelig detecteren en kwantificeren van zeldzame targets en subtiele verstoringen.
Toekomstige toepassingen of richtingen na beheersen van deze techniek
Circulerende miRNA meningsuiting in IBS deelnemers toonden een aantal storingen die werden gevonden zowel significant en consequent binnen categorieën. De geïdentificeerde miRNAs werden geassocieerd met relevante pathways en pathologische omstandigheden, met inbegrip van een functionele pijn voorwaarde (miR-342-3p: chronische pijn in de blaas) 8 en ontsteking (miR-150) 13. Het voorbeeld studie was gebaseerd op een verkennende cohort gebruikt om targets en systemen van belang te definiëren. Een meer gerichte kleinere miRNA matrix werd vervolgens geconstrueerd, verlagen van de kosten per monster en waardoor veel grotere cohorten op een kosteneffectieve wijze worden geanalyseerd om te valideren en te verfijnen handtekeningen en biomarkers. De genexpressie platform testsysteem een evenwicht tussen de traditionele verkennende aard van de microarray en meer gerichte, hypothese-gedreven het verzamelen van gegevens te verfijnen en te testen moleculaire handtekeningen en biomarkers 14-16. De werkwijze wordt gebruikt om moleculaire en eiwit verstoringen onderzoeken in vivo en in vitro modellen waarbij het beschreven doel miRNAs zijn experimenteel overexpressie gebrachte of geremd. Nieuwe testen zorgen voor de gelijktijdige kwantificering van mRNA en proteins direct van cellen en weefsels lysaten. Verder kan door het optimaliseren van de zuivering van specifieke fracties van perifeer bloed en excreta (bijvoorbeeld, urine) en door het aanpassen en optimaliseren bepaalde assay parameters, moleculaire profielen en handtekeningen laagmoleculair concentratie fracties (bijvoorbeeld exosomaal fracties) worden onderzocht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
