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Neuroscience

横慢性頭蓋窓の準備を有効 Published: December 29, 2016 doi: 10.3791/54701

Summary

遠位中大脳動脈の分岐(MCAO)の外科的閉塞は実験的ストローク研究で頻繁に使用されるモデルです。この原稿は、マウスの縦生体顕微鏡検査のための機会を提供しています横頭蓋窓の挿入と組み合わせて永久にMCAoの基本的な手法について説明します。

Abstract

局所脳虚血( すなわち、虚血性脳卒中)は、神経機能の深刻な損失に、その結果、運動および認知障害のホストにつながる、主要な脳損傷を引き起こす可能性があります。ストロークが1世界中の長期障害と死の主な原因の一つであるとして、その高い有病率は、深刻な健康負担をもたらします。神経機能の回復は、ほとんどの場合、唯一の部分です。これまでに、治療オプションが原因で血栓溶解2,3ための狭い時間ウィンドウに、特に、非常に制限されます。脳卒中からの回復を加速するための方法を決定することは、プライム医療目標です。しかしながら、これは、回復プロセス中に不十分な機構的洞察により妨げられてきました。実験ストローク研究者が頻繁に局所脳虚血の齧歯類モデルを採用しています。急性期を越えて、脳卒中の研究は、脳虚血次亜急性および慢性期にますます集中しています。ほとんどのストロークの研究者は、永続的またはトラン適用しますマウスまたはラットにおけるMCAのトランジェント閉塞。患者では、MCAの閉塞は、虚血性脳卒中4の最も頻繁な原因の一つです。フィラメントモデルを用いて、MCAの近位閉塞のほか、遠位MCAの外科的閉塞は実験的ストローク研究5の中で最も頻繁に使用されるモデルは、おそらくです。 MCAブランチ(lenticulo-線条動脈の分岐まで)遠位の閉塞は、通常、線条体を惜しみ、主に新皮質に影響を与えます。血管閉塞は、永久的または一時的であることができます。長期転帰に対する病変体積と非常に低い死亡率の高い再現性は、このモデルの主な利点です。ここでは、矢状静脈洞に慢性頭蓋窓(CW)準備横を実行するために、その後どのように開頭術アプローチを使用して、ウィンドウの下に遠位脳卒中を引き起こす外科的方法を示しています。このアプローチは、ビアの虚血後の急性および慢性の変化の連続画像形成のために適用することができます落射照明、共焦点レーザー走査、及び二光子生体顕微鏡。

Protocol

倫理の声明:動物を対象とした実験は、該当する場合、Landesamt fuerお大事にウントSoziales、ベルリン、ドイツ(G0298 / 13)とARRIVE基準によって定められたガイドラインおよび規則に従って行いました。 12週齢の雄のC57BL / 6Jマウスに本研究では、10-に使用しました。

