Introduction
在近几十年中，成像技术已经彻底改变，医生诊断和监测疾病的方法。这些成像技术，然而，已经在很大程度上仅限于全身成像系统，例如正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层摄影（SPECT），计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。特别注意了癌症，而技术突破成像有很大的提高，这种病诊断和治疗的方式。尽管有这些进展，但是一个地方，这些成像技术只是不适合：手术室。虽然全身成像技术可在手术计划帮助下，他们通常缺乏空间分辨率足够高，以帮助医生实时确定是否所有的肿瘤组织已被删除或残留的肿瘤组织仍然在手术切缘1隐藏。确保无浸润肿瘤边缘被留下是最重要的手术目标之一，和外科医生必须走严格而谨慎的组织切除之间的紧绳子。如果太多被去除，不需要的副作用对患者正在加剧;如果太少被删除，复发率增加2，3。因此，划定精确的肿瘤边缘是至关重要的，而且我们相信，化学发光成像术可通过帮助医生形象化恶性组织，否则会没有被发现已建立的技术，以提高肿瘤边缘的识别精度。
目前正在调查其可能的实用程序，术中成像系统的许多影像技术。这些包括β-和γ射线发射探头4，光学荧光5，拉曼光谱6 >，7和切伦科夫发光8,9。迄今为止，然而，没有这些都成为确立为标准的临床工具。光学荧光成像迄今被证明是最有前途的这些技术，因此是最探讨。虽然它已经被证明是对许多应用的有价值的工具，它也不是没有局限性。事实上，它的主要缺点是由固有的自发荧光的生物组织所产生的背景荧光。这样的背景自发荧光信号是周围组织的激励的产物，除了荧光团，通过所需要的荧光信号的产生的外部光源。从实践的角度来看，这自发荧光可以潜在地导致低信号对噪声比，它可以限制在手术室这种技术的效用。
校长优势化学发光成像在荧光成像是没有激发光是必要的。其结果是，没有背景自发荧光。在化学发光成像，代替化学生成的激发能量。这一过程不会产生意外的背景信号，因此可以导致更高的信号 - 噪声比。这可能最终导致手术切缘的更精确和准确的检测。出人意料的是，这种方法作为一种手术成像技术的效用仍然未开发的10。事实上，最近的例子，这种技术是鲁米诺由髓过氧化物酶的小鼠11，12，13的氧化。因此化学发光生物医学成像是研究的一个，而未开发地区，可以具有以下优点：（1）导致与喜低背景信号最小自发荧光gher信号 - 噪声比; （2）化学发光发射范围从可见光到近红外的波长可调波长; （3）官能化的化学发光复合物，当与连接器的技术相结合，有针对性已经存在的生物分子，靶向分子成像探针14的整个库提供接入。
验证的原理该研究说明了化学发光成像在使用基于钌 - 成像剂的生物医学设置的潜在效用。该化合物的化学发光特性很好的研究，以调查可追溯至60年代中期15。经化学活化，所述试剂产生在约600毫微米16的光，这是非常适合用于医疗成像目的。活化能是由导致激发态-其具有650纳秒寿命在水中17 -foll的氧化还原反应提供在此激发态的松弛由光子的产生欠款。通过使用一个特别设计的远程喷雾器的，我们能够检测到化合物既体外 和体内 。最初的实验的结果是非常有前景的，这表明该技术的进一步调查。
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Protocol
伦理学声明：以上所描述的，根据经批准的协议，并在纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的道德准则进行体内动物实验。
1.一雾化装置的构建
- 木连接部分A（12.5×2.5×1.8 cm 3）的直立用两个螺丝（4×25 平方毫米）B部分（12.7×10.7×1.8 立方厘米 ）的中心。附上木质部-C（11×2.5×1.8 毫升 ），以利用一个螺钉，使得C部分（11×2.5×1.8 毫升 ）仍可被移动部A（12.5×2.5×1.8 毫升 ）的中间。 见图1。
- 钻两个孔通过塑料3盎司微型喷雾器（D）的喷射瓶扳机的下部末端，并按下一个不锈钢棒（10厘米的1/16“钢）（E）通过，以形成两个环，一个在任一触发器的一侧。 包住喷射瓶用胶带（F）的底部，以防止滑出扎带。附加喷雾瓶使用两个塑料扎带木质部C（11×2.5×1.8 毫升 ）（28厘米）（G）。
