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Genetics

चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में miRNAs परिसंचारी की perturbations एक मल्टिप्लेक्स उच्च throughput जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म का उपयोग कर पाया

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54693

Abstract

जीन अभिव्यक्ति मंच परख एक भी प्रतिक्रिया में अप करने के लिए 800 टेप (mRNA या miRNAs) की अभिव्यक्ति की मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। miRNA परख सीधे इमेजिंग और डिजिटल miRNA अणुओं है कि कलर-कोडेड फ्लोरोसेंट बारकोड वाले जांच के सेट (एक पत्रकार की जांच और एक पर कब्जा जांच) के साथ चिह्नित कर रहे हैं गणना के द्वारा टेप में गिना जाता है। बारकोड miRNAs कि 3 'के अंत के लिए एक अनूठा oligonucleotide टैग (miRtag) ligating द्वारा लम्बी दिया है परिपक्व करने के लिए सीधे संकरित हैं। रिवर्स प्रतिलेखन और टेप के प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं है। रिपोर्टर जांच के छह रंग चार फ्लोरोसेंट रंगों के संयोजन का उपयोग आबादी वाले पदों के एक दृश्य होते हैं। छह पदों पर चार रंगों में एक जीन विशिष्ट रंग बारकोड अनुक्रम का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पोस्ट-संकरण प्रसंस्करण के लिए एक रोबोट तैयार करने का स्टेशन पर स्वचालित है। संकरण, अतिरिक्त जांच, धुल रहे हैं और त्रिपक्षीय ढांचे (कब्जा समर्थक के बादहो-miRNA-रिपोर्टर जांच) बायोटिन लेबल पर कब्जा जांच के माध्यम से एक streptavidin लेपित स्लाइड करने के लिए तय कर रहे हैं। इमेजिंग और बारकोड गिनती एक डिजिटल विश्लेषक का उपयोग किया जाता है। स्थिर बारकोड वाले miRNAs कल्पना कर रहे हैं और एक माइक्रोस्कोप और कैमरे का उपयोग imaged, और अद्वितीय बारकोड को डीकोड और गिने जाते हैं। डेटा गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी), सामान्य, और विश्लेषण एक कस्टम डिजाइन डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि परख सॉफ्टवेयर accompanies से मदद कर रहे हैं। परख अभिव्यक्ति का एक व्यापक रेंज पर उच्च linearity, साथ ही उच्च संवेदनशीलता को दर्शाता है। नमूना और परख तैयारी एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, रिवर्स प्रतिलेखन, या प्रवर्धन शामिल नहीं करता है; कुछ कदम है; और काफी हद तक स्वचालित है, अन्वेषक प्रभाव को कम करने और उच्च स्थिरता और तकनीकी reproducibility में जिसके परिणामस्वरूप। यहाँ, हम चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में घूम miRNA perturbations की पहचान करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग का वर्णन है।

Introduction

सामान्य आबादी का 15% और स्वास्थ्य सेवाओं पर एक महत्वपूर्ण बोझ का प्रतिनिधित्व - चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम (आईबीएस) गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में सबसे आम आउट पेशेंट निदान, afflicting 10 है। IBS के लिए वर्तमान में, वहाँ कोई आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं नैदानिक बायोमार्कर (यानी, निदान नैदानिक लक्षणों पर आधारित है और इस तरह के सैनिक द्रोह, सूजन आंत्र रोग, और जठरांत्र (सैनिक) संक्रमण के रूप में अन्य जैविक विकारों, बाहर राज कर रही है)। जब इस तरह के आईबीएस, उच्च संवेदनशीलता और सटीकता (reproducibility) के रूप में उपनैदानिक ऊतकविकृतिविज्ञानी के साथ आम की स्थिति में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन, जरूरत के रूप में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अव्यवस्थाएं अक्सर सूक्ष्म 1-3 कर रहे हैं। miRNAs आईबीएस 4,5 में दोनों नैदानिक और कार्यात्मक लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है, और हम विशेष रूप से आईबीएस से जुड़े जैविक perturbations 3,4,6,7 की बायोमार्कर घूम रूप में उनके उपयोग का आकलन करने में रुचि रखते हैं। circula के नैदानिक ​​उपयोगटिंग बायोमार्कर आसानी और रोगियों से बायोमार्कर 'स्रोत (जैसे, परिधीय रक्त) के संग्रह का न्यूनतम आक्रामक प्रकृति के कारण मौजूदा ब्याज की है।

जीन अभिव्यक्ति assays मंच, उनके अद्वितीय रसायन शास्त्र और सुव्यवस्थित, ज्यादातर स्वचालित कार्यप्रवाह की वजह से, कि लक्षित खोज के लिए transcriptome की व्यापक और अनुकूलन कवरेज (एक भी प्रतिक्रिया में 800 लक्ष्य) प्रदान करता है एक माइक्रोएरे मंच प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी transcriptomic लक्ष्यों की मात्रा का ठहराव में अभिव्यक्ति के स्तर की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से अधिक उच्च परिशुद्धता और linearity निकलेगा। परख शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन, सीडीएनए, या किसी अन्य एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जिसके परिणामस्वरूप के प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, कम बहुतायत या दुर्लभ ब्याह वेरिएंट के साथ शाही सेना प्रजातियों से प्रवर्धन के उच्च चक्र संख्या द्वारा शुरू की संभावित त्रुटियों डिजिटल गिनती की प्रक्रिया द्वारा कम हो रहे हैं। इसका मतलब यह है कि इस तरह के शुद्ध कुल के रूप में नमूना प्रकार की एक विस्तृत विविधताआरएनए (यानी, mRNA + miRNA), आरएनए formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) नमूनों, साथ ही कच्चे तेल के ऊतकों और सेल lysates से, assays के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

