Summary
Mange eksperimentelle systemer er blitt anvendt for å forstå mekanismene som regulerer T-celle utvikling og funksjon i en immunrespons. Her en genetisk tilnærming ved hjelp av retroviral transduksjon er beskrevet, som er økonomisk, tidseffektiv, og viktigst av alt, svært informativ identifisere regulatoriske veier.
Protocol
Alle mus arbeid utført i disse protokollene ble foretatt i henhold til de Dyr vitenskapelige prosedyrer loven, UK under dyret Prosjekt License 70/6965.
1. Retroviral Produksjon
Før fortsetter oppnå alle nødvendige godkjennelser for fremstilling av genetisk modifiserte organismene og anvendelse av retrovirus i pattedyrceller.
- Vekst av HEK 293T celler
- Vokse HEK-293T-celler på 10 cm vevskulturskåler i HEK 293T medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) . For generell celle passasje, dele celler 1:10 når de når samløpet ved å fjerne medium og pipettering cellene av platen med frisk HEK 293T medium.
MERK: Cells skal nå samløpet i 2-3 dager. 293T HEK-celler fester løst til platen slik at trypsinering ikke er nødvendig. - 24 timer før transfeksjon, dele en confluent plate av cellene 1:10 på en 10 cm plate (en plate pr transfeksjon), slik at den neste dag ble cellene er ~ 50% sammenflytende.
- Vokse HEK-293T-celler på 10 cm vevskulturskåler i HEK 293T medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) . For generell celle passasje, dele celler 1:10 når de når samløpet ved å fjerne medium og pipettering cellene av platen med frisk HEK 293T medium.
- Transfeksjon av kalsiumfosfatutfelling
- Omtrent en time før transfeksjon, fjernes mediet fra cellene, og tilsett forsiktig 9 ml frisk HEK 293T medium for å hindre at celler å løsne fra platen.
- Forbered 2x HEPES-bufret saltvann (2x HBS) og en frisk 2,5 M CaCl2-løsning som beskrevet i Tabell 1. Tin DNA-bestander. For de mest effektive transfections bruke plasmid prep kvalitet DNA.
- I en 6 ml rund bunn eller 15 ml konisk rør tilsett 5 mikrogram av retrovirale DNA (pMIG) 4, 5 ug Helper virus DNA (PCL-Eco) 7, og H 2 O til 420 mL. Legg 80 ul av 2,5 M CaCl2 bringe sluttvolumet til 500 ul.
Merk: Dette sammen med neste trinn (tilsetning av 2x HBS) kan gjøres på en vanlig benk så lenge generell sterile teknikken brukes. - Tilsett langsomt 500 ul av 2x HBS dråpevis til den ovennevnte DNA-blandingen under forsiktig virvling, slik at løsningen er kontinuerlig blandet og den capo 4 utfelles i og med størrelse krystaller.
- Overføring til en vev kultur hette og sakte legge til Capo fire DNA-blanding (1 ml) tilsatt til 9 ml medium som dekker cellene mens stadig og forsiktig virvlende platen. Igjen være forsiktig med å løsne cellene fra platen. Plassere cellene tilbake i inkubatoren.
MERK: På dette punktet Capo 4 Fallet vil være lett synlig under et mikroskop som små krystaller på størrelse med bakterier. Disse er lett synlig etter 30-60 min når krystallene har hatt en sjanse til å sette seg på bunnen av platen.
- Innsamling av virus i kultursupernatanter.
- Dagen etter (hvor som helst 12-24 timer etter transfeksjon) fjerne mediet og mate cellene med 10 mlav frisk HEK 293T medium igjen være forsiktig med å løsne cellene fra platen.
MERK: Dette utvanner ut lymfocytt hemmende stoffer som de HEK 293T cellene skiller ut i mediet under transfeksjon. - På kvelden den andre dagen (~ 24 timer etter transfeksjon) mate cellene med 3,5 ml frisk HEK 293T medium. Pass på at platen er plassert nøyaktig nivå i inkubatoren slik at den ene siden ikke blir stående tørt.