- 切断011伺服电机（Ⅰ）中，用伺服控制（H）的松散的电缆重新连接。然后，伺服电机连接至用胶带木质部A（12.5×2.5×1.8 毫升 ）的顶部。
- 附加铅笔（J）使用回形针（K）伺服电机控制杆。紧密连接的铅笔用塑料盖扭线（L）钢棒循环的最外层部分和安全的用胶带铅笔的末端。
- 切断伺服电机控制单元的磁电缆连接器（M），并将其重新连接到扬声器连接线（N）。然后，伺服电机控制部胶带到木质部B（12.7×10.7×1.8 毫升 ）。切断与磁性连接器的W1的电缆在一半和附加一个部分在铜S的松散端调峰电缆（1米）。连接（磁）12拨动开关和P1的电源可用W1电缆和一个9V电池。
2.方法的灵敏度测定
- 在1.5毫升离心管中，在260微克（347纳摩尔），52微克（69纳摩尔），26微克（34纳摩尔）金额反渗透水（100微升）准备[茹（联吡啶）3] Cl 2的的解决方案，5微克（6.9纳摩尔），3微克（3.5纳摩尔），520纳克（694皮摩尔），260纳克（347皮摩尔），52纳克（69皮摩尔），26纳克（34皮摩尔），5毫微克（6.9皮摩尔）和3纳克（3.5皮摩尔）。
- 混合100μL的每个的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的溶液与100微升硝酸铵铈的水溶液（（NH 4）2的Ce（NO 3）6）在显微镜载玻片上的水（25毫摩尔）。
- 通过初始化成像软件建立在生物发光读者收购。
- 登录到用户配置文件，并寻找阿奎习得的控制面板。点击“初始化”，等到仪器准备。
- 寻找“拍摄模式”，并确保“发光”和“照片”被选中，而“荧光”是没有选。
- 改变“曝光时间”为“发光”设置为20秒。设置“发光”其余的设置如下：“分档”：中等; “F /停止”：1;和“排放过滤器”：打开。
注：曝光时间可能需要根据仪器和所用的实验设置，可以适于，如果从呈现的设置不同。 - 对于“照片”，请使用以下设置：“接触时间”：自动; “分档”：中等;和“F /停止”：8.对于“视场”下拉菜单成像target.Look调整“主题高度”。初始设置为“C”。 C在更改为“B”（14厘米的距离相机和样品台）。
- 通过将显微镜载玻片上黑施工纸张上成像室以保护其免受氧化剂的地板的片材设置的喷雾器。混合100μLdroplet的[茹（联吡啶）3] Cl 2的-solution用100微升的水溶液（NH 4）2铈（NO 3）6.观察绿框十字线。
- 放置在黑色施工纸成像对象，使得所感兴趣的区域是在绿色光盒瞄准器的中心显示在样品台上。由木支持卸下塑料喷雾瓶准备喷雾器。补的三乙胺中的溶液（1:3的水/乙醇）成其塑料容器和其重新安装到木支撑。
- 将生物发光读取器内部雾化器，确保电源线从电源线雾化器断开。确保电源开关是，拨动开关处于关闭状态，红色LED亮起。放置喷雾器，使得喷射流指向朝向上的成像对象感兴趣的区域，同时尽量减少从摄像机朝向由喷嘴头的成像对象的视图阻塞。
- 将在任何潜在的热点黑色小片建筑用纸（如白色的痕迹在显微镜载玻片或注射部位），从喷雾保护他们。地点的至少40厘米的成像室内部的喷雾器遥控线的，使得它不与成像对象，喷雾器，或磁性门闩干扰。关闭成像系统的门。
注意：十字线将根据“视场”改变大小设置“生活图片;”确保此设置为“B”。
- 通过启动成像序列获取图像。点击“获取的”中“采集控制面板”。在第一摄像色曲ENCE，如果需要的话（推荐）使自动保存，并选择一个数据文件夹。忽略“编辑影像标签”对话直到序列的结束。
注：控制软件显示仪表的行动一步一步的实时性。制备测量和移动所述样本台，以合适的位置之后，它打开相机快门和计数测量时间。活门开启也可以通过由机器产生的咔嗒声听到。 - 通过切换切换开关三次，以产生化学发光：在快门打开时，喷三乙胺的溶液的三连发（在水/乙醇3，每喷突发0.24±0.04毫升1）。
注：样品阶段将在测量过程中移动。留出足够的（最少40厘米）的电缆在仪器内部，让这一点。确保该溶液通过喷雾器喷洒可由上升管被渴望并有在管道中没有气泡。有几个备用BATTERIES为喷雾器准备需要的情况下。