ब्याज की RNAs जांच (कब्जा है और रिपोर्टर जांच) की एक जोड़ी का उपयोग, प्रत्येक एक लक्ष्य विशिष्ट अनुक्रम कि लक्ष्य शाही सेना पर एक इसी क्षेत्र पहचानता युक्त पता चला रहे हैं। आदेश में कम आरएनए (यानी, miRNAs) का पता लगाने को सुनिश्चित करने के लिए, परिपक्व miRNA अनुक्रम अणु के 3 'अंत के लिए एक अनूठा oligonucleotide टैग (miRtag) annealing द्वारा लम्बी है। एक ब्रिजिंग oligonucleotide है, जो दोनों परिपक्व लक्ष्य miRNA और miRNA-विशिष्ट miRtag के एक हिस्से के लिए मानार्थ है, अनुक्रम विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कैद और रिपोर्टर जांच क्रमश: 3 'और 5' के लिए ligate, परिपक्व miRNA-miRtag परिसर के समाप्त होता है। कब्जा जांच 3 'अंत में एक बायोटिन लेबल है, जो उन्हें एक streptavidin लेपित गिलास स्लाइड की सतह को संलग्न करने की अनुमति है, fixiएनजी स्लाइड करने के लिए कब्जा जांच miRNA-miRtag-रिपोर्टर जांच जटिल है। एक विद्युत प्रवाह तो इजाजत दी फ्लोरोसेंट 5 'अंत पर रिपोर्टर जांच के द्वारा किया बारकोड को एक माइक्रोस्कोप और आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग कर देखे जा करने के लिए, स्लाइड सतह पर जटिल उन्मुख करने के लिए प्रयोग किया जाता है। बारकोड गिना और डीकोड कर रहे हैं, विशेष लक्ष्य miRNAs की गिनती उपज। फ्लोरोसेंट बारकोड छह पदों है कि चार फ्लोरोसेंट रंगों में से एक द्वारा कब्जा किया जा सकता है, जो 4,000 से अधिक रंग-बारकोड संयोजन, एक विशिष्ट शाही सेना के लिए प्रत्येक कोडिंग के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के होते हैं।

नमूना तैयार (यानी, शाही सेना शुद्धि या सेल / ऊतक lysate तैयारी), साथ ही कब्जा है और रिपोर्टर जांच के संकरण, बेंच पर किया जाता है। बारह नमूनों एक एकल स्लाइड पर मल्टिप्लेक्स जा सकता है। रात भर संकरण के बाद, आगे की सभी नमूना तैयार करना एक रोबोट तैयार करने का स्टेशन द्वारा किया जाता है। लोड स्लाइड फिर विज्ञापन करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैंइमेजिंग, गिनती, डिकोडिंग, और डाटा प्रोसेसिंग के लिए igital विश्लेषक। परिणामी डेटा साथ सॉफ्टवेयर, जहां वे आगे उपयोगकर्ता नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के साथ कार्रवाई कर रहे हैं करने के लिए आयात कर रहे हैं। अनूठा रसायन विज्ञान, सरल तैयारी, स्वचालित प्रकृति, सरल डेटा प्रकार (मायने रखता है), और परख के समग्र सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह उच्च परिशुद्धता जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव की सुविधा है, यह इस तरह के रूप में कार्य की स्थिति में घूम miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल और हस्ताक्षर के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण बना रही है आईबीएस।

Protocol

अनुसंधान यहाँ वर्णित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (Clinicaltrial.gov # NCT00824941) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पूरे रक्त के नमूनों का संग्रह

  1. रक्त संग्रह एक शाही सेना को स्थिर समाधान (लंबी अवधि के भंडारण के लिए अनुमति देता है) युक्त ट्यूबों में venipuncture के माध्यम से अध्ययन प्रतिभागियों से पूरे रक्त के नमूने (2.5 मिलीलीटर) लीजिए, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस आरएनए शुद्धि तक पर स्टोर।

