Abstract
Платформа анализа экспрессии генов позволяет надежной и высоко воспроизводимой количественной оценки экспрессии до 800 транскриптов (мРНК или микроРНК) в одной реакции. Анализ микроРНК подсчитывает транскриптов путем непосредственного формирования изображения и в цифровой форме подсчета молекул микроРНК, маркированные с цветными флуоресцентными наборов зондов со штрих (репортер зонда и захват зонда). Штрихкоды гибридизуют непосредственно созревать микроРНК, которые были удлиненные лигированием уникальный олигонуклеотидный тег (miRtag) к 3'-концу. Обратную транскрипцию и амплификацию транскриптов не требуются. Reporter зонды содержат последовательность из шести цветовых позиций заселенных с использованием комбинации из четырех флуоресцентных цветов. Четыре цвета более шести позиций используются для построения ген-специфической последовательности цвет штрих-кода. Постобработка-гибридизация автоматизирован на роботизированной подготовительную станцию. После гибридизации избыточные зонды смыло, и трехсторонними структурами (Capture Proбыть-микроРНК-репортер зонда) закреплены на покрытых стрептавидином ползуна через меченных биотином захвата зонда. Обработки изображений и штрих-код счета осуществляется с помощью цифрового анализатора. Иммобилизованные Barcoded микроРНК визуализируются и визуализируют с помощью микроскопа и камеры, а также уникальные штрих-коды декодируются и подсчитываются. Контроль качества данных (QC), нормализацию и анализ облегчается с помощью программного обеспечения для обработки и анализа пользовательских разработанных данных, сопровождающий программное обеспечение для анализа. Анализ показывает высокую линейность в широком диапазоне экспрессии, а также высокую чувствительность. Образец и подготовка анализа не включает ферментативные реакции, обратной транскрипции или амплификации; имеет несколько шагов; и в значительной степени автоматизирован, что снижает следователь эффекты и приводит к высокой согласованности и технической воспроизводимости. Здесь мы опишем применение этой технологии для выявления циркулирующие возмущения микроРНК при синдроме раздраженного кишечника.
Introduction
Синдром раздраженного кишечника (СРК) является наиболее распространенной амбулаторной диагностики в гастроэнтерологии, поражающих 10 - 15% от общей численности населения и представляющих значительную нагрузку на службы здравоохранения. В настоящее время, к сожалению, нет общепринятых диагностических биомаркеров для IBS (т.е. диагноз на основе клинических симптомов и исключает другие органические расстройства, такие как GI злокачественности, воспалительные заболевания кишечника и желудочно - кишечного тракта (GI) инфекции). При изучении профилей экспрессии генов в общих условиях с субклиническим гистопатологией, таких как IBS, высокая чувствительность и точность (воспроизводимость) необходимы, так как возмущения в профилях экспрессии генов часто являются тонкими 1-3. микроРНК были идентифицированы как диагностические и функциональные цели в IBS 4,5, и мы особенно заинтересованы в оценке их использование в качестве циркулирующих биомаркеров IBS-ассоциированных биологических возмущений 3,4,6,7. Клиническое использование циркуляциейтин биомаркеры представляет интерес в настоящее время из - за легкости и минимально инвазивной характер коллекции источника биомаркеров "(например, периферической крови) у пациентов.
Генные анализы экспрессии платформы, из-за их уникальной химии и обтекаемый, в основном автоматизированный рабочий процесс, обеспечить платформу микрочипов, которая обеспечивает широкий охват и настраиваемый (800 мишеней в одной реакции) транскриптома для целенаправленного обнаружения. Кроме того, они дают высокую точность и линейность в широком спектре уровней экспрессии в квантификации транскриптомных целей. Анализ не требует обратной транскрипции РНК, амплификации в результате кДНК, или любые другие ферментативные реакции. Таким образом, потенциальные ошибки, вносимые большим числом циклов амплификации из видов РНК с низким изобилием или редкими сплайс уменьшаются в процессе цифрового подсчета. Это означает, что большое разнообразие типов образцов, например, очищенную общей сложностиРНК (т.е., мРНК + микроРНК), РНК из фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцов, а также сырой ткани и клеточных лизатов, могут быть использованы с анализами.
