Summary
Mange eksperimentelle systemer er blevet anvendt til at forstå de mekanismer, der regulerer T celle udvikling og funktion i en immunreaktion. Her en genetisk tilgang med retroviral transduktion beskrives, som er økonomisk, tid effektivt, og vigtigst, meget informative identificere regulatoriske pathways.
Protocol
Alt mus arbejde udført i disse protokoller blev foretaget i overensstemmelse med de Animals Videnskabelige Procedures Act, UK under dyret Project License 70/6965.
1. Retroviral Production
Forud for proceduren, indhente alle nødvendige godkendelser til fremstilling af genetisk modificerede organismer og brugen af retrovira i mammale celler.
- Vækst af HEK 293T-celler
- Grow HEK 293T-celler på 10 cm vævskulturskåle i HEK 293T medium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) . For generel celle passage, opdele celler 1:10 når de når sammenløb ved at fjerne medium og pipettering cellerne fra pladen med frisk HEK 293T medium.
BEMÆRK: Celler bør nå sammenløb i 2-3 dage. 293T HEK-celler sættes løst på pladen, så trypsinisering er ikke påkrævet. - 24 timer før transfektion, opdele en confluent plade af celler 1:10 til en 10 cm plade (én plade pr transfektion), således at den næste dag blev cellerne er ~ 50% sammenflydende.
- Grow HEK 293T-celler på 10 cm vævskulturskåle i HEK 293T medium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) . For generel celle passage, opdele celler 1:10 når de når sammenløb ved at fjerne medium og pipettering cellerne fra pladen med frisk HEK 293T medium.
- Transfektion ved calciumphosphatpræcipitation
- Ca. 1 time før transfektion, fjerne medium fra celler og tilsættes forsigtigt 9 ml frisk HEK 293T medium for at forhindre celler aftagning fra pladen.
- Forbered 2x Hepes saltvand (2x HBS) og en frisk 2,5 M CaCl2-opløsning som beskrevet i tabel 1. Optø DNA bestande. For de mest effektive transfektioner bruger plasmid prep kvalitet DNA.
- I en 6 ml rundbundet eller 15 ml konisk rør tilsættes 5 ug retroviral DNA (pMIG) 4, 5 ug Helper virus-DNA (PCL-Eco) 7, og H2O til 420 pi. Der tilsættes 80 pi 2,5 M CaCl2 bringe slutvolumenet til 500 pi.
Bemærk: Dette sammen med det næste trin (tilsætning af 2x HBS) kan ske på en regelmæssig bænk så længe generel sterile teknik anvendes. - Langsomt tilsættes 500 pi 2x HBS dråbevis til den ovennævnte DNA-blandingen under forsigtig omhvirvling, således at opløsningen er kontinuerligt blandet, og CaPO4 udfælder i selv-størrelse krystaller.
- Overførsel til en vævskultur hætte og tilsæt langsomt Capo 4 DNA-blandingen (1 ml) dråbevis til de 9 ml medium dækker cellerne idet der hele tiden og forsigtigt hvirvlende pladen. Igen pas på ikke at løsrive celler fra pladen. Placer cellerne tilbage i inkubatoren.
BEMÆRK: På dette tidspunkt vil CaPO4 bundfald umiddelbart synlige under et mikroskop som små krystaller på størrelse med bakterier. Disse er let ses efter 30-60 min, når krystallerne har haft en chance for at sedimentere til bunden af pladen.
- Indsamling af virus i kultursupernatanterne.
- Den følgende dag (overalt fra 12-24 timer efter transfektion) fjerne mediet og fodre cellerne med 10 mlfrisk HEK 293T medium igen være omhyggelig med ikke at løsne cellerne fra pladen.
BEMÆRK: Denne fortynder ud lymfocyt hæmmende stoffer, HEK 293T-celler udskiller i mediet under transfektion. - Om aftenen den anden dag (~ 24 timer efter transfektion) fodre celler med 3,5 ml frisk HEK 293T medium. Pas på, at pladen er placeret præcis niveau i inkubatoren, så at den ene side ikke efterlades tør.