2. कुल शाही सेना शुद्धि

  1. गला लें और 2 घंटे के लिए रक्त नलियों सेते हैं, और उसके बाद 5000 में एक्स 10 मिनट के लिए एक स्विंग बाहर रोटर का उपयोग कर उन्हें अपकेंद्रित्र जी। ध्यान से डालने का कार्य या इसे बंद pipetting बर्बादी ट्यूब में, गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  2. RNase मुक्त पानी के 4 मिलीलीटर जोड़कर गोली धो लें, टोपी सुरक्षित जगह है, और जब तक भंवर गोली दिख भंग कर रहा है। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए और फिर से के लिए 5000 XG पर एक स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोगसतह पर तैरनेवाला ले जाते हैं, 2.1 चरण में वर्णित है।
  3. गोली BM1 बफर (प्रदान) के 350 μl जोड़ें। भंवर जब तक यह गोली दिख भंग और स्वचालित कुल शाही सेना निकासी के लिए एक 2 मिलीलीटर प्रसंस्करण ट्यूब को हस्तांतरण है।
  4. पूरे रक्त एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शाही सेना निकासी किट है, जो एक रोबोट आरएनए निकासी व्यवस्था पर स्वचालित किया जा सकता का उपयोग करने से, miRNA सहित intracellular शाही सेना, के स्वचालित शुद्धि प्रदर्शन करना।
    ध्यान दें: स्वचालित रोबोट प्रणाली हम इस्तेमाल एक समय में बारह नमूने प्रक्रिया कर सकते हैं, और यह आरएनए शुद्धि प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए 3 घंटा लेता है।
    1. लोड पूर्व लोड पिपेट टिप्स, अपकेंद्रित्र ट्यूब, buffers, और रोबोट आरएनए निकासी व्यवस्था में शाही सेना शुद्धि किट में प्रदान की अभिकर्मकों।
    2. प्रोटोकॉल चयन मेनू से "रक्त miRNA भाग ए" प्रोटोकॉल का चयन करें और रन शुरू करते हैं।
      नोट: स्वचालित प्रक्रियाओं का वर्णन के लिए पूरक सामग्री देखें।
    3. एक बार रोबोट सह गया हैस्वचालित miRNA शुद्धि प्रोटोकॉल का mpleted भाग ए, बर्बाद गोदाम खाली और रोबोटिक प्रणाली से इस्तेमाल प्लास्टिक और अभिकर्मक कंटेनरों को हटा दें।
    4. सभी माइक्रो आरएनए सेंट्रीफ्यूज eluted युक्त ट्यूबों पर पलकों को बंद करने और उन्हें एक प्रकार के बरतन एडाप्टर में जगह है। 5 मिनट के लिए 65 सी पर नमूने सेते प्रोटोकॉल चयन मेनू से चुनें "रक्त miRNA पार्ट बी"।
    5. रोबोट miRNA शुद्धि प्रोटोकॉल के भाग ख चल पूरा कर लिया है एक बार, तुरंत नमूने निकालें और बर्फ पर उन्हें ठंडा।
  5. Quantitate और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर शुद्ध शाही सेना गुणवत्ता का मूल्यांकन।
    नोट: miRNA परख, 33 एनजी की एक न्यूनतम एकाग्रता के लिए प्रोटोकॉल सिफारिशों के अनुसार / μl की आवश्यकता है, और सभी के नमूने मिलने या अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए 1.9 की एक 280/260 अनुपात और 1.8 की एक न्यूनतम 260/230 अनुपात से अधिक होना चाहिए महत्वपूर्ण जैविक प्रदूषण का है, जो परख के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं (17 संदर्भ देखें)।
  6. -80 सी पर नमूने संग्रहित करें

3. miRNA नमूना तैयार

  1. 33 एनजी करने के लिए 12 शाही सेना के नमूने मानक के अनुसार / nuclease मुफ्त पानी का उपयोग μl।
  2. nuclease मुफ्त पानी का उपयोग परख किट में प्रदान की miRNA नियंत्रण के 500 कमजोर पड़ने एक 1: तैयार करें। बर्फ पर रखें।
  3. annealing मास्टर मिश्रण तैयार: 10 और 20 μl pipettes का उपयोग annealing बफर (प्रदान) के 13 μl, miRtag अभिकर्मक (प्रदान) के 26 μl, और miRNA नियंत्रण (3.2 चरण में तैयार) के 6.5 μl गठबंधन।
  4. एक 10 μl विंदुक का प्रयोग, annealing मास्टर मिश्रण के 3.5 μl और आरएनए नमूना (यानी, 100 एनजी) बारह 0.2 मिलीलीटर पट्टी ट्यूबों के प्रत्येक के 3 μl जोड़ें। , मिश्रण करने के लिए झाड़ thermocycler में एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG), और जगह का उपयोग कर नीचे स्पिन (94 2 मिनट के लिए 1 मिनट, 65 सी के लिए सी, और 10 मिनट के लिए 45 सी, 48 सी पर पकड़) ।
  5. 3 μ के संयोजन से बंधाव मास्टर मिश्रण तैयारबंधाव बफर के एल (प्रदान) और पॉलीथीन ग्लाइकोल का 19.5 μl (खूंटी; प्रदान की) एक 20 μl पिपेट का उपयोग। एक 10 μl पिपेट का उपयोग 3.4 कदम से पट्टी नलियों से प्रत्येक के लिए बंधाव मास्टर मिश्रण के 2.5 μl जोड़ें।
    1. धीरे मिक्स, एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर नीचे स्पिन, और 5 मिनट के लिए 48 सी में thermocycler में लौटने। 5 मिनट के बाद, एक 10 μl पिपेट का उपयोग, ligase के 1 μl सीधे प्रत्येक ट्यूब thermocycler में 48 सी में 3 मिनट, 47 सी के लिए 3 मिनट, 46 सी के लिए 3 मिनट के लिए, जोड़ने और उन्हें सेते 45 5 मिनट और 65 सी 10 मिनट के लिए सी; 4 सी पर पकड़
  6. thermocycler से ट्यूबों निकालें, उन्हें धीरे मिश्रण, एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर उन्हें नीचे स्पिन, और बंधाव साफ हुआ एंजाइम की 1 μl जोड़ने (प्रदान)। Thermocycler (1 घंटा और 10 मिनट के लिए 70 सी के लिए 37 सी में ट्यूबों सेते, 4 पर पकड़
  7. ट्यूबों निकालें और एक 100 μl पिपेट का उपयोग, nuclease मुक्त पानी के 40 μl जोड़ने, मिश्रण, और एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर नीचे स्पिन।