- Samle medium ~ 12 timer senere (oppbevar ved 4 ° C) og mate med 3,5 ml frisk HEK 293T medium. Gjenta samling to ganger på omtrent 12 timers mellomrom, slik at om lag 10 ml medium er samlet inn. Dette viruset lager.
- Spinne ut eventuelle gjenværende HEK 293T-celler og cellerester ved sentrifugering ved 600 xg i 5 minutter. Alternativt filtrere ved hjelp av en 0,45 mikrometer, lav proteinbinding, sprøytefilter. Oppbevares virus ved 4 ° C, og for beste titer, brukes innen en dag eller to, som titer vil sakte avta ved 4 ° C. Ikke freeze, da dette i betydelig grad reduserer titer.
- Dagen etter (hvor som helst 12-24 timer etter transfeksjon) fjerne mediet og mate cellene med 10 mlav frisk HEK 293T medium igjen være forsiktig med å løsne cellene fra platen.
2. Isolering av Primary naive CD4 + T celler
- Isolering av leukocyttceller
- Avlive mus ved halshugging, CO 2 kvelning, eller andre humane protokoll i forhold til de dyrehåndteringsregler for institusjonen.
- Dissekere fersk avlives mus og fjerne milten og ønsket lymfeknuter 15. Plasser organene i brønner i en 6 brønners vevskulturplate inneholdende R10 medium (RPMI-medium med 10% varmeinaktivert FBS, 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 0,1% β-merkaptoetanol) . Bruk en cellekultur hette for disseksjon av mus og alle påfølgende manipulasjoner for å minimere sjansen for forurensning i kulturer.
MERK: Hold R10 medium kaldt og utføre alle nedstrøms rensetrinn ved 4 ° C. - Plasser en 70 mikrometer cellekultur sil i en 50 ml konisk rør inneholdende ca. 5 ml R10 medium. Bruke en sil for milt og lymfeknuter på opp til tre mus.
- Legg milt og lymfeknuter til cellen sil og oppbløtes med enden av en 5 ml sprøyte stempelet. Skyll med 1-2 ml R10 medium.
- Overfør cellene til en 15 ml konisk rør og bringe volumet opp til 14 ml med R10. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatant ved å helle den av med en ren bevegelse for å unngå å forstyrre cellen pellet.
- Tilsett 2 ml kald (4 ° C) av røde blodceller lyseringsbuffer (tabell 1) til hvert rør. Bland forsiktig i 3,5 minutter, holde røret på is.
MERK: Tidspunktet for røde cellelyse er avgjørende for å hindre død av lymfocytter. Derfor vil det eksakte tidspunktet for hvert parti av Red cellelyse buffer må være optimalisert. - Legg ≈12-13 ml R10 medium. Umiddelbart sentrifuge og kast supernatanten som i trinn 2.1.5. Utfør vasketrinnene 2x mer viddh R10 medium for å fjerne eventuelt resterende røde cellelysebuffer fra cellene og unngå død av lymfocytter.
- Cellene telles i et hemocytometer fortynning 1:20 i trypanblått for å bestemme utbyttet av levedyktige celler. Forvent ca 8-10 x 10 7 celler per mus.
- Isolering av CD4 + T-celler under anvendelse av magnetiske kuler Kit for å fjerne CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klasse II + og Ter-119 + celler.
- Delmengde 8-10 x 10 7 celler fra trinn 2.1.8 pr 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hell av supernatanten med en ren bevegelse for å forhindre forstyrrelse av cellepelleten. Resuspender cellene i hvert rør i 100 pl varmeinaktivert FBS deretter tilsett 100 pl av antistoffblanding fra settet. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C med forsiktig omrøring på en valse.
- Mens de ovennevnte celler ruger, forberede perlene.