РНК интересов обнаруживаются с помощью пары зондов (захват и репортер зондов), каждая из которых содержит последовательность специфичных для мишени, распознающий соответствующую область на РНК-мишени. Для того , чтобы обеспечить обнаружение коротких РНК (т.е., микроРНК), зрелой последовательности микроРНК удлиняется путем отжига уникальный олигонуклеотидный метки (miRtag) к 3' - концу молекулы. Мостиковую олигонуклеотид, который комплементарен части как зрелый целевой микроРНК и микроРНК-специфической miRtag, используется для обеспечения последовательности специфичности. Захват и репортер зондов лигировать к 3 'и 5' концы зрелого комплекса микроРНК-miRtag соответственно. Зонды захвата имеют метку биотин на 3'-конце, которые позволяют им прикрепляться к поверхности покрытых стрептавидином предметное стекло, FIXIнг улавливающей зонд-микроРНК-miRtag-репортер зонда комплекса на слайде. Электрический ток затем используется для ориентации комплекса на поверхности скольжения, позволяя флуоресцентные штрих-коды, переносимые репортер зонда на 5 'конце, чтобы быть визуализированы с помощью микроскопа и прибор с зарядовой связью (CCD) камеры. Штрихкоды подсчитываются и декодированию, что дает подсчет конкретных целевых микроРНК. Флуоресцентные штрих-кода состоит из шести позиций, которые могут быть заняты одним из четырех флуоресцентных цветов, которые могут быть использованы для построения более 4000 комбинаций цветовой штрих-кодов, каждый кодирующий специфической РНК.
Подготовка образца (т.е., очистка РНК или клеток / ткани препарат лизата), а также гибридизация захвата и репортер зондов, сделаны на скамейке запасных. Двенадцать образцов могут быть мультиплексированы на одном слайде. После гибридизации в течение ночи, вся дальнейшая подготовка образца осуществляется роботизированной подготовительную станцию. Загруженные слайды, которые затем передаются на объявлениеigital анализатор для работы с изображениями, подсчета голосов, декодирования и обработки данных. Полученные данные импортируются в сопроводительного программного обеспечения, где они дополнительно обрабатываются с высокой степенью контроля пользователя. Уникальная химия, простая подготовка, автоматизированная природа, простой тип данных (счетчики), и в целом упорядоченный документооборот данного анализа облегчают высокоточной экспрессии генов количественной оценки, что делает его полезным инструментом при изучении циркулирующие профилей экспрессии микроРНК и подписи в функциональных состояниях, таких как IBS.
Protocol
Исследование, описанное здесь, было одобрено Институциональным наблюдательным советом Национального Института Здоровья (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Сбор образцов цельной крови
- Сбор образцов цельной крови (2,5 мл) из участников исследования с помощью венепункции в сбора крови пробирки, содержащие РНК стабилизирующий раствор (с учетом долгосрочного хранения), и хранить их при температуре -80 ° С до очистки РНК.
2. Общая РНК Очистка
- Оттепель и инкубировать пробирки крови в течение 2 ч, а затем центрифугировать их, используя откидную ротор в течение 10 мин при 5000 х г. Удалить супернатант тщательно поливом или пипеткой его в трубу отходов, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить осадок.
- Вымойте гранул путем добавления 4 мл РНКазы без воды, надежно заменить крышку, и вихрь, пока осадок не растворяется заметно. Центрифуга с помощью поворотно-роторе при 5000 мкг в течение 10 мин и повторнопереместить супернатанта, как описано на стадии 2.1.