4. miRNA संकरण

  1. बर्फ पर रिपोर्टर और कब्जा जांच के सेट (प्रदान) गला लें और एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर उन्हें नीचे स्पिन।
  2. एक 200 μl विंदुक का प्रयोग, संकरण मास्टर मिश्रण बनाने के लिए रिपोर्टर कोड सेट ट्यूब (130 μl) के संकरण बफर के 130 μl जोड़ें। मिक्स और एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर नीचे स्पिन।
    नोट: रिपोर्टर और कब्जा जांच विशिष्ट और प्रत्येक miRNA के लिए मानक पैनल में शामिल हैं। कस्टम पैनलों और उपयोगकर्ता के लिए डिज़ाइन किया गया कब्जा है और जांच के सेट तैयार किया जा सकता।
  3. 12 नए 0.2 मिलीलीटर पट्टी ट्यूबों में, एक 20 μl पिपेट का उपयोग संकरण मास्टर मिश्रण के 20 μl जोड़ें।
  4. 85 सी के लिए कदम पर 3.7 से miRNA नमूनों denatureआर 5 मिनट और बर्फ पर उन्हें शांत। एक 10 μl पिपेट का उपयोग कर कदम 4.3 से ट्यूबों में से प्रत्येक को 5 μl जोड़ें।
  5. कार्यक्रम में 65 सी के लिए thermocycler एक 30 μl मात्रा की गणना हमेशा के समय में तापमान और गर्म ढक्कन स्थापना (यह कार्यक्रम नहीं है चलाने के अंत में 4 सी के लिए नीचे रैंप के लिए)।
  6. एक 10 μl विंदुक का प्रयोग, कब्जा जांच प्रत्येक ट्यूब करने के लिए सेट के 5 μl जोड़ने, मिश्रण, एक benchtop मिनी microcentrifuge (2,000 XG) का उपयोग कर नीचे स्पिन, और तुरंत 65 सी पर thermocycler में जगह कोई कम से कम 12 घंटा और कोई 30 से अधिक घंटे के लिए सेते हैं।

5. तैयारी स्टेशन और डिजिटल विश्लेषक

  1. प्रस्तुत करने का स्टेशन लोड।
    1. स्टेशन दरवाजा खोलो और अभिकर्मक प्लेटों लोड (प्रदान), कारतूस (प्रदान), पिपेट टिप्स (प्रदान), बारह 0.2 मिलीलीटर पट्टी, ट्यूब और बारह खाली 0.2 मिलीलीटर पट्टी ट्यूबों में तैयार नमूनों (प्रदान)। पट्टी ट्यूब कैप और अभिकर्मक प्लेट कवर निकालें। प्रस्तुत करने का स्टेशन बंददरवाजा और नियंत्रण कक्ष से उचित परख चलाते हैं।
      नोट: पोस्ट-संकरण प्रसंस्करण, एक ही है परख की जा रही रन की परवाह किए बिना। सभी अभिकर्मकों और प्लास्टिक माल prepackaged रहे हैं और कोई तैयारी, उन्हें कमरे के तापमान को लाने और 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर अभिकर्मक युक्त 96 अच्छी तरह प्लेटें नीचे कताई के अलावा अन्य आवश्यकता होती है। सभी घटकों प्रस्तुत करने का स्टेशन में स्पष्ट रूप से परिभाषित पदों में लोड कर रहे हैं। स्वचालित प्रक्रियाओं का वर्णन के लिए पूरक सामग्री देखें।
  2. कल्पना और स्थिर और उन्मुख त्रिपक्षीय परिसरों के बारकोड गिनती।
    1. प्रस्तुत करने का स्टेशन से कारतूस निकालें, बशर्ते कवर फिसल जाता है के साथ इसे सील, और कैमरा ऑप्टिक ऊपर स्लॉट में डिजिटल विश्लेषक में जगह है।
    2. उचित परख (miRNA पैनल परख) और परख संस्करण परख किट पर संकेत का चयन करें और कार्यक्रम चलाते हैं।
      नोट: डिजिटल विश्लेषक तो प्रत्येक नमूना स्थिति के लिए दृश्य चित्र के क्षेत्र लेता हैटी चार उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, फ्लोरोसेंट बारकोड को अनुमति देने के लिए पढ़ने के लिए और डीकोड किया जा सके। विशिष्ट बारकोड, एक विशिष्ट miRNA को इसी गिने जाते हैं।
    3. एक इंटरनेट लिंक के माध्यम से सर्वर के लिए एक यूएसबी के लिए डेटा फ़ाइलों को निर्यात या सीधे।

6. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. "रॉ डाटा" टैब पर क्लिक करें और चुनें "आयात आरसीसी फ़ाइलें"। यूएसबी से आरसीसी फ़ाइलें (कच्चे डेटा फ़ाइलों) युक्त फ़ोल्डर का चयन करें।
  2. , क्लिक करें "अगली" सभी क्यूसी बॉक्स का चयन, और "आयात" पर क्लिक करें।
  3. "नई स्टडी" टैब पर क्लिक करें। नाम और अध्ययन का वर्णन है और बचाने के लिए।
  4. नए अध्ययन में, "नया प्रयोग" टैब और नाम का चयन करें और नया प्रयोग का वर्णन है। "अगला" क्लिक करें और बाएँ फलक कि कि अपलोड किया गया है प्रासंगिक कच्चे डेटा फ़ाइलें हैं से RLF फ़ोल्डर का चयन करें। एक बार जब यह चुना गया है, "चयनित रखें" पर क्लिक करें और फिर "अगला" क्लिक करें।
  5. जोड़नाएनोटेशन अगर वांछित और "अगला" क्लिक करें।
  6. पृष्ठभूमि घटाव विधि का चयन करें; या तो नकारात्मक नियंत्रण, खाली लेन घटाव, या एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित घटाव का चयन किया जा सकता है। एक बार चयनित, "अगला" क्लिक करें।
    नोट: सबसे उपयुक्त पृष्ठभूमि सुधार तकनीकी मानकों और अध्ययन के जैविक प्रसंग पर आधारित दृष्टिकोण का निर्धारण करते हैं।
    नोट: गिनता कम बहुतायत लक्ष्यों के लिए कम सटीक हैं। अध्ययन हम यहाँ वर्णन के प्रयोजनों के लिए, डेटा के पहले के आदेश QC मानकों को जांच करने के लिए और तकनीकी प्रतिकृति भर में विभिन्न प्रचुरता के miRNA के लिए मायने में बदलाव की जांच करने में पृष्ठभूमि सुधार के बिना संसाधित किया गया था। डाटा तो एक 25 गिनती पृष्ठभूमि सीमा का उपयोग कर फिर से प्रोसेस किया गया था।
  7. "शीर्ष 100" सामान्य बनाने का चयन करें, और फिर क्लिक करें "अगली"।
  8. अनुपात डेटा प्राप्त करने के लिए, अनुपात मापदंडों का चयन करें, और फिर क्लिक करें "अगली"।
  9. "समाप्त" पर क्लिक करें।
  10. नामित पूर्व पर क्लिक करेंबाएँ फलक में periment "रॉ" युक्त एक ड्रॉप डाउन मेनू प्रकट करने के लिए, "सामान्यीकृत", "बांटा", "अनुपात डेटा", और "विश्लेषण डाटा"।
  11. पर "रॉ डाटा" क्लिक करें और दाएँ फलक में एक QC रिपोर्ट निरीक्षण करते हैं। एक झंडा नमूने है कि डिफ़ॉल्ट QC मानकों को पारित नहीं करने के लिए अगले निरीक्षण करें। एक नया "अध्ययन" जो झंडी दिखाकर रवाना किया नमूने शामिल नहीं है और के रूप में वर्णित पुनर्संसाधन, या बस का चयन "क्यूसी / सामान्य बनाने झंडा द्वारा नमूनों को बाहर निकालें" से डेटा विश्लेषण कदम से झंडी दिखाकर रवाना किया क्यूसी नमूनों को बाहर का निर्माण करें।
    1. निर्यात "रॉ", "सामान्यीकृत", या सीवीएस में "बांटा" डेटा फ़ाइलों से या किसी अन्य सांख्यिकीय या माइक्रोएरे सॉफ्टवेयर में विश्लेषण के लिए एक और संगत फ़ाइल स्वरूप।
  12. बाएँ फलक से "सामान्यीकृत डेटा" का चयन करें और चुनें नमूने सही फलक में विश्लेषण में शामिल किया जाना है।
  13. "विश्लेषण" पर क्लिक करें और वांछित विश्लेषण के प्रकार (चयन जैसे, "हीट मानचित्र & #34 ;, "वायलिन प्लॉट", "बॉक्स साजिश", "तितर बितर साजिश", या "हिस्टोग्राम प्लॉट")। वांछित अपवर्जन मानदंड बॉक्स का चयन करें (उदाहरण के लिए, ग़ैर नमूने या जीन को बाहर क्यूसी झंडे से नमूनों को बाहर, नियंत्रण जीन बाहर करते हैं, और / या डेटा के विश्लेषण से सामान्य बनाने जांच को बाहर)।
  14. के रूप में वांछित विश्लेषण से बाहर रखा जा करने के लिए अलग-अलग नमूने का चयन करें।
  15. व्यक्ति के जीन से बाहर रखा गया या वांछित के रूप में विश्लेषण में शामिल होने के लिए चयन करें।
  16. चुने गए सांख्यिकीय या डेटा दृश्य में गड़बड़ी के लिए मानकों का चयन करें और "समाप्त" पर क्लिक करें।

Representative Results

कार्यात्मक विकारों में transcriptomic गड़बड़ी सूक्ष्म हो सकता है, और आदेश में मज़बूती से अभिव्यक्ति में उन सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए, जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव सटीक होने की जरूरत है। जीन अभिव्यक्ति मंच परख प्रणाली अपने अत्यधिक स्वचालित प्रकृति के माध्यम से तकनीकी शोर कम कर देता है, और अद्वितीय रसायन विज्ञान इसे इस्तेमाल करता है उच्च परिशुद्धता जीन अभिव्यक्ति डेटा पैदा करता है। तकनीकी चित्र में दिखाया गया replicates 1 दोनों अंतर्जात (नीले डॉट्स) में उच्च reproducibility और वायरल miRNA (नारंगी डॉट्स, गृह व्यवस्था जीन पीले डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं) को प्रदर्शित अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव है कि इस विधि का उपयोग संभव है। इस विधि, वायरल (चित्रा 2A) और अंतर्जात (चित्रा 2 बी) miRNAs कि उम्मीद की अभिव्यक्ति से विचलन दिखाने के लिए, के रूप में स्वस्थ अध्ययन प्रतिभागियों द्वारा परिभाषित का उपयोग करना, आईबीएस में ब्याज की लक्ष्य के रूप में पहचाना जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह स्पष्ट नहीं है कि वायरल miRNAsयहां पता चला मानव जीनोम में या वायरल लोड से एकीकृत वायरल जीन से निकाले जाते हैं। परख केवल एकल न्यूक्लियोटाइड विशिष्टता के साथ परिपक्व miRNAs में गिना जाता है के रूप में, समान अंतर्जात मानव miRNAs के साथ पार संकरण की संभावना नहीं है। बहरहाल, इन अणुओं के अंतर स्थिर राज्य स्तरों बायोमार्कर के रूप में ब्याज की हैं। के रूप में इन टेप के सही पता लगाने के अधिक प्रचुर मात्रा में टेप से बाहर लादा नहीं कर रहे हैं विधि की परिशुद्धता, कम अभिव्यक्ति लक्ष्यों के बीच perturbations पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है। सूक्ष्म perturbations भी मज़बूती से मनाया जा सकता है। आंकड़े 3 और 4 IBS और IBS-उपप्रकार स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में miRNAs घूम में इन perturbations के कुछ शो, और आंकड़े 5 और 6 (दोनों 3 से अनुकूलित) के दो सबसे महत्वपूर्ण विभिन्न ऊंचा दिखाने miRNAs (चित्रा 5: miRNA 342-3p, चित्रा 6: miRNA 150)। आईबीएस प्रतिभागियों में यह आंकड़ा 6 संबंधित सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न परिणामों की चित्रमय उत्पादन का एक उदाहरण है।