1.横慢性頭蓋窓の準備

  1. 皮下ケタミンの注射(90 mgの/ kg)およびキシラジン(10mg / kg)で麻酔を行います。痛みの刺激との適切な鎮静のためのテスト。
  2. 70%エタノールで手術器具および手術野を滅菌します。
  3. げっ歯類のシェーバーを使用して、目に首から頭皮の毛を削除します。
  4. 定位フレームにヘッドを固定してください。
  5. 脱水症状を避けるために、両眼にデクスパンテノール眼軟膏を使用してください。
  6. すべての毛を除去し、74.1パーセントのエタノールと10%2-プロプラノロールの3層で、それを滅菌する手術領域を清掃してください。
  7. 正中線を実行しますメスを用いて目に首から切開。
  8. 4テンティング縫合糸で皮膚フラップにまたがります。
  9. 頭筋が始まる点にメスでそ​​れを掻き落とし左半球に慎重に骨膜を削除します。
    注:この製剤はまた、カバーガラスを固定する歯科接着剤、のための良好な接着領域を作成するのに役立ちます。
  10. マイクロドリルを用いて骨フラップの縁に頭蓋骨を薄くすることにより、直径4mmの前頭頭頂開頭術を実行します。熱損傷を回避するために掘削しながら、生理食塩水を適用します。
  11. カニューレと骨弁を高め、マイクロピンセットを使ってそれを削除します。
  12. 食塩水で慎重かつ広範囲に灌漑。
  13. それは適切な一貫性を持っており、流体でなくなるまで、歯科用接着剤を混ぜる( すなわち、接着剤はもはやスレッドを生成するべきではありません)。開頭術の周りの骨の上に置きます。
  14. 準備された接着剤の6ミリメートル径のカバーガラスを置き、目でそれを修正歯科接着剤の電子レスト。それは防水であることを確認してください。接着剤は、ピンセットでそれをテストすることによって乾燥させ、ハードされるまで待ちます。
    注:追加の灌漑は、硬化プロセスを加速します。
  15. テンティング縫合糸を外し、皮膚縫合糸で傷口を閉じます。
  16. マウスの脇腹の皮膚を引き上げます。針を皮下に挿入し、ゆっくりと体液バランスのために滅菌生理食塩水を皮下の0.5ミリリットルを代入します。
  17. 手術後、90分間加熱した回復ケージに動物を飼います。動物は無人それらを離れる前に、完全に目を覚ましているまで待ってください。動物は完全に他の動物とのケージに戻す前に回収されるまで待ちます。
  18. ステップ1.16で説明したように、約12時間後に皮下生理食塩水の体積置換を繰り返します。
  19. 常に手術( 例えば、パラセタモール(10 mg / mlで)、または他の非ステロイド性抗炎症薬)の後に口腔内に強制飼養を介して、または直接に鎮痛を適用します。
  20. チェック常に動物の状態、手術後、毎日、とは単純な食べ作ることと、手術後の重要な重量損失を回避するために、ペトリ皿の中で床の上につぶした動物性食品を提供します。
    注:生体顕微鏡は、頭蓋窓の準備の後の最初の日に行うことができます。
  21. イソフルラン麻酔を適用し、ヘッドホルダに動物を固定します。皮膚の縫合糸を開き、綿棒と、滅菌生理食塩水でウィンドウをきれいにします。 24時間後、頭蓋窓は、イメージングを可能にする、その時点によって脳脊髄液で満たされるべきです。確立された顕微鏡プロトコル18を使用して撮影を行います。

2.遠位にMCAo

注:のMCAO手順はCW調製後約5 Dを実行する必要があります。これは、脳卒中により誘導される免疫反応のCW製剤によって引き起こされる免疫反応からの干渉を最小限に抑えることができます。