- Добавьте 350 мкл буфера BM1 (прилагается) к осадку. Vortex осадок, пока он заметно растворяется и перенести его на 2-мл пробирку обработки для автоматизированной экстракции суммарной РНК.
- Выполнить автоматическую очистку внутриклеточных РНК, включая микроРНК, из цельной крови с использованием коммерчески доступного набора для экстракции РНК, которые могут быть автоматизированы на роботизированной системе экстракции РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная роботизированная система мы использовали может обрабатывать двенадцать образцов в то время, и это занимает 3 часа для протокола очистки РНК для завершения.- Загрузите предварительно загруженным пипеток, центрифужные пробирки, буферы и реагенты, представленные в наборе для очистки РНК в роботизированной системы экстракции РНК.
- Выберите протокол "Кровь микроРНК Часть A" из меню выбора протокола и запустить прогон.
ПРИМЕЧАНИЕ: См дополнительные материалы для описания автоматизированных процедур. - После того, как робот совместноmpleted Часть A автоматизированного протокола очистки микроРНК, опорожнить емкость отходов и удалить использованные пластмассы и контейнеры с реагентами из роботизированной системы.
- Закройте крышки на всех микро-центрифужные пробирки, содержащие элюированный РНК и поместить их в адаптер шейкера. Выберите "Кровь микроРНК Часть B" из меню выбора протокола инкубировать образцов при 65 ° С в течение 5 мин.
- После того, как робот завершил ходовая часть B протокола очистки микроРНК, немедленно удалить образцы и охладить их на льду.
- Количественной оценки и оценки качества очищенной РНК с использованием спектрофотометра.
Примечание: В соответствии с рекомендациями протокола для анализа микроРНК, минимальной концентрации 33 нг / мкл требуется, и все образцы должны соответствовать или превышать соотношения 1,9 280/260 и 260/230 минимальный коэффициент 1,8, чтобы гарантировать отсутствие значительного органического загрязнения, что может повлиять на производительность анализа (см Reference 17). - Храните образцы при -80 о С.
3. микроРНК Подготовка образцов
- Нормализовать 12 образцов РНК до 33 нг / мкл с помощью нуклеазы без воды.
- Приготовьте 1: 500 разбавление управления микроРНК, представленных в наборе для анализа с использованием нуклеазы без воды. Держите на льду.
- Подготовка мастер смеси отжига: объединить 13 мкл буфера для отжига (при условии), 26 мкл miRtag реагента (при условии) и 6,5 мкл управления микроРНК (полученного на стадии 3.2) с использованием 10- и 20-мкл пипетки.
- С помощью 10-мкл пипеткой, добавить 3,5 мкл мастер отжига смеси и 3 мкл образца РНК (то есть, 100 нг) к каждому из двенадцати 0,2-мл полосковых трубок. Флик смешивать, спин вниз , используя настольный мини микроцентрифуге (2000 XG), а также место в амплификатор (94 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 2 мин и 45 ° С в течение 10 мин, выдержка при 48 ° С) ,
- Подготовка мастер смеси лигирования путем объединения 3 мкл буфера для лигирования (при условии) и 19.5 мкл полиэтиленгликоля (ПЭГ, при условии) с использованием 20-мкл пипеткой. Добавить 2,5 мкл основной смеси для лигирования к каждой из полосковых трубок с шагом 3,4 с помощью 10-мкл пипеткой.
- Осторожно перемешать, спина вниз с помощью мини настольный микроцентрифужных (2000 XG), и вернуться к амплификатор при 48 ° С в течение 5 мин. Через 5 мин с помощью 10-мкл пипеткой, добавляют 1 мкл лигазы непосредственно в каждую пробирку , в амплификатор и инкубировать их при 48 ° С в течение 3 мин, 47 ° С в течение 3 мин, 46 о С в течение 3 мин, 45 O С в течение 5 мин и 65 ° С 10 мин; держать при температуре 4 о С.