आकृति 1
चित्रा 1: दो तकनीकी replicates से सामान्यीकृत गिनता तकनीकी दो अलग-अलग कारतूस पर चलने प्रतिकृति के उच्च रैखिक संबंध दिखाने (2 आर = 0.90, y = 1.03x - 0.4) सामान्यीकृत की सीमा पर (ऊपर 100 के लिए सामान्यीकृत व्यक्त miRNAs) miRNA मायने रखता है (एक्स पर log2 मायने रखता है और शाफ़्ट)। तितर बितर साजिश पीला (8 जीन) में ब्लू (654 miRNAs) में अंतर्जात मानव miRNAs के लिए डेटा, नारंगी (80 miRNAs) में अंतर्जात वायरल miRNAs, और गृह व्यवस्था जीन भी शामिल है। अंतर्जात वायरल miRNAs परख के पिछले संस्करणों (संस्करण 1.4 यहां इस्तेमाल किया गया था) पर उपलब्ध थे, लेकिन अब नहीं, मानक परख पर शामिल किए गए हैं, हालांकि वे कस्टम अतिरिक्त के रूप में उपलब्ध हैं।/54693fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। आईबीएस-कब्ज (IBS- सी) बनाम स्वस्थ नियंत्रण में वायरल और अंतर्जात मानव miRNAs की सामान्यीकृत गिनता perturbations (क) में वायरल (नारंगी) और (ख) अंतर्जात मानव miRNAs (नीला) इस उदाहरण है, जहां में स्पष्ट कर रहे हैं miRNA आईबीएस-सी प्रतिभागियों (शाफ़्ट) के मायने रखता है (log2 तब्दील) स्वस्थ नियंत्रण (एक्स अक्ष) की miRNA मायने रखता है (log2 तब्दील हो) के खिलाफ वहीं रहे हैं। miRNAs की बहुमत आबादी में दोनों बहुत इसी तरह व्यक्त करते हैं, लेकिन कुछ विशेष रूप से सह-संबंध से विचलित। इन विचलन दोनों दुर्लभ और बहुतायत से व्यक्त लक्ष्यों के बीच में स्पष्ट कर रहे हैं। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। MiRNAs गौरतलब है और समान रूप से विभिन्न स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में आईबीएस में व्यक्त कर रहे विभिन्न व्यक्त आईबीएस में miRNAs रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार विधि है, जो श्रेणियों के भीतर स्थिरता के लिए जाँच के साथ सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण को जोड़ती है का उपयोग कर पता चला रहे हैं। करने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4:। MiRNAs गौरतलब है और समान रूप से विभिन्न आईबीएस उपप्रकारों में व्यक्त कर रहे हैं स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में miRNAs di थे(: दस्त, सी: डी कब्ज) fferentially आईबीएस-उपप्रकारों में व्यक्त किया। रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार विधि है, जो श्रेणियों के भीतर स्थिरता के लिए जाँच के साथ सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण को जोड़ती है का उपयोग कर स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 5
चित्रा 5:। MiRNA-342-3p के अंतर अभिव्यक्ति अज्ञात एटियलजि की जीर्ण पेट दर्द IBS के एक प्रमुख लक्षण है। बॉक्स साजिश से पता चलता है कि मीर 342-3p (y अक्ष पर सामान्यीकृत मायने रखता है), अज्ञात एटियलजि की पुरानी मूत्राशय में दर्द के साथ जुड़े एक miRNA, स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में सभी आईबीएस उपप्रकार भर में उच्च मायने रखता है पर संचलन में उपस्थित होने के लिए मिला था। सलाखों के गैर-ग़ैर रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं, बॉक्सतों अंतर-चतुर्थक विस्तार और नीले वर्ग मंझला गिनती। 3 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: miRNA-150 के अंतर अभिव्यक्ति दिखा रहा है कि आईबीएस प्रतिभागियों काफी अधिक थी स्वस्थ नियंत्रण (y अक्ष पर log2 तब्दील मायने रखता है) की तुलना में घूम मीर 150 मायने रखता है एक वायलिन साजिश है।। घटता श्रेणी में गिना जाता है की आवृत्ति संकेत मिलता है, ऊर्ध्वाधर सलाखों 1 और 3 चतुर्थकों प्रतिनिधित्व करते हैं, और लाल चौक मंझला गिनती इंगित करता है। 3 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