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遠位にMCAoの1.概要図。 A.これは、オペアンプの前に船のいいの概要です。第1のバイポーラ接触後B.船。第2のバイポーラ接触後のC.は船。 D.完全に締め切られている船舶、についての概要。低倍率でのE.ファイナル概要。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 2/3 N 2 Oと1/3 O 2を 介して 1.5%イソフルラン- 1.0と2%イソフルランおよびメンテナンス-獣医のスタッフ( 例えば、1.5での誘導と協議の上、麻酔マスクと適切な麻酔薬体制を使用してマウスをAnaesthetize気化器)。
  2. (剃ると毛を除去し、適切な薬剤と皮膚や周囲の毛を消毒例えば、70%のエチルアルコール)、その後、それを乾燥させます。
  3. 36.5℃でのマウスの体温を維持するためには、手術中に0.5℃、±しました。マウスの直腸温度に応じて加熱されたフィードバック制御加熱パッドは、強くお勧めします。
  4. 横位置で動物を置きます。麻酔マスクで鼻を修正し、1.0にイソフルラン濃度を調整 - 1.5%。
  5. 両眼に濡れた軟膏(デクスパンテノール)を適用します。
  6. CWの準備のために作られた皮膚切開を使用してください。
  7. 優しく肌を分離し、その下側頭筋を識別します。
  8. 高周波発生器のエネルギー調整(5から7 W)をバイポーラモードを使用します。
  9. 電気凝固鉗子を使用して、慎重に完全に筋肉を除去することなく、筋肉のフラップを作成し、頭蓋骨から頭筋を取り除きます。
  10. レトロ眼窩に背、時間領域の吻側部分に透明頭蓋骨の下にMCAを特定リットル洞。 MCA分岐部が識別できない場合、容器最も吻側を特定しようとします。
  11. 継続的に熱損傷を避けるために灌漑しながら、マイクロドリルでMCA枝上記薄い頭蓋骨。
  12. カニューレと骨を持ち上げて、マイクロピンセットでそれを削除します。
  13. 5 W. - 3に高周波発電機のエネルギーを減少させます
  14. 上から動脈に近づき、そっと容器を持ち上げることなく、両側のバイポーラ鉗子でそれに触れます。
  15. 血管分岐部に近位および遠位動脈を凝固。
  16. 30秒間待ってから、血流が恒久的に中断されることを保証するために、静かに動脈をタッチします。再疎通が観察されている場合は電気凝固を繰り返します。
  17. 可能な場合、骨欠損をカバーするために、筋肉の挿入で1または2のステッチと頭筋を修正しました。
  18. 傷口を縫合し、加熱された回収ボックスに動物を配置します。すぐに揮発性ANEST後に一般的には、動物の回復hesia。
  19. ステップ1.16で説明したように、ボリュームの置換については、滅菌生理食塩水の皮下に0.5mlのを適用します。
  20. 手術後、動物は90分間加熱回復ケージに滞在することができます。動物は無人それらを離れる前に意識しているまで待ってください。それらが完全に回復している場合にのみ、他の動物とのケージに戻します。
  21. 12時間後に、ステップ1.16で説明したように、ボリュームの置換を繰り返します。
  22. 飲料水( 例えば、パラセタモール(10 mg / mlで)、または他の非ステロイド性抗炎症薬) を介して、術後鎮痛を適用します。
  23. 手術後、毎日の動物の病状を確認してください。食を簡素化し、術後の体重減少を最小限に抑えるために床の上にペトリ皿にマッシュポテト動物性食品を提供します。

3.シャム治療

  1. 上記の-含むCW準備-除く露出した中大脳ARを凝固しない説明したステップ1及び2に同一のすべての手順を実行しますテリ。

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Representative Results

タイムライン及び代表的な結果を図2および図3に示されています。上矢状静脈洞( 図2 B、C、D)経験豊富な外科医によって行われる非常に低い死亡率および罹患率率の結果に小さな頭蓋窓の横で頭蓋窓の準備、。 10匹の動物の全てが生存し、そしてすべての慢性CWも28日目、手術後、高品質の画像化に使用することができます。創傷感染症や他の合併症には問題はありませんでした。

揮発性麻酔とわずかな脳損傷、約10の短い露出に - 15遠位にMCAo分後、加熱回復ケージに移し、全ての動物が自由に回復ケージに移動し、同腹子との相互作用、目を覚ましました。一般的に、遠位MCAOモデルの死亡率は5%未満であると、主血管Iの結果として生じますMCAO手術中njuryとその後の出血。遠位にMCAo、次の28日間の観察期間中の死亡率はごくまれにしか発生しません。形態学的に、病変は、組織学またはMRI( 図3A、B)を用いて評価することができます。また、MRI測定は、縦方法で病変体積および進行を評価する機会を提供しています。 MRIは、偽手術後、何の病変皮質組織は、( 図3A)が見つからなかった一方で、明らかに、慢性CWの下に位置する虚血性病変を示している虚血24時間後に行きました。 MRIの結果は、このように、糸状MCAOモデル( 図3B)とは対照的に、線条体を温存、皮質への損傷の厳格な制限を示します。横慢性CW準備がFigu(エピ蛍光顕微鏡( 図3C、上部)により2光子顕微鏡による皮質下領域の皮質血管系および微小循環の長期的な可視化を可能にします3C、下部を)再。さらに、このような蛍光寿命イメージングなどの蛍光標識された細胞または自己蛍光の測定と画像の分子経路および細胞間相互作用することが可能です。 図3Dに示すように、遠位MCAOモデルは、再現性の高い虚血性病変を引き起こします。梗塞容積については、我々は手術の単一のセットで15%以下の標準偏差を期待しています。上記のように、近位にMCAoのモデルとは対照的に、死亡率は、遠位モデル5にはむしろ低いです。局所脳虚血後の逐次MRI病変、ボリューム、および浮腫の進行を使用して評価することができます。 24時間と永久遠位にMCAo後96時間でのMRIは、T2 hyperintensitiesの有意な進行を示しませんでした。