3. 在体内成像全身静脉注射后
- 在1.5毫升微量离心管中，制备100微升含有的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的8和33之间纳摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。制备的水溶液（NH 4）2的Ce（NO 3）中的同时用水（25毫摩尔）6。
- 静脉内注射100微升的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中成健康小鼠的尾静脉中（N = 5）。
- 通过CO 2窒息注射后安乐死的小鼠10分钟。
- 从躯干Y切割取下皮肤，然后取出肋弓的U形，露出心脏和肺部。通过一个24号针头在右心房切割的出口和注入20毫升的PBS到左心室18灌注小鼠。通过腹部经过精心切割皮肤和揭露肾脏和肝脏。纵向切开通过机关创建一个可见的削减。
- 如步骤2.3-2.6中所述，做出了以下改变设置的采集。
- 彻底冲洗喷雾器塑料储之后，具有的（NH 4）2的Ce（NO 3）6在水代替三乙胺溶液（25毫摩尔）填充。
注意：要彻底冲洗每次使用后喷嘴雾化器，因为结晶是很重要的（NH 4）2铈（NO 3）6可经过多次使用破坏喷嘴。
- 彻底冲洗喷雾器塑料储之后，具有的（NH 4）2的Ce（NO 3）6在水代替三乙胺溶液（25毫摩尔）填充。
- 使用整个动物或器官样品进行成像。
- 对于全腹成像，定位与开腹面对相机，指着仪器的后脑勺鼠标尸体。居中机关在绿色灯箱十字线成像（ 例如，肝脏或肾脏）。
- F或单个器官成像和量化，从成像仪器中取出鼠标和针下来。从已经开体腔开始，切除内部器官（ 例如，肾，肝，肺，肌肉，脾脏，脑，和心脏）。通过后腿皮肤切开切除的肌肉组织。小心打开颅骨用手术刀切除大脑。
- 如果感兴趣的器官是肝脏，肾脏，脾，切成两半所有器官纵向，将每个器官的培养皿或一块黑色的建设纸。
- 按照步骤2.3-2.6建立单个器官的化学发光示踪剂的相对发射描述的过程。
4.淋巴结体内成像
- 制备含有80纳摩尔的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的一个的PBS溶液10μL。制备的水溶液（NH 4）2的Ce（NO 3）6在华之三（25毫米）在同一时间。
- 注入溶液10μL皮下到健康小鼠的后爪（N = 5）。作为阴性对照，注射用纯净的PBS10μL的对侧爪。注射后通过二氧化碳窒息牺牲小鼠15分钟。在两条后腿去除皮肤暴露淋巴管至腘窝淋巴结。
- 如步骤3.4所述设置了收购。
- 从两个后腿除去腘淋巴结，切断他们在一半，并与氧化剂喷他们上的培养皿，如之前（步骤3.5.3）中描述的，用于定量的目的。
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Representative Results
在协议部分1中所述的喷雾器系统可以从易得的材料以低成本来构造。它旨在是用于远程触发的生物发光读卡器内的还原/氧化剂的喷射（ 图1）的插入。我们的设计允许生物发光读者内的喷雾器在从透镜14厘米的距离的安全运行。在操作过程中，观察到透镜的不起雾或模糊。我们选择了市售化学发光剂的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中为我们的方法是根据它的价格低的发展，在水溶液中，以及所述的氧化还原行为，和化学发光特性的稳定性（ 图2）19。可以由氧化[茹（联吡啶）3] Cl 2的（100微升一滴在协议第2节确定的最小检测信号，6.9 pmol- 347纳摩尔在H 2 O）与（NH 4）在显微镜载玻片2的Ce（NO 3）6（100μL，25毫摩尔）。然后，通过使用喷雾器和喷雾上的三乙胺中的溶液（1:3的水/乙醇）中，化学发光信号被触发。在我们的情况下，确定的最小可检测信号为6.9皮摩尔/厘米2（ 图3）。可以想到，虽然，优化反应条件，摄像灵敏度，快门时间，体积和试剂浓度可能导致甚至更低的检测阈值。这些反应条件也可用于探索和测试的金属配合物，氧化剂和还原剂任何给定组合的化学发光。