- Saml medium ~ 12 timer senere (opbevares ved 4 ° C) og foder med 3,5 ml frisk HEK 293T medium. Gentag samling 2 gange på nogenlunde 12 timers intervaller, således at ca. 10 ml medium indsamles. Dette er virusstamopløsningen.
- Spin eventuelle resterende HEK 293T-celler og cellerester ved centrifugering ved 600 xg i 5 min. Alternativt filtreres ved hjælp af en 0,45 um, lav proteinbinding, sprøjte filter. Store virus ved 4 ° C, og for de bedste titre, brug inden for en dag eller to, som titeren langsomt vil aftage ved 4 ° C. Må ikke frEeze, da dette signifikant nedsætter titeren.
- Den følgende dag (overalt fra 12-24 timer efter transfektion) fjerne mediet og fodre cellerne med 10 mlfrisk HEK 293T medium igen være omhyggelig med ikke at løsne cellerne fra pladen.
2. Isolering af Primary Naïve CD4 + T-celler
- Isolering af leukocytceller
- Afliv mus ved cervikal dislokation, CO 2 kvælning eller anden human protokol hensigtsmæssigt at reglerne i institutionens håndtering af dyr.
- Dissekere frisk aflivede mus og fjern milt og ønsket lymfeknuder 15. Placer organer i brønde i en 6 brønds vævsdyrkningsplade indeholdende R10 medium (RPMI medium med 10% varmeinaktiveret FBS, 100 enheder / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 0,1% β-mercaptoethanol) . Brug en cellekultur hætte til dissektion af mus og alle efterfølgende manipulationer for at minimere risikoen for kontaminering i kulturer.
BEMÆRK: Hold R10 medium koldt og udføre alle de efterfølgende rensningstrin ved 4 ° C. - Placer en 70 um cellekultur si i en 50 ml konisk rør indeholdende ca. 5 ml R10-medium. Brug en si for milten og lymfeknuder fra op til tre mus.
- Tilføj milt og lymfeknuder til cellen si og macerere ved hjælp af spidsen af en 5 ml sprøjte stemplet. Skyl med 1-2 ml R10-medium.
- Overfør celler til en 15 ml konisk rør og bringe mængden op til 14 ml med R10. Centrifuger ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres ved at hælde det ud med en ren bevægelse for at forhindre at forstyrre cellepelleten.
- Tilsæt 2 ml kold (4 ° C) lyse af røde blodlegemer puffer (tabel 1) til hvert rør. Bland forsigtigt i 3,5 min, holde røret på is.
BEMÆRK: Timingen af lyse af røde blodlegemer er kritisk for at forhindre dødsfald af lymfocytter. Derfor vil den præcise timing af hvert parti af røde celle lysis buffer skal optimeres. - Tilføj ≈12-13 ml R10-medium. Umiddelbart centrifuge og kassér supernatanten som i trin 2.1.5. Udfør vasketrinene 2x mere with R10-medium til fjernelse af eventuelt tilbageværende røde blodlegemer lysepuffer fra cellerne og undgå død af lymfocytter.
- Tæl celler i et hæmocytometer fortynding 1:20 i trypanblåt for at bestemme udbyttet af levedygtige celler. Forventer cirka 8-10 x 10 7 celler per mus.
- Isolering af CD4 + -T-celler under anvendelse af magnetiske perler, til at fjerne CD8 +, CD11 +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klasse II + og Ter-119 + -celler.
- Alikvot 8-10 x 10 7 celler fra trin 2.1.8 pr 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hæld supernatanten med en ren bevægelse for at forhindre at forstyrre cellepelleten. Resuspender cellerne i hvert rør i 100 pi varmeinaktiveret FBS derefter tilsættes 100 pi antistof mix fra kittet. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C under forsigtig blanding på en rulle.