- Resuspender perler i hetteglasset ved å virvle for> 30 sek deretter overføre 1 ml perler per 8-10 x 10 7 forberedt cellene til en 15 ml konisk tube. Tilsett 2 ml R10 medium per ml av perler og forsiktig bland.
- Plasser røret i den magnet for 1 min så kast supernatanten. Fjern røret fra magneten og resuspender perler i 4 ml R10 medium. Denne mengden av perler er tilstrekkelig for to runder med inkubering.
- Vask cellene ved slutten av antistoffet inkubasjon (trinn 2.2.1) ved å tilsette 10 ml R10 medium per rør. Bland forsiktig godt med virvlende av røret og sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hell av supernatanten med en ren bevegelse for å forhindre forstyrrelse av cellepelleten. Resuspender celler i 1 ml R10 medium.
- Tilsett 2 ml av de vaskede perlene fra trinn 2.2.2.2 (½ fremstilt for hvert rør mengde) til hvert rør av antistoff-behandlede celler og inkuber i 30 min ved 4 ° C med forsiktig omrøring på en roller.
- Resuspender celle-perle-blandingen ved forsiktig pipettering 5 ganger med en pipette som inneholder en smal spiss åpning. Unngå skumdannelse. Plasser røret på perlene magnet i 2 minutter og deretter overføre supernatanten inneholdende de negativt valgte cellene i et nytt rør. Holder disse celler, som de er CD4 + populasjonen.
- Gjenta negativ seleksjon en gang til. Spin celler fra trinn 2.2.5 ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C. Hell av supernatanten som i trinn 2.2.3 og resuspendert i 1 ml R10 medium. Følg trinn 2.2.4 og 2.2.5 igjen. Etter den endelige magnetiske kuler utvalg, telle cellene for å bestemme utvinning (typiske utbytter er 15-20 x 10 6 celler pr 10 8 leukocytter).
- Isolering av Naive CD4 + T-celler (CD25 - og CD62L høy) Bruke Cell separasjonskolonner
- Sentrifuger CD4 + T-celler ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspender i 150-200 ulR10 medium per 10 8 celler. Tilsett 2 mL av lager biotinylert CD25 monoklonalt antistoff (klone 7D4). Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C med forsiktig omrøring på en valse.
- Vask cellene ved tilsetning av 10 ml av celleseparasjonskolonnebuffer (tabell 1). Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten så mye som mulig, og estimere volumet av buffer / celler som gjenstår. Resuspender til et sluttvolum på omtrent 90 ul pr 10 7 celler.
- Tilsett 20 mL av Streptavidin perler per 10 7 celler og bland med milde vipper. Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C.
- Mens celler ruger, forberede medium celleseparasjon (MS) kolonner for den manuelle tilnærmingen. Hver MS kolonne beholder 10 7-celler, og siden CD25 + celler som typisk utgjør omtrent 10% av total CD4 + celler ved å bruke en kolonne per 10 8 CD4 + T-celler. Legge til 500 ul av celleseparasjonskolonnen buffer til kolonnenog la strømme gjennom. Gjenta 2 ganger.
- Ved slutten av celle / perle inkubasjon vaskes cellene ved tilsetning av 10 ml av celleseparasjonskolonne buffer og sentrifugering ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender celler i 500 ul av celleseparasjonskolonnebuffer per 10 8 celler, men likevel bruke 500 pl hvis det er færre celler.
- Anvende 500 mL av celle / perlesuspensjon til kolonnen og samle strømningen gjennom. Passerer dette over en kolonne mer tid og samle strømningen gjennom en gang til. Skyll kolonne 3 ganger med 500 mL av celleseparasjonskolonne buffer, og legger hver strømme gjennom fra disse skyllinger til de innsamlede cellene. Dette er de CD25 - celler. Telle celler for å bestemme utbyttet.
- Hvis Tregs (CD25 + celler) er ønsket, isoleres som følger.