図2
図2:慢性頭蓋窓の準備。 (A)代表のタイムライン。 <強い>(B)開頭術は頭筋、上矢状静脈洞の内側、そしてブレグマに背を横方向、場所を取るエリアをマーク。無傷の硬膜層と場所でカバーガラスと(C)開頭後に脳表面;円は遠位にMCAo後に虚血領域の位置を示しています。 (D)固定されたカバーガラスで仕上げ慢性頭蓋窓、数週間反復イメージングのための準備ができて(B =ブレグマ、TM =頭筋、SSS =上矢状静脈洞、虚血のAI =面積)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 横慢性CWおよび遠位にMCAoまたは偽手術の組み合わせ。 (A)MRIは、SHの24時間後に行わ午前の手術は、任意の病変皮質組織は表示されません。 (B)MRIは、明らかに慢性CWの下に位置する虚血性病変(*)を示す虚血24時間後に行きました。 (C)生体内エピ蛍光画像(上段)および皮質血管系の二光子イメージング(下段)。虚血24時間後と96時間後にMRIによって評価(D)梗塞容積は24時間と96時間で12.2 1.9ミリメートル3で13.16 2.3ミリメートル3の平均病変体積を示しています。各ドットは個々の動物を(群当たりn = 10匹、平均±SEM)を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ストロークが1世界中の長期障害と死の主な原因の一つです。急性期治療を超えて、脳卒中後の回復を促進し、強化するための新しいアプローチやメカニズムを調査すると、プライム医療目標7のまま。実験ストローク研究者が頻繁に局所脳虚血の齧歯類モデルを採用しています。実際には、一時的または恒久的にMCAoを誘導するモデルは、患者4における局所脳虚血の最も一般的なタイプのいずれかを模倣します。 MCAの近位閉塞のほかに、遠位にMCAoの外科的閉塞のためのフィラメントモデルは実験的ストローク研究5,19の中で最も頻繁に使用されるモデルは、おそらくです。ここでは、永久遠位にMCAoの基本的な技術は、マウスの縦生体顕微鏡検査のための機会を提供し、横方向のCWと組み合わせて説明します。病変体積の高い再現性、ならびに非常に低い死亡率、長期的な成果を研究に関して、特に、ARこのマウスモデルの主な利点を電子。この皮質の脳卒中モデルにおいて、脳卒中の領域及び梗塞周囲領域における血管は、慢性CWを介して可視化することができます。マルチ蛍光落射蛍光videomicroscopicシステム、血流力学及び循環細胞の動的な補充を使用すると視覚化することができます。血管は、デキストランまたはアルブミンのような、蛍光標識された巨大分子の使用を介して可視化されます。細胞は、蛍光色素によって、またはGFP陽性動物と骨髄キメラのような遺伝的モデルのいずれかで標識することができます。また、細胞 - 細胞相互作用および血管外細胞の動態を研究するために、二光子レーザー走査共焦点顕微鏡を適用することができます。皮質表面下の250ミクロンまでのイメージングを行うことができます。再度、血管は蛍光標識された巨大分子を用いて染色され、細胞( 例えば、トランスジェニックGFP-ネスチンマウスを使用して)遺伝的に標識されます。