移动到体内实验在协议第3及4，雌性裸鼠（远交）小鼠5-6周龄和NU / J雄性小鼠6-8周龄使用。对于静脉注射，金额8-33纳摩尔的的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中于100微升PBS中每只小鼠（N = 5）被选择。将动物在注射后10分钟处死，腹腔露出。将小鼠放置在生物发光读者用喷雾器向感兴趣的组织指向（ 图4）。用于静脉内注射的成像的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中，被主要检测在肾脏的化学发光信号，强烈暗示肾消除亲水小分子的（ 图5）。信号-噪声比与使用[Ru（联吡啶）3] Cl 2中与注射PBS小鼠27/1为肾和21/1为肝脏。对于淋巴结成像，80纳摩尔的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的PBS10μL的被皮下注入小鼠的后足垫（N = 5）。小鼠通过CO 2窒息处死15分钟后注射。涵盖内后腿西澳皮肤š除去以暴露肌肉，淋巴结，和淋巴管。腘淋巴结随后化学发光可视化导致了淋巴结包含节点观察[茹（联吡啶）3] 2+显示出10±4.3倍，比未处理的人高光辉（167000 P /（S×厘米2×SR）和17000 P /（S×厘米2×SR），P <0.028）（ 图6）。
图1：雾化器的照片。使用部分：木结构件 （A，B，C），喷雾瓶（D），弯钢杆（E），胶带（F），塑料扎带（G），011伺服连接器部分（H），伺服电机（I），铅笔（ j），通过弯曲的回形针（K举行），塑料包线扎带（L）W1线连接器（M）和扬声器连接线（N），导致电池。这个数字是基于研究最初发表于裁判erence 19。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2 的性质[茹（联吡啶）3] 2+。结构（A）和激发和发射光谱（B）中的[Ru（联吡啶）3] 2+。氧化/还原基于化学发光催化循环（C）。这个数字是基于最初发表于19参考研究。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：检测阈值的[Ru（联吡啶）3] 2+。在不同浓度的代表信号强度 [茹（联吡啶）3] 2+在显微镜载玻片（A）。成像信号量化与检测阈值（红色虚线）和背景（黑色虚线）（B）中。这个数字是基于最初发表于19参考研究。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：化学发光成像。鼠标和定位在生物发光读者喷雾器的示意图（ 一 g>的）和喷雾器喷洒上的鼠标的示意图（ 二 ）。这个数字是基于最初发表于19参考研究。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：检测的[Ru（联吡啶）3] 2+全身给药后。白光，化学发光，和覆盖（左到右）。即用的[Ru（联吡啶）3] 2+和与喷33纳摩尔注射小鼠体腔内的图像（NH 4）2的Ce（NO 3）6。对右肾的白色箭头指向。这个数字是基于最初发表于19参考研究。ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图6：[茹（联吡啶）3] 2+后皮下管理局的检测。腘淋巴结成像示出用于与注射的小鼠的白色光，化学发光，并合成图片的[Ru（联吡啶）3] 2+在后肢（顶部）和PBS（底）; 80纳摩尔的PBS10μL的，成像的注射液（A）中经过15分钟。白色光并合成图像对的[Ru（联吡啶）3] 2+（顶部）和PBS（底部）处理切下腘淋巴结（B）。对于PBS化学发光信号和[茹（联吡啶）3] 2+ -处理的淋巴结（C）.The数据表示平均值±SD的定量。这个数字是基于最初的研究发表inreference 19。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里，我们已经提出了一种技术，能够通过由化学发光记者创建的光子的发射光学划定组织。相对于其他，更成熟的，技术4，5，6，7，8，9，此化学发光报道系统采用了成像探针是无放射性和在非常高的灵敏度水平便于检测。或许更重要的是，化学发光成像不需要入射光源（如在光学荧光成像）20，即最大限度地减少自体荧光和大大减少背景信号的性状。