- Skønt de ovennævnte celler inkubering, forberede perlerne.
- Resuspender perler i hætteglasset ved hvirvelbehandling i> 30 sek derefter overføre 1 ml perler pr 8-10 x 10 7 fremstillede celler til en 15 ml konisk rør. Tilsæt 2 ml R10-medium pr ml perler og forsigtigt blandes.
- Glasset anbringes i magneten i 1 min og derefter kassere supernatanten. Fjern røret fra magneten og resuspendere perlerne i 4 ml R10-medium. Denne mængde perler er tilstrækkelig til to runder inkubation.
- Vask cellerne ved slutningen af antistoffet inkubation (trin 2.2.1) ved tilsætning af 10 ml R10-medium per rør. Bland forsigtigt godt under omhvirvling af røret og centrifugeres celler ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hæld supernatanten med en ren bevægelse for at forhindre at forstyrre cellepelleten. Resuspender celler i 1 ml R10-medium.
- Tilsæt 2 ml af de vaskede perler fra trin 2.2.2.2 (½ mængden forberedt til hvert rør) til hvert rør af antistof-behandlede celler og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under forsigtig blanding på en roller.
- Resuspender celle-kugle-blanding ved forsigtigt at pipettere 5 gange med en pipette indeholdende en smal spids åbning. Undgå skumdannelse. Glasset anbringes i den perlerne magnet i 2 min og derefter overføre supernatanten indeholdende de negativt selekterede celler til et nyt rør. Holde disse celler, da de er CD4 + -populationen.
- Gentag negativ selektion endnu en gang. Spin celler fra trin 2.2.5 ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hæld supernatanten som i trin 2.2.3 og resuspender i 1 ml R10-medium. Følg trin 2.2.4 og 2.2.5 igen. Efter den sidste magnetiske perler udvælgelse, tælle cellerne for at bestemme genvinding (Typiske udbytter er 15-20 x 10 6 celler pr 10 8 leukocytter).
- Isolering af naive CD4 + T-celler (CD25 - og CD62L høj) Brug Cell Separation kolonner
- Centrifuge CD4 + T-celler ved 600 x g i 5 min ved 4 ° C og resuspenderes i 150-200 piR10 medium pr 10 8 celler. Tilsæt 2 pi lager biotinyleret CD25 monoklonalt antistof (klon 7D4). Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C under forsigtig blanding på en rulle.
- Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml celleseparation søjlepuffer (tabel 1). Centrifuger ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern så meget supernatanten som muligt og beregne mængden af puffer / celler tilbage. Resuspender til et endeligt volumen på ca. 90 pi per 10 7 celler.
- Tilsæt 20 pi streptavidinkugler pr 10 7 celler og blandes med blide flicks. Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C.
- Mens celler inkubere, forberede medium celleseparation (MS) kolonner til den manuelle metode. Hver MS kolonne tilbageholder 10 7 celler, og eftersom CD25 + celler typisk udgør omkring 10% af den samlede CD4 + celler, bruge 1 kolonne pr 10 8 CD4 + T-celler. Der tilsættes 500 pi celleseparation søjlepuffer til søjlenog lad flyde igennem. Gentag 2 gange mere.
- Ved udgangen af celle / perle-inkubation vaskes cellerne ved tilsætning af 10 ml celleseparation søjlepuffer og centrifugering ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Resuspender celler i 500 pi celleseparation søjlepuffer per 10 8 celler, men stadig bruge 500 pi, hvis der er færre celler.
- Påfør 500 pi celle / perlesuspensionen til søjlen og indsamle gennemstrømningen. Videregive dette over søjlen 1 mere tid og indsamle strømningen gennem igen. Søjlen skylles 3 gange med 500 pi celleseparation søjlepuffer, tilføjer hver strømme igennem fra disse skylninger til de indsamlede celler. Dette er de CD25 - celler. Tæl celler for at bestemme udbyttet.