- Fjern kolonnen fra separatoren og hold det over en åpen universell tube ta vare for å opprettholde sterilitet. Raskt pipette 500 mL av cellen separasjon buffer på colUMN og fast skylle ut den positive fraksjon, ved hjelp av stempelet som fulgte med kolonnen.
- Gjenta skylleprosedyren 2 flere ganger. Passerer den positive fraksjonen over en frisk MS celleseparasjonskolonne og forkaste denne gjennomstrømning. Fast spyle ut de positive cellene tre ganger, som før og sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C Resuspender celler i 1 ml medium og R10 teller for å bestemme utbyttet.
- For å oppnå CD25 - CD62L høy T-celler, sentrifuger CD25 - T-celler isolert ovenfor i trinn 2.3.6 ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C og resuspendert i 150-200 pl av R10 medium per 10 7 celler. Tilsett 5 ul biotinylert lager CD62L monoklonalt antistoff (klon MEL-14) og inkuber i 30 min ved 4 ° C med forsiktig omrøring på en valse som før.
- Utfør vask, Streptavidin perle binding, og celleseparasjonskolonnen forberedelse som beskrevet for treg isolasjon protokollen (2.3.7). Denne gangen brukden store celle separasjon (LS) kolonne, som har en kapasitet på 10 8 celler.
- Siden CD62L høy T-celler vanligvis utgjør ca 60-70% av CD25 - celler, bruker 1 LS celleseparasjonskolonne per 10 8 celler. Legg celle / perle-blandingen til LS celleseparasjonskolonne som beskrevet i trinn 2.3.6 - dette tidspunktet forkaster den endelige strømmen gjennom og kolonne skyller. Samle CD62L høy-T-celler som beskrevet i trinn 2.3.7 for CD25 + celleansamling.
- Sentrifuger cellene ved 600 xg i 5 min ved 4 ° C Resuspender celler i 1 ml av R10 og teller for å bestemme utbyttet. Spe til 0,75 til 1 X10 6 celler per ml i R10 medium.
- Analyser Purity Celler av Fluorescent-aktivert celle sortering (FACS).
- FACS flekker strategi
- For celler før og etter alle stadier av isolasjon, beis med CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (hjelpe og cytotoksiske T-celler), og MHCII-PE (MHC klasse II-uttrykkende celler).
- For celler før og etter CD25 isolasjon, flekken med CD4-FITC og CD25-PE (Tregs versus andre hjelper T-celler).
- For celler før og etter CD62L isolasjon flekken med CD4-FITC, CD62L-PE og CD44-APC (naive versus hukommelse og effektor T-hjelpeceller).
- For hver analyse stedet 10 5 celler i en brønn i en 96-brønners U-bunnplate. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Hell av mediet og vaskes cellene én gang med 200 ul DPBS. Sentrifuger som ovenfor og helle av DPBS.
- Tilsett 50 ul DPBS per brønn og 0,5 ul av hvert antistoff (som angitt i 2.4.1) og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørke for å unngå bleking av fluorescerende markør.
- Vask cellene 2x med DPBS som i 2.4.2 og umiddelbart analysere på et flowcytometer bruker protokoller og retningslinjer som er spesifikke for instrumentet for hånden.
MERK: Etter den siste isoleringstrinnet av en god forberedelse, 90-95% av cellene vilvære CD4 + CD25 - CD62L høy T-celler.
- FACS flekker strategi
3. Retroviral Transduksjon for aktiverte CD4 + T celler og deres differensiering i spesifikke T Helper Delsett
- retro~~POS=TRUNC Transduksjon
MERK: Retroviral integrering og uttrykk av gener krever celledeling. Derfor må T-celler aktiveres O / N.- Mens isolering av de naive T-celler, belegge en 24 brønners vevskulturplate med anti-CD3 og anti-CD28 antistoff fortynnet i DPBS. Legg 250 mL per brønn. Bruk anti anti-CD3 på 1 ug / ml. Bruk anti-CD28 på 2 mikrogram / ml dersom cellene til slutt vil bli differensiert i henhold Th0, Th1, Th2 og iTregs forhold. Bruke anti-CD28 ved 10 ug / ml for Th9 og Th17 betingelser. Inkuber ~ 2 timer ved 37 ° C i en vevskulturinkubator.