頭蓋窓手術が硬膜を開かずに開頭術を介して行われます。一つの大きな落とし穴が誤ってマイクロドリルで頭蓋骨を開いたときの下硬膜層および皮質を傷つけることです。従って、この技術は、免疫反応や影響顕微鏡結果を誘導硬膜及び大脳皮質の損傷を回避するために、いくつかの技術的熟練を必要とします。また、潜在的な間引き頭蓋骨モデルは、特に長期的には、あるため、残りの頭蓋骨の信頼性の低い顕微鏡品質によって制限されます。 CWモデルでは、窓の品質は頭蓋骨の再成長または硬膜肥厚影響が品質14,20を画像化するまで、数ヶ月続く一方で、頻繁に、繰り返しの頭蓋骨間伐が必要です。間引き頭蓋骨調製物と、このモデルの変調が可能です。硬膜層は皮質の任意の傷害または励起を回避するために、脳にしておく必要があります。虚血領域への直接適用が実験モデルにおいて所望されている場合にのみ、硬膜を再することができます慎重に、任意のブリッジング静脈を傷つけることなく、移動しました。

モデルCWを組み合わせるだけで、非常に小さい虚血性病変に導く、循環光増感剤の照射を介して標的に血管閉塞を誘発するとは対照的に、遠位MCAOモデルを模倣皮質MCA領域13に配置されている人間のストロークの大多数。 CWの準備に一過性炎症反応との干渉を避けるために、ウィンドウは数日遠位のMCAO手術前に準備する必要があります。

げっ歯類で機能的なだけでなく、行動の側面を評価するための試験の数は21( 例えば、歩行分析、ロータロッド試験、ポール試験、接着剤除去試験、階段テスト、オープンフィールド試験、モリス水迷路)を用意しています。これらの試験の全てにおいて、にMCAoを施したマウスは、短期および中期アウトカムに対する対照動物よりも正常に実行します。しかし、評価について長期転帰は、機能テストの感度が非常に遠位にMCAoの面で制限されただけでなく、軽度の近位にMCAo 19,21-23であることを認識しなければなりません。

よく訓練された外科医によって行わ遠位にMCAoは、20分未満以内に誘導することができ、再現性の高い虚血性病変を生成することができます。しかし、再現性は、交絡因子の徹底的な制御を必要とします。手術手技の違いは、梗塞サイズ24の違いにつながる可能性があります。異なるマウス系統が原因株間の脳血管構造内の分散に別のストロークの結果が表示される場合があります。また、体温などのより深刻な赤字25,26、温度制御やメンテナンスが、このモデルでは、だけでなく、他の虚血モデル27に関連性が高いために低体温が小さく病変および温熱療法につながると、虚血の神経損傷と感受性に影響を与えます。例えば、血液pressu一般に、生理学的パラメータ、Re及び血液ガス、成果の重要な交絡因子であり、28のために制御されなければなりません。いくつかの薬剤は、直接神経保護効果を発揮するか、血管作動特性29を介して間接的に作用することができるように加えて、麻酔薬の選択は、非常に重要です。したがって、麻酔への曝露は、標準化され、可能な限り短くする必要があります。最後に、住宅の条件は、濃縮の使用のように、同様にストロークの結果に影響を与える可能性があり、したがって、研究で標準化され、説明されるべきである30を報告します 。新しい治療法、標準化、品質管理、およびレポートの開発に関連した前臨床結果を生成するために最も重要な31です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe FST 21061-10
Stereotactic frame Kopf Model 930
Anaethesia system for isoflurane Draeger
Isoflurane Abott
Dumont forceps #5 FST 11251-10
Dumont forceps #7 FST 11271-30
Bipolar Forceps Erbe 20195-501
Bipolar Forceps  Erbe                              20195-022
Microdrill FST                              18000-17         
Needle holder FST 12010-14
5-0 silk suture Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber Peco Services V1200

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References

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神経科学、問題118、脳虚血、脳卒中、遠位MCAO、頭蓋窓、生体顕微鏡、2光子顕微鏡
横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測
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Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä,More

Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä, M., Broggini, T., Vajkoczy, P., Prinz, V. Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (118), e54701, doi:10.3791/54701 (2016).

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