- Hvis der ønskes tregs (CD25 + celler), isolere som følger.
- Fjern kolonnen fra separatoren og hold den over en åben universal rør tage sig for at opretholde sterilitet. Hurtigt pipette 500 pi celle adskillelse buffer på collonne og fast skylle den positive fraktion ved hjælp af stemplet følger med kolonnen.
- Gentag skylleproceduren 2 flere gange. Før positive fraktion over en frisk MS celleseparation kolonne og kassér denne gennemstrømning. Fast skylle de positive celler tre gange som før og centrifuger cellerne ved 600 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender cellerne i 1 ml R10-medium og tælle til bestemmelse af udbytte.
- At opnå CD25 - CD62L høj T-celler centrifugeres CD25 - T-celler isoleret ovenfor i trin 2.3.6 ved 600 xg i 5 min ved 4 ° og resuspender i 150-200 pi R10-medium per 10 7 celler. Tilsæt 5 pi lager biotinyleret CD62L-monoklonalt antistof (klon MEL-14) og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under forsigtig blanding på en rulle som før.
- Udfør vask, Streptavidin perle bindende, og celle adskillelse kolonne forberedelse som beskrevet for treg isolation protokol (2.3.7). Denne gang brugden store celleseparation (LS) søjle, som har en kapacitet på 10 8 celler.
- Da CD62L høj T-celler typisk udgør omkring 60-70% af CD25 - celler, bruge 1 LS celleseparation kolonne pr 10 8 celler. Tilføj celle / perle-blandingen til LS celleseparation søjle som beskrevet i trin 2.3.6 - denne gang kassere den endelige gennemstrømning og kolonne skylninger. Indsamle CD62L høj T-celler som beskrevet i trin 2.3.7 for CD25 + celle samling.
- Centrifuger cellerne ved 600 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender cellerne i 1 ml R10 og tælle til bestemme udbytte. Fortynd til 0,75-1 X10 6 celler pr ml i R10 medium.
- Analyser Renhed Celler ved Fluorescent cellesortering (FACS).
- FACS farvning strategi
- For celler før og efter alle faser af isolation, plet med CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (helper og cytotoksiske T-celler), og MHCII-PE (MHC klasse II-udtrykkende celler).
- For celler før og efter CD25 isolation, pletten med CD4-FITC og CD25-PE (tregs versus andre hjælper T-celler).
- For celler pre og post CD62L isolation pletten med CD4-FITC, CD62L-PE og CD44-APC (naive versus hukommelse og effektor hjælper T-celler).
- For hver analyse sted 10 5 celler i en brønd i en 96 brønds U-bundplade. Centrifuger ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hæld mediet og vaskes cellerne en gang med 200 pi DPBS. Centrifuge som ovenfor, og hæld DPBS.
- Der tilsættes 50 pi DPBS per brønd og 0,5 pi af hvert antistof (som angivet i 2.4.1) og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke for at undgå blegning af fluorescerende markør.
- Vask cellerne 2x med DPBS som i 2.4.2 og straks analysere på et flowcytometer bruge protokoller og retningslinjer specifikke for instrumentet ved hånden.
BEMÆRK: Efter den sidste isolation trin i en god forberedelse, 90-95% af celler vilvære CD4 + CD25 - CD62L høj T-celler.
- FACS farvning strategi
3. Retroviral transduktion af aktiverede CD4 + T-celler og deres differentiering i specifikke T Helper Undersæt
- retroviral transduktion
BEMÆRK: Retroviral integration og ekspression af gener kræver celledeling. Derfor skal T-celler aktiveres O / N.- Mens isolering af de naive T-celler, frakke en 24 brønds vævsdyrkningsplade med anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer fortyndet i DPBS. Tilføj 250 pi per brønd. Bruge anti anti-CD3 ved 1 pg / ml. Brug anti-CD28 på 2 mg / ml, hvis celler i sidste ende vil blive differentieret under Th0, Th1, Th2 og iTregs betingelser. Bruge anti-CD28 ved 10 ug / ml for Th9 og Th17 betingelser. Inkuber ~ 2 timer ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator.