- Like før dyrking av cellene, fjernes antistoffløsning og platen vaskes med ~ 250 ul DPBS per brønn for å fjerne unbound antistoff. Vær forsiktig med å la platen tørke ut så behandle maksimalt 6 brønner på en gang. Fjern DPBS vaske og tilsett 1 ml av naive CD4 + T-celler i R10 medium på 0.75-1 x 10 6 celler per ml. Aktiver celler O / N (14-16 timer).
- Dagen etter sentrifuger cellene i platen ved 900 xg i 5 minutter ved 30 ° C for å feste celler til bunnen av brønnene.
- Samle og lagre mediet være forsiktig med å fortrenge cellene, og erstatte med 1 ml virus kultursupernatant fremstilt fra virusproduksjon protokollen. Ikke la cellene tørke ut så behandle maksimalt 4 brønner på en gang.
- Til hver brønn tilsett 1 pl av 8 mg / ml polybren og 10 ul 1 M HEPES pH 7,5 for å hjelpe til virus opptak og forebygge vesentlig alkalisering i den omgivende CO 2 under den påfølgende sentrifugering. Sentrifuger cellene i platen ved 900 xg i 90 min ved 30 ° C.
- Differensiering av celler inn SpeciFIC Delsett
- fjerne viruset kultur supernatanten forsiktig og erstatte med 1 ml av medium innsamlet over i trinn 3.1.4, da det inneholder IL-2 og andre T-celle vekstfaktorer. Legg reagenser som er angitt i Tabell 2 og dyrke celler i 3-4 dager for å differensiere cellene til spesifikke undergrupper.
- Analyse av celler
- For intracellulær farging av cytokiner, behandle celler med 1 pg / ml hver av Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og ionomycin i 4 timer. I løpet av de siste to timer av stimulering, tilsett 1 ug / ml Brefeldin A.
- Resuspender cellene fra bunnen av hver brønn ved å pipettere opp og ned flere ganger. Overfør ca. 10 5 celler til en 96-brønners U-bunnplate (vanligvis 100 pl fra 1 ml av kulturen av Th-celler) for fiksering og farging.
- For GFP farging, fikse celler med 100 ul 2% paraformaldehyde ved RT i nøyaktig 5 min, som en lengre inkubasjonstid vil bleke GFP ennd forstyrre foxp3 farging. Vask cellene ved tilsetning av 100 ul DPBS til hver brønn, og sentrifuger ved 600 xg ved 22 ° C i 5 minutter. Hell av supernatanten.
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Håndtere det på en avtrekkshette med hud og vernebriller. - Fest cellene igjen med 100 mL 1x Fixation buffer laget av foxp3 farging kit (1 volum Fixation buffer til 3 volumer av fortynningsmiddel). Cellene inkuberes i 45 minutter ved romtemperatur, eller alternativt inkuber ved 4 ° C i 16 timer.
- Etter fiksering, permeabilisere cellene ved tilsetning av 100 ul permeabiliseringsbuffer fra samme settet. Inkuber ved romtemperatur i 30-45 min sentrifuger deretter ved 600 x g ved 22 ° C i 5 minutter.
- For antistoff flekker, fjerne fiksering / permeabiliseringsbuffer og tilsett 50 mL av fersk permeabiliseringsbuffer. Legg den nødvendige antistoff fortynnet i permeabiliseringsbuffer på 0,5 mL per 50 mL buffer per prøve. Inkuber i 30-45 min ved RT i mørket for å unngå bleking av influensaorescent etiketten.