- Удалить труб из амплификатора, смешать их мягко, спина их вниз с помощью мини настольный микроцентрифужных (2000 XG), и добавить 1 мкл лигирования очистке фермента (при условии). Инкубировать пробирки в амплификатор (37 ° С в течение 1 часа и 70 ° С в течение 10 мин; выдержка при 4 °
- Удалите трубы и, используя 100-мкл пипетки внести 40 мкл нуклеазы без воды, перемешать, и спин вниз с помощью мини настольный микроцентрифужных (2000 XG).
4. микроРНК гибридизация
- Оттепель репортер и наборы захвата зонда (прилагается) на льду и спина их вниз с помощью мини настольный микроцентрифужных (2000 XG).
- С помощью 200-мкл пипетки, добавьте 130 мкл буфера гибридизации с репортером кодового набора трубки (130 мкл) для создания мастер-гибридизация смеси. Смешайте и спин вниз с помощью мини настольный микроцентрифужных (2000 XG).
Примечание: Reporter улавливает зонды являются специфическими и стандартом для каждого микроРНК включены в панель. Пользовательские панели и пользовательские разработаны захвата и зондов наборы могут быть разработаны. - В 12 новых ленточных труб 0,2 мл, добавляют 20 мкл смеси мастер-гибридизация с использованием 20-мкл пипетки.
- Денатурации образцы микроРНК с шага 3.7 при 85 о С FoR 5 мин и охладить их на льду. Добавьте 5 мкл в каждую из пробирок с шага 4.3 с помощью 10-мкл пипеткой.
- Программа амплификаторе до 65 ° С в 30 мкл объема рассчитанной температуры и нагревают крышку в навсегда установки времени (не программировать его сползать вниз до 4 ° С в конце пробега).
- С помощью 10-мкл пипетки внести 5 мкл захватывающего зонда , установленного в каждую пробирку, перемешать, вращение вниз с помощью Benchtop мини микроцентрифужными (2000 XG), и сразу же место в амплификатор при 65 о С. Выдержите в течение не менее 12 часов и не более 30 часов.
5. Prep Station и цифровой анализатор
- Загрузите подготовительную станцию.
- Откройте дверцу станции и загрузите листы реагента (при условии), картридж (прилагается), пипеток (прилагается), подготовленные образцы в двенадцати 0,2-мл полосковых трубок, и двенадцать пустых 0,2-мл стрип трубок (прилагается). Снимите колпачки полосы трубки и реагента накрыватель. Закройте Prep-станциядвери и запустить соответствующий анализ с помощью панели управления.
Примечание: обработка пост-гибридизация же, независимо от анализа запущенной. Все реагенты и пластмассовые изделия являются расфасованный и не требуют никакой подготовки, кроме доведение их до комнатной температуры и спиннинг вниз для реагентов, содержащий 96-луночные планшеты в количестве 2000 мкг в течение 2 мин. Все компоненты загружаются в четко определенных позиций в подготовительную станции. См дополнительные материалы для описания автоматизированных процедур.
- Откройте дверцу станции и загрузите листы реагента (при условии), картридж (прилагается), пипеток (прилагается), подготовленные образцы в двенадцати 0,2-мл полосковых трубок, и двенадцать пустых 0,2-мл стрип трубок (прилагается). Снимите колпачки полосы трубки и реагента накрыватель. Закройте Prep-станциядвери и запустить соответствующий анализ с помощью панели управления.
- Визуализируйте и считать штрих-коды с иммобилизованными и ориентированных трехсторонние комплексов.
- Извлеките картридж из преп станции, запечатать его с покровных стеклах, предусмотренных, и поместить его в цифровой анализатор в щель над оптикой камеры.
- Выберите соответствующий анализ (микроРНК панель анализа) и анализа версии, указанной на набора для анализа и запустить программу.