- Lige før dyrkning af cellerne, fjernes antistofopløsningen, og vask pladen med ~ 250 pi DPBS per brønd for at fjerne unbound antistof. Pas på ikke at lade pladen tørre ud så behandle en højst 6 brønde ad gangen. Fjern DPBS vaske og tilsættes 1 ml naive CD4 + T-celler i R10-medium ved 0,75-1 x 10 6 celler pr. Aktivere celler O / N (14-16 timer).
- Den følgende dag, centrifugeres celler i pladen ved 900 x g i 5 minutter ved 30 ° C for at fastgøre cellerne til bunden af brøndene.
- Indsamle og gemme mediet være omhyggelig med ikke at fortrænge cellerne, og erstatte med 1 ml virus dyrkningssupernatant fremstilles ud fra virus produktion protokollen. Lad ikke cellerne tørre ud så behandle højst 4 brønde ad gangen.
- Til hver brønd tilsættes 1 pi 8 mg / ml polybren og 10 pi 1 M HEPES, pH 7,5 til støtte virus optag og forhindre væsentlig alkalisering i den omgivende CO2 i den følgende centrifugering. Centrifuger cellerne i pladen ved 900 x g i 90 minutter ved 30 ° C.
- Differentiering af celler i SpeciFIC Undersæt
- Fjern forsigtigt virus kultursupernatanten og erstat med 1 ml af mediet indsamlet ovenfor i trin 3.1.4, da det indeholder IL-2 og andre T-celle vækstfaktorer. Tilføj reagenser anført i tabel 2 og kultur-celler i 3-4 dage for at differentiere cellerne i specifikke delmængder.
- Analyse af celler
- Til intracellulær farvning af cytokiner, behandle celler med 1 ug / ml af hver af phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) og ionomycin i 4 timer. Under den sidste 2 timer af stimulering, tilsættes 1 pg / ml Brefeldin A.
- Resuspender cellerne fra bunden af hver brønd ved pipettering op og ned adskillige gange. Overfør ca. 10 5 celler til en 96 brønds U-bundet plade (som regel 100 pi fra 1 ml kultur af Th-celler) til fiksering og farvning.
- For GFP-farvning, fix celler med 100 pi 2% paraformaldehyd ved stuetemperatur i nøjagtigt 5 minutter, som en længere inkubationstid vil blege GFP and forstyrre Foxp3 farvning. Vask cellerne ved tilsætning af 100 pi af DPBS til hver brønd og der centrifugeres ved 600 xg ved 22 ° C i 5 min. Hæld supernatanten.
Forsigtig: Paraformaldehyd er giftigt. Håndtere det i et stinkskab med hud og øjenbeskyttelse. - Fix cellerne igen ved hjælp af 100 pi 1x Fiksering buffer lavet fra Foxp3 farvning kit (1 volumen Fiksering buffer til 3 rumfang fortynder). Inkubér cellerne i 45 minutter ved stuetemperatur eller alternativt inkubere ved 4 ° C i 16 timer.
- Efter fiksering permeabilisere cellerne ved tilsætning af 100 pi permeabilisering buffer fra samme sæt. Inkuber ved stuetemperatur i 30-45 min centrifugeres ved 600 xg ved 22 ° C i 5 min.
- For antistof farvning, fjerne fiksering / permeabilisering buffer, og der tilsættes 50 ul frisk permeabilisering buffer. Tilsæt krævede antistof fortyndet i permeabilisering buffer ved 0,5 pi pr 50 pi buffer per prøve. Der inkuberes i 30-45 minutter ved stuetemperatur i mørke for at undgå blegning af influenzaorescent etiket.