विशेष रूप से miRNA परख के लिए, यह unpurified lysates (इन mRNA और प्रोटीन assays में इस्तेमाल किया जा सकता है) का उपयोग नहीं करने के रूप में अभिकर्मकों lysates के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है महत्वपूर्ण है, और नमूना तैयार प्रतिक्रियाओं हिचकते होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, दूषित पदार्थों को सेल और आरएनए शुद्धि चरणों (जैसे, guanidinium यौगिकों, इथेनॉल, और फिनोल) से खत्म किया बंधाव और नमूना शुद्धि प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं। अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए इसलिए संवेदनशीलता और miRNA परख की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है।

एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler का उपयोग उचित तापमान नियंत्रण सभी प्रतिक्रिया कदम के प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कदम 3.5.1 के दौरान यह आदेश ligase के अलावा के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए thermocycler से स्ट्रिप्स दूर करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। स्ट्रिप्स हटाने ligase जोड़ने के लिएप्रतिक्रिया समझौता होगा। जब संकरण चरणों का प्रदर्शन, यह जब ट्यूबों में अभिकर्मकों मिश्रण जोरदार झटकों, pipetting, या flicking से बचने के लिए, के रूप में इस संवाददाता जांच कतरनी सकता है महत्वपूर्ण है। इष्टतम प्रदर्शन और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, यह अच्छी तरह से कोमल flicking द्वारा नलियों में अभिकर्मकों मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमेशा मिश्रण के बाद प्रतिक्रियाओं नीचे स्पिन, और एक नया पिपेट हर बार एक अभिकर्मक सटीक pipetting सुनिश्चित करने के लिए और आकस्मिक पार संक्रमण से बचने के लिए तिरस्कृत है टिप का उपयोग करें।

संशोधन और समस्या निवारण

कोड सेट ब्याज की केवल लक्ष्य शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह, लागत जब आगे की जांच या एक जैव हस्ताक्षर मान्य बड़ा नमूना सेट के परीक्षण के लिए अनुमति देने के लिए संतुलित किया जा सकता है। कस्टम जांच के जीन या एक ला कार्टे मेनू से उपलब्ध नहीं लक्ष्यों के लिए तैयार किया जा सकता। कम से प्रचुर मात्रा में लक्ष्य या कम एकाग्रता शाही सेना के लिए संवेदनशीलता हो सकता हैएक लंबे समय तक संकरण समय और / या उच्च संकल्प डिजिटल गिनती का उपयोग करके के लिए अनुमति से छेड़छाड़।

हमारे अध्ययन में हम पूरे रक्त से कुल शाही सेना के साथ पूर्वनिर्धारित लक्ष्य 800 miRNA पैनल का इस्तेमाल किया; हालांकि, assays अगर एक अधिक लक्षित दृष्टिकोण की जरूरत है कम miRNAs शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 24 नमूनों की कुल एक ही दिन में तैयार किया जा सकता है, 12 के दो सेट में कंपित, क्योंकि दो कारतूस आराम से रोबोट तैयार करने का स्टेशन पर पोस्ट-संकरण प्रसंस्करण के माध्यम से पारित किया जा सकता है और डिजिटल विश्लेषक पर imaged अगले दिन। 12 के बैच में नमूने के कंपित प्रसंस्करण संकरण समय मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है। कारतूस कि imaged किया गया है को बचाया और 4 सी rescanned जा करने में संग्रहीत डेटा विश्लेषण का सुझाव है कि एक उच्च संकल्प स्कैन दुर्लभ miRNAs का पता लगाने में सुधार हो सकता है, तो हो सकता है। दुर्लभ अणुओं का पता लगाने के भी लंबे समय तक के लिए नमूने hybridizing द्वारा सुधार किया जा सकता है, हालांकि, लंबे समय तक संकरण resul सकता हैoversaturation में टी और केवल परिणामों में सुधार हो सकता है, तो शुरू शाही सेना सांद्रता (बाह्य पुटिका व्युत्पन्न आरएनए के रूप में) कम कर रहे हैं। मंच की संवेदनशीलता और सटीक अपेक्षाकृत कम बहुतायत miRNAs मज़बूती से गिना जा करने की अनुमति।

तकनीक की सीमाएं

वर्णित जीन अभिव्यक्ति परख मंच केवल सरणी प्रति 800 लक्ष्यों पर निर्भर रह सकते हैं। इसलिए यह पूरी miRNA-transcriptome / पूरे transcriptome की पढ़ाई के लिए अनुकूल नहीं है। केवल जाना जाता है, का वर्णन किया है, और निर्दिष्ट लक्ष्य मंच का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, तो यह नया आणविक प्रजातियों की खोज के लिए अनुकूल नहीं है। ऐसे RNASeq या अन्य परंपरागत माइक्रोएरे तरीके के रूप में अन्य तरीकों, अधिक पूरे transcriptome खोजपूर्ण अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