- Tilsett 150 ul permeabiliseringsbuffer og sentrifuger ved 600 xg ved 22 ° C i 5 minutter. Kast permeabiliseringsbuffer og legge 200 mL DPBS. Analyser på et flowcytometer bruker protokoller og retningslinjer som er spesifikke for instrumentet for hånden.
MERK: Sørg for å inkludere riktige kontroller for cytokin flekker som farging med isotypekontrollantistoffer, analysere ikke-aktiverte eller Th0 aktiverte celler, etc.
Representative Results
Suksessen til denne eksperimentelle systemet krever svært rene populasjoner av T-celler og høy titer retrovirus forberedelser. Representative Resultatene er vist her som eksempler på vellykkede eksperimenter. Figur 1 viser typiske renhet før og etter valgt populasjoner på hvert trinn av den naive hjelper T-celle isolasjon protokollen. Figur 2 og 3 viser analysen av retrovirus produksjonen gjennom GFP uttrykk i de transfekterte HEK 293T-celler (figur 2) og transduserte T-celler (figur 3). Transfeksjonseffektiviteter av HEK 293T-celler kan variere betydelig med forskjellige retrovirale konstruksjoner, men dette er ofte ikke korrelerer med graden av retrovirusproduksjonen observert med antall GFP + T-celler. Dessuten kan antallet av GFP + T-celler variere avhengig av polariserings betingelser. Videre er mean Ekspresjonsnivået av GFP og det innsatte genet kan variere avhengig av antall viruskopier integrert, effekten av integreringssete på transkripsjon, og post-transkripsjonelle regulatoriske mekanismer som påvirker den virale transkripsjonen.
Til slutt, figur 4 viser noen typiske resultater vi har observert med hjelper-T-celle-differensiering når den miRNAs MIR-15b / 16 blir over-uttrykt. Disse resultatene viser noe av variasjonen som kan oppstå i løpet av en enkelt eksperiment så sanne effekter må dokumenteres med statistisk analyse av flere gjentatte eksperimenter med ulike preparater av T-hjelpeceller. I disse eksperimentene Th2-responser kan være vanskelig å observere i C57BL / 6 linje som brukes her fordi de er utsatt for Th1-responser. Likeledes kan IL-9-farging være vanskelig å oppdage over bakgrunnen. Derfor er det viktig å gjøre isotype kontroller og sette opp riktig kompensasjon for å sikre korrekt gating av cytokin uttrykk. I våre resultater har vi funnet ut at MIR-15b / 16 forbedrer iTreg induksjon ved å hemme mTOR signalveien gjennom å undertrykke uttrykk for komponenter Rictor og mTOR 15. MIR-15b / 16 kan noen ganger påvirke Th0, Th1 og Th17 differensiering i de enkelte forsøk, men det er ingen signifikant effekt når undersøkt i flere gjentatte forsøk. I motsetning MIR-15b / 16 overekspresjon har betydelig undertrykke Th9 differensiering (se referanse 18).