Примечание: Цифровой анализатор затем принимает поле зрения изображения для каждой позиции образца Aт четыре длины волн возбуждения, позволяя флуоресцентные штрих-коды для чтения и декодирования. Конкретные штрих-коды, соответствующие конкретной микроРНК, подсчитываются. - Экспорт файлов данных на USB или непосредственно к серверу через интернет-связь.
6. Обработка и анализ данных
- Нажмите на вкладке "Raw Data" и выберите "Импорт файлов" РКЦ. Выберите папку, содержащую файлы РКЦ (файлы необработанных данных) от USB.
- Нажмите "Next", выберите все флажки КК, и нажмите кнопку "Импорт".
- Нажмите на вкладку "Новое исследование". Название и описание исследования и сохранения.
- В новом исследовании, выберите вкладку "Новый эксперимент" и имя и описать новый эксперимент. Нажмите "Next" и выберите папку RLF из левой панели, которая содержит соответствующие файлы исходных данных, которые были загружены. После того, как он был выбран, нажмите на кнопку "Keep Selected", а затем нажмите кнопку "Далее".
- ДобавитьАннотации, если необходимо, и нажмите кнопку "Далее".
- Выберите метод вычитания фона; либо отрицательный контроль, пустой переулок вычитание, или определяемые пользователем вычитания могут быть выбраны. После выбора, нажмите кнопку "Далее".
Примечание: Определить наиболее подходящий подход коррекции фона на основе технических параметров и биологического контекста исследования.
Примечание: Графы менее точны для низкого обилия целей. Для целей исследования мы описываем здесь, данные были сначала обрабатываются без коррекции фона для изучения параметров QC и исследовать изменение графов для микроРНК различных содержаний через технических повторах. Эти данные были затем переработаны с использованием фонового порога 25-счета. - Выберите "Top 100" нормализации, а затем нажмите кнопку "Далее".
- Для того, чтобы получить данные о соотношении, выбрать параметры соотношения, а затем нажмите кнопку "Далее".
- Нажмите кнопку "Закончено".
- Нажмите на имени эксперимента в левой панели, чтобы открыть выпадающее меню, содержащее "сырой", "нормализованной", "Группировать", "Соотношение данных" и "Анализ данных".
- Нажмите на "Raw Data" и наблюдать отчет QC в правой панели. Обратите внимание на флаг рядом с образцами, которые не проходят параметры QC по умолчанию. Построить новый "исследование", которое не включает образцы помеченных и повторно обработать, как описано, или просто исключить маркированные образцы QC из стадии анализа данных, выбрав "Исключить образцы флага / нормализации QC".
- Экспорт "Сырье", "нормализованной", или файлы "сгруппированными" данные в CVS или другой совместимый формат файла для анализа в другой статистической или микрочипов программного обеспечения.
- Выберите "нормализованные данные" из левой панели и выберите образцы, которые будут включены в анализ в правой панели.
- Нажмите на кнопку "Анализ" и выберите нужный тип анализа (например, "Heat Map & #34 ;, "Скрипка земля", "земля Box", "Scatter земля", или "Гистограмма земля"). Выберите нужные критерии исключения окна (например, исключить образцы Outlier или гены, исключают образцы флагами QC, исключают гены контроля, и / или исключить Нормализация зондов из анализа данных).
- Выбор отдельных образцов, которые будут исключены из анализа, как хотелось бы.
- Выберите отдельные гены, которые будут исключены из или включены в анализ по своему желанию.
- Выберите параметры для выбранной статистической или визуализации данных манипуляций и нажмите на кнопку "Готово".