钌记者的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中有一个体内 毒性容忍的成像目的（INTraperitoneal小鼠的LD 50：20毫克/公斤）21，是水溶性的（高达8毫摩尔），并且是稳定的血液中的。金属络合物的物理化学性质是充分表征的，并且已经被研究用于癌症22,23的光动力学治疗。氧化剂（NH 4）2的Ce（NO 3）6已经报道具有非常低的毒性（大鼠口服LD 50：1600-3200毫克/千克）24和可溶于水的浓度高达2.57 M达20 °ç25。在这篇文章中，对于一个远程操作喷雾装置的结构的视觉显示以及基于文本的指导介绍。此外，我们还提供了在一个标准的生物发光成像设备中执行的化学发光成像健壮的协议。我们说明了他们对visualizati使用[茹（联吡啶）3] Cl 2的中对小鼠静脉注射两种皮下和注射后的组织中。
然而，与其他任何新生的成像技术，有改善的余地的我们的协议。我们相信，验证的原则，本研究可以刺激多种化学发光应用的发展为生命系统。以下几点是可以解决的，进一步提高了技术和扩大其范围。
一个较小的第二代远程触发喷射装置的将允许试样以更接近相机，从而改善空间分辨率。改进的光学设备可能进一步提高了该方法的检测限。该协议也可以扩展到成像活体动物。转矩（由电流和电压）的精确控制允许试剂与每个喷释放的量的更精确的控制。重要的是保持良好的维护，雾化器是很重要的。不冲洗雾化器可能会破坏nozz勒。新电池是雾化器的正常性能是至关重要的。然而，用于该雾化器的所有材料是便宜的和容易购得。以下成立合成方案中，使用[Ru（联吡啶）3] 2+复合物可以很容易地与各种接头修饰，包括马来酰亚胺26，胺27和NHS酯28，29。这将使生物缀小分子，肽，或抗体，并因此将有利于特定分子靶向30，31，32，33。最终，有针对性的探针递送可以使外科医生来确定小病灶并准确地描绘在手术室手术切缘具有非常高的特异性。另外，高度水溶性的[Ru（联吡啶）的封装3] 2+在纳米材料，有针对性和不相关的，也可以允许病变的可视化，而他们是被手术切除34，35，36。最后，修改所述金属络合物记者的协调范围和/或改变的过渡金属中心本身代表吸引力路线内的可见调制和微调发射波长和近红外范围37,38。
术中的化学发光成像需要化学发光记者和，在我们的情况下，氧化剂，这只能它们的毒性和溶解度的范围内使用。组织膜可以表示为氧化剂的扩散进入组织的屏障，因此，信号生成。由于化学发光报道只产生每个周期一个光子，所生成的信号是相当弱。因此在手术室环境光将必须从进入照相机，而技术是使用防止。这可能使ICI特别有趣的腹腔镜应用中，环境光自然排除的发展。
我们希望，这种方法可能会变成在手术室外科医生的宝贵工具。没有放射性的是病人和运营团队都有益，使更少的安全防护措施，有可能使这一技术成为一个更具吸引力的选择。
雾化器的运行平稳，其定位发挥获得了良好的效果至关重要的作用。次优的角度和领域可能会导致信号变化。控制电缆必须通过门放小心，和足够电缆必须保持在生物发光读者内部，使得它不拥挤或撕掉。
最终，chemiluminescence成像是一个极具吸引力的新方法，分子成像。它是基于既定化学的基础上，采用了价格低廉，容易获得的材料，并避开辐射和激发光源。这样一来，我们都希望并相信在未来，化学发光成像可能对手术治疗的疾病产生深远的影响。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4 × 25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3 oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 - 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
References
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