- Tilsæt 150 pi permeabilisering puffer og centrifugeres ved 600 xg ved 22 ° C i 5 min. Kassér permeabilisering buffer og tilsættes 200 ul DPBS. Analyser på et flowcytometer bruge protokoller og retningslinjer specifikke for instrumentet ved hånden.
BEMÆRK: Sørg for at medtage ordentlig kontrol for cytokin farvning såsom farvning med isotype kontrol antistoffer, analysere ikke-aktiverede eller Th0 aktiverede celler, etc.
Representative Results
Succesen af denne eksperimentelle system kræver højt rene populationer af T-celler og høj titer retrovirus præparater. Repræsentative resultater er vist her som eksempler på vellykkede eksperimenter. Figur 1 viser den typiske renhed før og efter-udvalgte befolkningsgrupper i hver fase af den naive hjælper T-celle isolation protokol. Figur 2 og 3 viser analysen af retrovirus produktion gennem GFP udtryk i de transficerede HEK 293T-celler (figur 2) og transducerede T-celler (figur 3). Transfektionseffektiviteten af HEK 293T-celler kan variere betydeligt med forskellige retrovirale konstruktioner, men dette ofte ikke korrelerer med niveauet af retrovirus produktion observeret med antallet af GFP + -T-celler. Desuden kan antallet af GFP + -T-celler variere efter polarisering betingelser. Endvidere mean ekspressionsniveau af GFP og det indsatte gen kan variere afhængigt af antallet af virus kopier integreret, virkningen af integrationen site på transkription, og post-transkriptionelle regulatoriske mekanismer, som påvirker den virale transkript.
Endelig viser figur 4 nogle typiske resultater, vi har observeret med hjælper-T-celledifferentiering når miRNA MIR-15b / 16 overeksprimeres. Disse resultater viser noget af den variation, der kan forekomme inden for en individuel eksperiment så sande effekter skal underbygges af statistisk analyse af flere gentagne forsøg med forskellige præparater af hjælper T-celler. I disse eksperimenter Th2-responser kan være svært at observere i C57BL / 6 linie anvendes her, fordi de er tilbøjelige til Th1-reaktioner. Ligeledes kan IL-9-farvning være svært at opdage over baggrund. Derfor er det bydende nødvendigt at gøre isotypekontroller og etablere passende kompensation for at sikre korrekt gaTing af cytokinekspression. I vores resultater har vi fundet, at MIR-15b / 16 forbedrer iTreg induktion ved at hæmme mTOR-signalvejen gennem undertrykkelse af ekspressionen af komponenterne Rictor og mTOR 15. MIR-15b / 16 kan undertiden påvirke Th0, Th1 og Th17 differentiering i individuelle eksperimenter, men der er ingen signifikant virkning ved undersøgelse i flere gentagne forsøg. I modsætning MIR-15b / 16 overekspression giver et væsentligt undertrykke Th9 differentiering (se reference 18).