Figur 1. Typisk renhet T-hjelpeceller på hvert trinn i isolasjon. Representant flowcytometri resultatene av de angitte antigener er vist fra porten av levende celler utpekt i Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) plott. (A) Pre- og post-CD4 negativ seleksjon. Expression profiler av CD4,CD8a, og MHCII vises. Disse illustrerer berikelse av hjelper-T-celler og tap av cytotoksiske T-celler og MHC klasse II-uttrykkende celler. En god rensning bør resultere i ~ 90% CD4 + T-celler på dette stadium. (B) CD25 utvalg. På venstre er uttrykket profiler av CD4, CD8a, og MHCII, og til høyre er CD4 og CD25 uttrykk profiler før og etter valget. På dette punktet> 95% av CD25 negativt utvalgte celler bør være CD4 + CD25 -. (C) CD62L utvalg. CD4, CD8a, og MHCII uttrykk profiler er vist til venstre. På høyre uttrykket profiler for CD62L og CD44 er vist for pre-og post-CD62L valgte cellene sammen med CD4 og CD62L uttrykk profilen legg valgte celler. Etter CD62L utvalg praktisk talt alle minneceller (CD44 +) blir fjernet forlate en høyanriket populasjon av naive T-hjelpeceller som inneholder 10-15% effektorceller (CD62L lav). For alleFACS profiler, tilsvarende innstillinger og skalaer for en bestemt parameter ble opprettholdt gjennom. Tallene representerer prosentandelen av celler i et inngjerdet populasjon. Den svake nedgangen i størrelse av cellene etter det første utvalget er antakelig på grunn av mekanisk stress under protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Analyse av retrovirus-transfekterte HEK-293T-celler. GFP ekspresjon er vist i HEK 293T-celler som var enten utransfekterte eller transfektert og analysert etter samling av virale kultursupernatanter. GFP analyse ble gjort på levende celler fra gate på FSC og SSC tomt i det første panelet. Tallene representerer prosentandelen av GFP + celler innenfor gated regionen. typisk transfection effektivitet varierer mellom 30-90%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av retrovirus-transduserte hjelper-T-celler. GFP ekspresjon er vist i retrovirale-transduserte hjelper-T-celler etter differensiering i Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, og treg polariserings betingelser i tre dager. Analyse ble inngjerdet på live og aktiverte cellene angitt i FSC / SSC panel. Transduksjon effektivitet kan variere mellom 10-75% avhengig av konstruksjonen og polarisasjons-forhold. Likeledes, den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av GFP uttrykk kan variere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt av MIR-15b / 16 overekspresjon på helper T celledifferensiering i forskjellige polariserings forhold. Representative cytokin profiler blir vist på GFP + populasjon av celler fra figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1:. Buffere brukes i disse protokollene Klikk her for å laste ned denne tabellen som et Excel-regneark.
| HjelperT-celle polarisering vilkår | ||
| Th0 | anti-IL-4- | 5 ug / ml |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| Th1 | rekombinant-IL-12 | 20 ng / ml |
| anti-IL-4- | 5 ug / ml | |
| Th2 | rekombinant IL-4 | 40 ng / ml |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| Th9 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-4 | 40 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 10 ug / ml | |
| Th17 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-6 | 50 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 5 ug / ml | |
| anti-IL-4- | 5 ug / ml | |
| anti-IL-2- | 5 ug / ml | |
| Tregs | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-2- | 5 ng / ml | |
Tabell 2: Hjelper T-celle undergruppe polarisering forhold.
Discussion
Retroviral mediert overekspresjon av gener er en effektiv måte å analysere funksjon i T-hjelpeceller, som deres utvikling og funksjon er ofte bestemmes av uttrykket nivået av viktige regulatorer. Det er imidlertid forsiktig tolkningen av resultatene er nødvendig fordi ekspresjonsnivåer betydelig over de av det endogene gen kan innføre mange gjenstander. Derfor bør denne teknikken kombineres med andre for å verifisere relevansen av funksjon. For eksempel bør overekspresjon suppleres med redusert uttrykk ved hjelp sirnas eller genet knockouts hvis tilgjengelig. Med mirnas, supplert vi overekspresjon eksperimenter med de av blokkering ved hjelp av virus som overuttrykt kunstig miRNA rettet mot områder som fungerte som konkurrerende inhibitorer for en miRNA 15. Retrovirale transduserte celler kan også anvendes i biokjemiske analyser som involverer RNA og proteinanalyse. Imidlertid er en hovedbegrensning av disse eksperimentene er effektiviteten av transduksjon resulting i en blandet befolkning av transduced og untransduced celler. Derfor vil disse analysene mest sannsynlig kreve sortering av GFP + populasjonen. Til slutt bør in vitro differensieringsanalyser kombineres med in vivo eksperimenter, og en måte dette kan oppnås er ved adoptiv overføring av transduserte T-celler i mus og følge deres differensiering og deres effekt på immunresponsen.