IBS के लक्षणों का एक संयोजन के द्वारा होती है, principally पेट दर्द सहित; आंत अतिसंवेदनशीलता; और इस तरह बार-बार दस्त, कब्ज, या दोनों के संयोजन के रूप 9,10 आंत्र आदतों में परिवर्तन। IBS लक्षण कोई ज्ञात जैविक कारण है, और रोगियों को चिकित्सकीय महत्वपूर्ण सूजन, जठरांत्र ऊतकों, या प्रणालीगत मार्कर 9-12 की histopathological perturbations के साथ मौजूद नहीं है। शोध बताते हैं कि आईबीएस में जैविक अनियंत्रण, सूक्ष्म उपनैदानिक, और विषम है, आम विषयों में सूजन और प्रतिरक्षा समारोह में 10 के आसपास उभर रहा है। इसलिए, हम प्रयोगकर्ता से शुरू की भिन्नता को नियंत्रित करने और एक मंच है कि मज़बूती से जीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म perturbations पता लगाने में सक्षम था का उपयोग करने की जरूरत है। परख और इस प्रणाली के अद्वितीय विशेषताओं नमूना प्रसंस्करण मानकीकरण और स्वचालन के माध्यम से निपटने के प्रयोगकर्ता को कम करने, तकनीकी विचरण को कम करने के अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करने के लिए। इन सुविधाओं को ध्यान केंद्रित जांच के लिए अनुमति देते हैं और बेहद सटीक और अनुसंधान का उत्पादनeplicable डेटा। यह जब तीव्रता या प्रवर्धन आधारित विधियों का उपयोग कर कम अभिव्यक्ति लक्ष्य है कि अनदेखी या लादा जा सकता है और अधिक प्रचुर मात्रा में लक्ष्य के संकेतों के बीच में सूक्ष्म perturbations और perturbations का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। पीसीआर आधारित प्रोटीन और RNAseq तरीकों वर्णित मंच का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य विकल्प हैं और विकल्प के रूप में आकर्षक हो सकता है जब उच्च throughputs आवश्यक हैं या जब उद्देश्य पूरे transcriptome को चिह्नित करने के लिए या उपन्यास अणुओं के लिए लग रही है। हालांकि, विकल्प सही ढंग से और संवेदनशीलता का पता लगाने और दुर्लभ लक्ष्य और सूक्ष्म perturbations quantitating में रूप में अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकते।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश के बाद इस तकनीक में माहिर

आईबीएस प्रतिभागियों में घूम miRNA अभिव्यक्ति perturbations कि दोनों महत्वपूर्ण और श्रेणियों के भीतर अनुरूप होना पाया गया के एक नंबर से पता चला है। पहचान miRNAs प्रासंगिक pathwa के साथ जुड़े थेवाईएस और एक कार्यात्मक दर्द हालत (मीर 342-3p: पुरानी मूत्राशय में दर्द) सहित रोग की स्थिति, 8 और सूजन (मीर 150) 13। उदाहरण के अध्ययन के एक खोजपूर्ण लक्ष्य और हित के सिस्टम को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल पलटन के आधार पर किया गया था। अधिक लक्षित, छोटे miRNA सरणी तो निर्माण किया गया था, नमूना लागत प्रति कम करने और आदेश मान्य है और हस्ताक्षर और बायोमार्कर को परिष्कृत करने में एक लागत प्रभावी तरीके से विश्लेषण किया जाना बहुत बड़ा साथियों के लिए अनुमति देता है। जीन अभिव्यक्ति मंच परख प्रणाली माइक्रोएरे के पारंपरिक खोजपूर्ण प्रकृति और अधिक लक्षित, परिकल्पना संचालित डेटा को निखारने और आणविक हस्ताक्षर और बायोमार्कर 14-16 का परीक्षण करने के संग्रह के बीच एक संतुलन बनाता है। विधि विवो में और इन विट्रो मॉडल में आणविक और प्रोटीन perturbations जांच करने के लिए जहां वर्णित लक्ष्य miRNAs प्रयोगात्मक हैं अधिक व्यक्त या हिचकते इस्तेमाल किया जाएगा। न्यू assays mRNAs और पी के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए अनुमतिसेल और ऊतक lysates से सीधे roteins। इसके अलावा, परिधीय रक्त और मलमूत्र (जैसे, मूत्र) के विशिष्ट अंशों की शुद्धि के अनुकूलन के द्वारा और अनुरूपण और कुछ परख मापदंडों, आणविक प्रोफाइल और कम आणविक एकाग्रता भिन्न (जैसे, exosomal अंशों) के हस्ताक्षर के अनुकूलन के द्वारा जांच की जाएगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nCounter Prep-Station Nanostring N/A Essential
nCounter Digital Analyzer Nanostring N/A Essential
Spectrophotometer NanoDrop ND-1000 Can use suitable equivalent
Centrifuge Any N/A Can use suitable equivalent
MiniMicroCentrifuge Any N/A Can use suitable equivalent
Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) Any N/A Can use suitable equivalent
Qiacube Qiagen 9001292 Can use suitable equivalent
PAXgene Blood miRNA Kit Qiagen 763134 Can use suitable equivalent
PAXgene Blood Tubes VWR 77776-026 Can use suitable equivalent
nCounter Human miRNA Assay Kit Nanostring 150625 Essential
nCounter Master Kit Nanostring 100050 Essential
nSolver Nanostring N/A Essential

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References

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आनुवंशिकी अंक 117 चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम MicroRNA मल्टीप्लेक्स विश्लेषण जीन एक्सप्रेशन घूम माइक्रोएरे उच्च throughput स्क्रीनिंग आण्विक बारकोड
चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में miRNAs परिसंचारी की perturbations एक मल्टिप्लेक्स उच्च throughput जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म का उपयोग कर पाया
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Fourie, N. H., Peace, R. M., Abey,More

Fourie, N. H., Peace, R. M., Abey, S. K., Sherwin, L. B., Wiley, J. W., Henderson, W. A. Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform. J. Vis. Exp. (117), e54693, doi:10.3791/54693 (2016).

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