Figur 1. Typisk renhed af hjælper T-celler i hver fase af isolation. Repræsentant flowcytometri resultaterne af de angivne antigener vises fra porten af levende celler, der er udpeget i Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) plots. (A) før og efter-CD4 negativ selektion. Udtryk profiler af CD4,CD8a, og MHCII er vist. De viser berigelsen af hjælper T-celler og tabet af cytotoksiske T-celler og MHC klasse II-udtrykkende celler. En god rensning bør resultere i ~ 90% CD4 + -T-celler på dette stadium. (B) CD25 markering. Til venstre er udtryk profiler af CD4, CD8a, og MHCII, og til højre er CD4 og CD25 udtryk profiler før og efter valget. På dette tidspunkt> 95% af CD25 negativt selekterede celler bør være CD4 + CD25 -. (C) CD62L markering. CD4, CD8a, og MHCII udtryk profiler er vist til venstre. Til højre udtrykket profiler til CD62L og CD44 er vist for præ- og post-CD62L valgte celler sammen med CD4 og CD62L udtryk profil af post valgte celler. Efter CD62L udvalg praktisk talt alle hukommelsesceller (CD44 +) fjernes efterlader en højt beriget population af naive T-hjælperceller, der indeholder 10-15% effektorceller (CD62L lav). For alleFACS profiler svarende indstillinger og skalaer for en specifik parameter blev opretholdt i hele. Tallene repræsenterer procentdelen af celler inden for et lukket population. Det lille fald i størrelsen af de celler efter den første udvælgelse skyldes formentlig mekanisk stress under protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Analyse af retroviruslignende transficerede HEK 293T-celler. GFP-ekspression er vist i HEK 293T-celler, der enten var ikke-transficerede eller transficerede og analyseret efter opsamling af virale kultursupernatanter. GFP Analysen blev udført på levende celler fra porten på FSC og SSC plot i det første panel. Tallene repræsenterer procentdelen af GFP + -celler inden for det kanaliserede region. Typiske transfection effektivitet ligger mellem 30-90%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af retrovirus transducerede T-hjælperceller. GFP-ekspression er vist i retrovirale-transducerede hjælper T-celler efter differentiering i Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, og Treg polarisering betingelser for tre dage. Analyse blev gated på levende og aktiverede celler, der er angivet i FSC / SSC-panelet. Transduktionseffektiviteter kan variere mellem 10-75% afhængig af konstruktionen og polarisering betingelser. Ligeledes den gennemsnitlige fluorescensintensitet af GFP-ekspression kan variere. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Effekt af miR-15b / 16 overekspression på hjælper T-celle differentiering i forskellige polarisering betingelser. Repræsentative cytokin profiler er vist på GFP + population af celler fra figur 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1:. Buffere anvendes i disse protokoller Klik her for at downloade denne tabel som et Excel-regneark.
| HjælperT-celle polarisering betingelser | ||
| Th0 | anti-IL-4 | 5 ug / ml |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| Th1 | rekombinant-IL-12 | 20 ng / ml |
| anti-IL-4 | 5 ug / ml | |
| Th2 | rekombinant IL-4 | 40 ng / ml |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| Th9 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-4 | 40 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 10 ug / ml | |
| Th17 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-6 | 50 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| anti-IL-4 | 5 ug / ml | |
| anti-IL-2 | 5 ug / ml | |
| tregs | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-2 | 5 ng / ml | |
Tabel 2: Hjælper T-celle-undergruppe polarisering betingelser.
Discussion
Retroviral medieret overekspression af gener er en effektiv måde at analysere funktionen i hjælper-T-celler, som deres udvikling og funktion ofte er bestemt af ekspressionsniveauet af nøgleregulatorer. Imidlertid er forsigtig fortolkning af resultaterne påkrævet, fordi udtryk niveauer langt over den endogene gen kan introducere mange artefakter. Derfor bør denne teknik kombineres med andre for at verificere relevansen af funktion. For eksempel bør overekspression suppleres med reduceret udtryk ved hjælp siRNA'er eller gen-knockout, hvis tilgængelig. Med miRNA, vi suppleret overekspression eksperimenter med dem for blokering ved hjælp af virus, der overudtrykt kunstig miRNA rettet mod websteder, der fungerede som kompetitive inhibitorer for en miRNA 15. Retrovirale transducerede celler kan også anvendes i biokemiske assays involverer RNA og protein analyse. Men en væsentlig begrænsning af disse forsøg er effektiviteten af transduktion resulting i en blandet population af transducerede og utransducerede celler. Derfor vil disse assays sandsynligvis kræve sortering af GFP + populationen. Endelig bør in vitro-differentieringsfaktorer assays kombineres med in vivo-forsøg, og en måde, hvorpå dette kan opnås, er ved adoptivt at overføre de transducerede T-celler i mus og efter deres differentiering og deres virkning på immunresponset.