En av de viktigste begrensninger i dette systemet er størrelsen på RNA-genomet som kan pakkes inn i den retrovirale kapsid. Vår erfaring er den maksimale innsatsen størrelse for MIG retroviral system som gir god virusproduksjon er 3-3,5 kb. Derfor kan større gener ikke bli analysert sammen med dette system, da de gir dårlige virus titer. Men de fleste genene er mindre enn denne størrelse, slik dette systemet er nyttig for et bredt utvalg av genet studier.
Med retroviral transduksjon, flere alternativer innenfor disse protokollen,ls har blitt brukt. Mange forskere har benyttet emballasje cellelinjer som stabilt uttrykker retrovirale gener (for eksempel referanse 16). Men vi har fått de høyeste titer ved hjelp av standard HEK 293T celler med co-transfeksjon av PCL-Eco helper virus vektor. Isolering av naive hjelper-T-celler kan også oppnås gjennom cellesortering i stedet for den magnetiske kuler og celleseparasjonskolonne-protokollen, men dette krever adgang til en celle sorter, og kostnadene for slag tid er vanligvis høyere enn list reagenser. Endelig er det variasjoner på aktiveringsbetingelser som benyttes for å skille hjelper-T-celler i de forskjellige undergrupper. For eksempel, TCR stimulering av celler for lenge før eksponering for treg induserende betingelser kan hemme deres induksjon 16. Dette kan være et problem fordi retroviral ekspresjon krever celledeling indusert ved stimulering av celler. Likevel har vi funnet effektiv Treg induksjon bruker denne protokollen med O / N activasjon før retroviral transduksjon.
Innenfor disse protokollene, krever vellykket anvendelse av flere faktorer. Høy titer retrovirus-preparater må effektiv transfeksjon av HEK-293T-celler så høy kvalitet DNA og presist klare 2x HBS er viktige. I tillegg er celletettheten av HEK 293T-celler trenger å være omtrent 50% ved punktet for transfeksjon fordi god ekspresjon av det transfekterte DNA krever at cellene er aktivt voksende, og dette vil bli sperret hvis cellene er for tynt eller tett. Celler på optimal tetthet under transfeksjon skal nå samløpet på et tidspunkt i løpet av virus samling trinnene, men de vil fortsette å produsere høy titer virus aksjer hele veien gjennom til den siste samlingen. Effektiv differensiering av T-hjelpeceller krever god cellekvalitet, slik at enkeltcellene er til renheten vist på figur 1. Likeledes er kvaliteten av cellene er avhengig av mus from hvilke de ble isolert. For disse studiene har vi brukt 6-8 ukers gamle C57BL / 6 mus. Eldre mus kan ha mindre naive celler, og andre stammer kan variere i deres differensiering. For eksempel BALB / c-mus er mer utsatt for Th2-responser enn C57BL / 6-mus 17, slik som nevnt ovenfor, C57BL / 6 T-cellene kan være vanskelig å indusere en Th2 respons. I tillegg kan en hvilken som helst av de differensieringsbetingelsene variere noe fra laboratorium til laboratorium, og effekten av genet overekspresjon kan kun bli tydelig i sub-optimale forhold så cytokin-konsentrasjoner i de forskjellige polariserings betingelser kan være nødvendig å titreres. Til slutt, kan virkningene av overuttrykt genet eller polarisasjons-forhold på celleproliferasjon påvirke transduksjon effektivitet, slik som måler effektene av genet av interesse kan kreve optimalisering av tidspunktet og konsentrasjonen av polariserende reagenser. Optimalisering av alle disse faktorene bør føre til informative resultater med dette systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| DPBS | Sigma | D8537 | |
| MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
| pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
| Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
| MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
| CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
| Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
| Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
| Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
| Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
| Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
| Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
| Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
| Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
| Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
| Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
| Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
| Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
| Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
| Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
| Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
| Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
| Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
| Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
| Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
| Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
| Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
| Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
| KHCO3 | Sigma | 237205 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 |
References
- Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
- Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
- Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
- Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
- Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
- Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
- Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
- Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).