Representative Results
Транскриптомных возмущение в функциональных расстройств может быть тонким, и для того, чтобы надежно обнаружить эти тонкие изменения в выражении, количественное определение экспрессии генов должно быть точным. Система экспрессии генов платформа анализа снижает технический уровень шума за счет его высокой степенью автоматизации характер, и уникальный химический она использует производит данные экспрессии генов с высокой точностью. Технический реплицируется показано на рисунке 1 демонстрируют высокую воспроизводимость в обоих эндогенных (синие точки) и вирусный микроРНК (оранжевые точки; генов домашнего хозяйства представлены желтыми точками) выражение квантификацией, возможно с помощью этого метода. С помощью этого метода, вирусные (фиг.2А) и эндогенную (рисунок 2b) микроРНК , которые показывают отклонение от ожидаемого выражения, как это определено здоровых участников исследования, могут быть идентифицированы в качестве мишеней , представляющие интерес в IBS. Следует отметить, что неясно, является ли вирусные микроРНКобнаруженных здесь происходят от вирусных генов, интегрированных в геном человека или от вирусной нагрузки. Поскольку анализ учитывает только зрелые микроРНК с одной нуклеотидной специфичности, Перекрестные с аналогичными эндогенных человеческих микроРНК маловероятно. Тем не менее, дифференциальные уровни устойчивого состояния этих молекул представляют интерес в качестве биомаркеров. Точность метода позволяет возмущения среди низких целей экспрессии, чтобы обнаружить, как и точное обнаружение этих транскриптов не завален из более обильным транскриптов. Незначительные возмущения также может быть надежно наблюдается. На рисунках 3 и 4 показаны некоторые из этих возмущений в циркулирующих микроРНК в IBS и IBS-подтипов по сравнению со здоровыми контроля, а также 5 и 6 (оба адаптировано из 3) показывают два наиболее значимых дифференциально повышенных микроРНК (Рисунок 5: микроРНК 342-3p, Рисунок 6: микроРНК 150). у участников IBS Рисунок 6 является примером графического вывода результатов, полученных с помощью соответствующего программного обеспечения.
. Рисунок 1: Нормированные Графы из двух технических повторах Технический реплицируется работать на двух отдельных картриджей показывают высокую линейную корреляцию (R 2 = 0,90, у = 1.03x - 0,4) в диапазоне нормализованная (нормированы на топ - 100 выразил микроРНК) микроРНК подсчитывает (log2 рассчитывает на х- и у-оси). Разброс участок включает в себя данные для эндогенных микроРНК человека в синем (654 микроРНК), эндогенные вирусные микроРНК оранжевого цвета (80 микроРНК) и генов домашнего хозяйства в желтый (8 генов). Эндогенные вирусные микроРНК были доступны в более ранних версиях анализа (версия 1.4 была здесь используется), но больше не включены в стандартном анализе, хотя они доступны в качестве пользовательских дополнений./54693fig1large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Нормированные Графы вирусными и эндогенного человеческого микроРНК в IBS-запорах (IBS- C) по сравнению с здоровых людей Возмущения в (а) вирусный (оранжевый) и (б) эндогенные человека микроРНК (синие) очевидны в этом примере, где микроРНК подсчитывает (log2 преобразованных) участников IBS-C (по оси Y) являются регресс против графов микроРНК (log2 трансформированных) здоровых управления (ось х). Большинство микроРНК выражают очень так же в обеих популяциях, но некоторые особенно отклоняются от корреляции. Эти отклонения проявляются как среди редких и обильно выраженных целей. Пожалуйста ,Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: микроРНК Знаменательно и Равномерно Дифференциально Выраженный в IBS по сравнению со здоровыми Controls Дифференциально выразил микроРНК в IBS выявлены с использованием линейного дискриминантного метода размер эффекта анализа, который сочетает в себе тесты статистической значимости с проверками для согласованности внутри категорий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рис . 4: микроРНК Знаменательно и Равномерно Дифференциально Выраженный в IBS подтипов по сравнению со здоровыми Controls микроРНК были диfferentially выражается в IBS-подтипов (-D: диарея, -C: запор). по сравнению со здоровыми контроля с использованием линейного дискриминантного метода анализа размера эффекта, который сочетает в себе тесты статистической значимости с проверками для согласованности в рамках категорий Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.