En af de vigtigste begrænsninger for dette system er størrelsen af RNA-genomet, som kan pakkes ind i retrovirale capsid. Det er vores erfaring, den maksimale indsats størrelse for MIG retroviral system, der giver god virus produktion er 3-3,5 kb. Derfor kan større gener ikke analyseres med dette system, da de giver dårlige virustitere. Men de fleste gener er mindre end denne størrelse, så dette system er anvendeligt til en lang række af gen undersøgelser.
Med retroviral transduktion, flere alternativer inden for disse protocols er blevet anvendt. Mange forskere har anvendt emballage cellelinier, som stabilt udtrykker de retrovirale gener (f.eks referere 16). Vi har imidlertid opnået de højeste titere under anvendelse af standard HEK 293T-celler med co-transfektion af PCL-Eco hjælpevirus-vektor. Isolering af naive T-hjælperceller kan også opnås gennem cellesortering snarere end den magnetisk perle og celleseparation kolonne protokol, men dette kræver adgang til en cellesorteringsapparat, og omkostningerne for sortering tid er typisk højere end de perle reagenser. Endelig er der variationer på aktivering betingelser, der anvendes til at differentiere hjælper T-celler i de forskellige undergrupper. For eksempel TCR-stimulering af celler til for længe, før udsættelse for Treg inducerende betingelser kan hæmme deres induktion 16. Dette kan være et problem, fordi retroviral ekspression kræver celledeling induceret af stimulering af celler. Ikke desto mindre har vi fundet en effektiv treg induktion ved hjælp af denne protokol med O / N activation før retroviral transduktion.
Inden for disse protokoller, vellykket applikation kræver flere faktorer. Høj titer retrovirus præparater brug effektiv transfektion af HEK 293T-celler så høj kvalitet DNA og præcist rede 2x HBS er vigtige. Desuden celledensiteten af HEK 293T-celler skal være omkring 50% på punktet af transfektion, fordi god ekspression af det transficerede DNA kræver, at cellerne er aktivt voksende, og dette vil blive inhiberet, hvis cellerne er for sparsomme eller tæt. Celler ved den optimale tæthed under transfektion bør nå konfluens på et tidspunkt under trin af virus indsamling, men de vil fortsætte med at producere høj titer virusstammer hele vejen igennem til den sidste samling. Effektiv differentiering af hjælper T-celler kræver god cellernes kvalitet så sikre, at isolerede celler er renheden illustreret i figur 1. Ligeledes kvaliteten af cellerne er afhængig af mus frabout som de blev isoleret. Til disse undersøgelser har vi brugt 6-8 uger gamle C57BL / 6-mus. Ældre mus kan have mindre naive celler, og andre stammer kan variere i deres differentiering. For eksempel BALB / c-mus er mere tilbøjelige til Th2-reaktioner end C57BL / 6-mus 17, således som anført ovenfor, C57BL / 6 T-celler kan være svært at inducere et Th2-respons. Desuden kan enhver af de differentieringstilstande variere lidt fra laboratorium til laboratorium, og effekten af gen overekspression må kun blive synlige i sub-optimale betingelser, så cytokin koncentrationer i de forskellige polarisering betingelser kan være nødvendigt at titreres. Endelig kan virkningerne af den overudtrykte gen eller polarisering betingelser på celleproliferation påvirke transduktion effektivitet, så måler effekt af genet af interesse kan kræve optimering af timingen og koncentrationen af polariserende reagenser. Optimering alle disse faktorer bør føre til informative resultater med dette system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| DPBS | Sigma | D8537 | |
| MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
| pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
| Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
| MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
| CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
| Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
| Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
| Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
| Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
| Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
| Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
| Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
| Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
| Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
| Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
| Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
| Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
| Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
| Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
| Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
| Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
| Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
| Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
| Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
| Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
| Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
| Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
| KHCO3 | Sigma | 237205 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 |
References
- Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
- Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
- Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
- Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
- Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
- Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
- Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
- Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).