Рис . 5: Дифференциальная экспрессия микроРНК-342-3p Хроническая боль в животе неясной этиологии является основным симптомом IBS. Коробка участок показывает, что микроРНК-342-3p (нормированный рассчитывает на оси у), микроРНК, связанный с хронической болью мочевого пузыря неясной этиологии, было обнаружено, что присутствие в обращении при большем количестве во всех подтипов IBS по сравнению с здоровых людей. Столбики показывают не Outlier диапазон, коробкаэс диапазон между квартиль и синий квадрат средний отсчет. Измененный 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Дифференциальная экспрессия микроРНК-150 скрипка график , показывающий , что участники IBS значительно выше у циркулирующих микроРНК-150 отсчетов по сравнению со здоровыми контрольной группы (log2 трансформированные рассчитывает на оси у).. Кривые показывают частоту отсчетов в категории, вертикальные полосы представляют собой 1 - й и 3 - й квартили, а красный квадрат обозначает медиану подсчет. Измененный 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Для анализа микроРНК, в частности, важно, чтобы не использовать неочищенную лизатов (они могут быть использованы в мРНК и белкового анализа), так как реагенты не были оптимизированы для использования с лизатов, и реакции подготовки образца могут быть подавлена. Кроме того, загрязняющие вещества , перенесенных с стадий очистки лизис и РНК (например, гуанидиния соединений, этанол и фенолов) могут ингибировать лигирования и очистки образца реакции. Хорошее качество РНК Поэтому крайне важно, чтобы чувствительность и точность анализа микроРНК.
Использование Термоциклер с подогревом крышкой имеет решающее значение для обеспечения надлежащего контроля температуры, чтобы оптимизировать производительность всех стадий реакции. Во время этапа 3.5.1, важно, чтобы не удалить полоски из амплификатора для того, чтобы поддерживать температуру во время добавления лигазы. Удаление полоски для добавления лигазыухудшала реакцию. При проведении операций гибридизации, важно, чтобы избежать интенсивного встряхивания, пипетирования или щелкать при смешивании реагентов в трубах, так как это может сдвигать репортер зондов. Для обеспечения оптимальной производительности и последовательности, важно тщательно перемешать реагенты в трубках путем осторожного стряхивая. Всегда со спином вниз реакции после смешивания, и использовать новый наконечник пипетки каждый раз, когда реагент дозируется для обеспечения точного пипетирования и во избежание случайного перекрестного загрязнения.
Модификации и устранение неисправностей
Эти кодовые наборы могут быть настроены для включения только цели, представляющие интерес. Таким образом, расходы могут быть сбалансированы, чтобы позволить проводить тестирование больших наборов образцов при дальнейшем исследовании или проверки био-подпись. Пользовательские зонды могут быть сконструированы для генов или нет целей , доступных в меню а ля карт. Чувствительность для менее распространенных целей или низкой концентрации РНК может бытьманипулировали, позволяя в течение более длительного времени, гибридизация и / или с помощью более высокого разрешения цифрового подсчета.
В нашем исследовании мы использовали предопределенную 800 целевой микроРНК панель с тотальной РНК из цельной крови; Однако, анализы могут быть настроены, чтобы включать в себя меньшее количество микроРНК, если более целенаправленный подход необходим. В общей сложности 24 образцов могут быть приготовлены в один день, в шахматном порядке в два набора из 12, так как два картриджа с комфортом можно пропустить через обработки после гибридизации на роботизированной подготовительную станцию и отображается на цифровом анализаторе на следующий день. Staggered обработка выборок в партиях от 12 важно, чтобы унифицировать время гибридизации. Картриджи , которые были изображаемого могут быть сохранены и храниться при перепроверялись 4 ° С , если анализ данных позволяют предположить , что более высокое разрешение сканирования может улучшить обнаружение более редких микроРНК. Обнаружение более редких молекул также может быть улучшена путем гибридизации образцы дольше; Однако, длительное гибридизация может Ресулт в перенасыщенности и может только улучшить результаты, если исходные концентрации РНК являются низкими (как во внеклеточной везикул производных РНК). Чувствительность и точность Платформе позволяют относительно низкой численности микроРНК быть достоверно подсчитаны.
Ограничения техники
Описанный анализ экспрессии генов только платформа вмещает до 800 целей на массив. Поэтому не подходит для всего микроРНК-транскриптом / целые исследования транскриптом. Только известно, описано, и указанные цели могут быть обнаружены с помощью платформы, поэтому он не подходит для открытия новых видов молекул. Другие методы, такие как Секвенирование РНК или другие традиционные методы микрочипов, больше подходят для целом транскриптом разведочных работ.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
СРК характеризуется сочетанием симптомов, Принв том числе боли образом в трудах брюшной полости; висцеральная гиперчувствительность; и изменения в привычках кишечника, такие как частые диарея, запор, или комбинацией обоих 9,10. Симптомы СРК не имеют никаких известных органических причин, и пациенты не представляют с клинически значимого воспаления, гистологических возмущениям желудочно - кишечных тканей или системных маркеров 9-12. Исследования показывают , что биологическая дисрегуляция в IBS является тонким, субклинический и гетерогенный, с общие темы возникающие вокруг воспаления и иммунной функции 10. Таким образом, нам необходимо контролировать экспериментатора с введенным вариацию и использовать платформу, способную надежно обнаруживать тонкие возмущения в экспрессии генов. Уникальные атрибуты анализа и системы стандартизации обработки проб и уменьшить экспериментатора обработки за счет автоматизации, уменьшая техническую дисперсию для получения высокой воспроизводимости данных. Эти особенности позволяют целенаправленных исследований и производить высокоточную и гeplicable данных. Это позволяет для обнаружения тонких возмущений и возмущений среди низкой экспрессии мишеней, которые могут быть пропущены или завален сигналами более обильными мишеней при использовании по интенсивности или амплификации на основе методов. Основанные на ПЦР-микрочипов и методы Секвенирование РНК являются приемлемой альтернативой с использованием описанного платформы и может быть привлекательным в качестве альтернативы, когда более высокие пропускные способности необходимы или когда цель состоит в том, чтобы охарактеризовать весь транскриптом или искать новых молекул. Тем не менее, альтернативы не может выполнить, а в точно и чутко обнаружения и количественной оценки редкие цели и тонкие возмущения.
Будущие приложения или направления после освоения этой технике
Циркулирующие экспрессия микроРНК у участников IBS показала ряд возмущений, которые были найдены, чтобы быть как значительными и последовательными в рамках категорий. Выявленные микроРНК были связаны с соответствующими pathwaYS и патологические состояния, в том числе функциональное состояние боли (MIR-342-3p: хроническая боль в мочевом пузыре) 8 и воспаления (MIR-150) 13. Пример исследование было основано на разведочной группы, используемой для определения целевых показателей и систем, представляющих интерес. Более целенаправленной, меньший массив микроРНК Затем была построена, опускании на стоимости образца и позволяет значительно больших когорт, которые будут проанализированы в экономически эффективным образом с целью подтверждения и уточнения подписей и биомаркеров. Система платформы анализа экспрессии генов баланс между традиционным поисковым характером микрочипов и более целенаправленной, обусловленного гипотезами сбора данных для уточнения и проверки подписей и молекулярных биомаркеров 14-16. Метод будет использоваться для изучения молекулярных и белковые возмущения в в естественных условиях и в моделях пробирке , где описанные мишени микроРНК экспериментально сверхвыражен или законсервировано. Новые анализы позволяют для одновременного количественного определения мРНК и рroteins непосредственно из клеток и тканей лизатов. Кроме того, за счет оптимизации очистки определенных фракций периферической крови и экскрементов (например, мочи) и путем настройки и оптимизации некоторых параметров анализа, молекулярные профили и подписи низких фракций концентрации молекул (например, exosomal фракции) будут рассмотрены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
