Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

पार्श्व लगातार कपाल खिड़की तैयारी में सक्षम बनाता है Published: December 29, 2016 doi: 10.3791/54701
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Neurosurgery and Center for Stroke-research Berlin (CSB), Charité-Universitätsmedizin, 2Department of Physics, University of California San Diego

Summary

एक बाहर का मध्य मस्तिष्क धमनी शाखा (MCAO) के सर्जिकल रोड़ा प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान के क्षेत्र में एक बार उपयोग किया मॉडल है। यह पांडुलिपि स्थायी MCAO की बुनियादी तकनीक, एक पार्श्व कपाल खिड़की की प्रविष्टि है, जो चूहों में अनुदैर्ध्य intravital माइक्रोस्कोपी के लिए अवसर प्रदान करता है के साथ संयुक्त वर्णन करता है।

Abstract

फोकल मस्तिष्क ischemia (यानी, इस्कीमिक स्ट्रोक) प्रमुख मस्तिष्क की चोट के कारण हो सकता है, neuronal समारोह का एक गंभीर नुकसान के लिए और फलस्वरूप मोटर और संज्ञानात्मक विकलांग की एक मेजबान के लिए अग्रणी। इसकी उच्च व्यापकता एक गंभीर स्वास्थ्य बोझ बन गया है, के रूप में स्ट्रोक लंबी अवधि विकलांगता और मौत के लिए दुनिया भर में 1 की प्रिंसिपल कारणों में से एक है। न्यूरोनल समारोह की वसूली ज्यादातर मामलों में, केवल आंशिक है। अब तक, उपचार के विकल्प बहुत थ्रोम्बोलिसिस 2,3 के लिए संकीर्ण समय खिड़की के कारण सीमित कर रहे हैं, विशेष रूप से। तरीकों का निर्धारण स्ट्रोक से वसूली में तेजी लाने के लिए एक प्रमुख चिकित्सा लक्ष्य रहता है; हालांकि, इस वसूली की प्रक्रिया में अपर्याप्त यंत्रवत अंतर्दृष्टि के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। प्रायोगिक स्ट्रोक शोधकर्ताओं अक्सर फोकल मस्तिष्क ischemia के कृंतक मॉडल को रोजगार। तीव्र चरण के अलावा, स्ट्रोक अनुसंधान तेजी से मस्तिष्क ischemia निम्नलिखित उप तीव्र और जीर्ण चरण पर ध्यान केंद्रित किया है। स्थायी या Tran अधिकांश स्ट्रोक शोधकर्ताओं लागूचूहों या चूहों में एमसीए की sient रोड़ा। रोगियों में, एमसीए के अवरोध इस्कीमिक स्ट्रोक 4 के सबसे लगातार कारणों में से एक हैं। एमसीए के समीपस्थ रोड़ा रेशा मॉडल का उपयोग इसके अलावा, बाहर का एमसीए की शल्य रोड़ा शायद प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान 5 में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मॉडल है। एक बाहर का एमसीए शाखा (lenticulo-रेखायुक्त धमनियों की शाखाओं के लिए) की आड़ में आम तौर पर स्ट्रिएटम की जरूरत नहीं पड़ती और मुख्य रूप से नियोकॉर्टेक्स प्रभावित करता है। पोत रोड़ा स्थायी या क्षणिक हो सकता है। लंबी अवधि के परिणाम के संबंध में घाव मात्रा और बहुत कम मृत्यु दर के उच्च reproducibility इस मॉडल का मुख्य लाभ कर रहे हैं। यहाँ, हम कैसे बाण साइनस के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की (सीडब्ल्यू) तैयारी पार्श्व प्रदर्शन करने के लिए, और बाद में कैसे एक craniotomy दृष्टिकोण का उपयोग कर खिड़की के नीचे एक बाहर का स्ट्रोक के लिए प्रेरित करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रदर्शित करता है। इस दृष्टिकोण के माध्यम से ischemia निम्नलिखित तीव्र और जीर्ण परिवर्तन के अनुक्रमिक इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकतामहामारी रोशन, confocal लेजर स्कैनिंग, और दो-फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी।

Protocol

नैतिकता वक्तव्य: पशु विषयों को शामिल प्रयोगों के रूप में लागू, दिशा निर्देशों और नियमों Landesamt Fuer Gesundheit und Soziales, बर्लिन, जर्मनी (G0298 / 13) और आने मानदंड द्वारा उल्लिखित के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। इस अध्ययन, 10 12 सप्ताह के एक पुरुष C57BL / 6J चूहों करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

1. पार्श्व लगातार कपाल खिड़की तैयारी

  1. ketamine (90 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 / किलो मिलीग्राम) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण प्रदर्शन करना। एक दर्द उत्तेजना के साथ पर्याप्त बेहोश करने की क्रिया के लिए टेस्ट।
  2. शल्य चिकित्सा उपकरणों और 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र जीवाणुरहित।
  3. एक कृंतक शेवर का उपयोग कर आंखों को गर्दन से सिर के बाल निकालें।
  4. एक stereotactic फ्रेम में सिर को ठीक करें।
  5. निर्जलीकरण से बचने के लिए दोनों आंखों पर Dexpanthenol आंख मरहम का प्रयोग करें।
  6. सभी बाल हटाने के लिए और 74.1% इथेनॉल के 3 परतों और 10% 2-propanolol साथ यह बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को साफ करें।
  7. एक midline प्रदर्शन करनाएक छुरी का उपयोग कर आंखों को गर्दन से चीरा।
  8. 4 tenting टांके के साथ त्वचा फ्लैप काल।
  9. यह बंद scraping इस मुद्दे पर जहां अस्थायी पेशी शुरू होता है के लिए एक छुरी के साथ द्वारा बाएँ गोलार्द्ध पर ध्यान periosteum निकालें।
    नोट: यह तैयारी भी दंत गोंद है, जो कांच कवर सुधारों के लिए एक अच्छा आसंजन क्षेत्र बनाने के लिए कार्य करता है।
  10. एक microdrill का उपयोग हड्डी फ्लैप के रिम पर खोपड़ी thinning द्वारा 4 मिमी की एक व्यास के साथ एक ललाट-पार्श्विका craniotomy प्रदर्शन। खारा समाधान लागू गर्मी चोट से बचने के लिए ड्रिलिंग है।
  11. cannulas के साथ हड्डी फ्लैप तरक्की और microforceps का उपयोग कर इसे हटा दें।
  12. खारा समाधान के साथ सावधानी से और बड़े पैमाने पर सिंचाई।
  13. दंत गोंद मिश्रण जब तक यह उचित निरंतरता है और तरल पदार्थ नहीं है (यानी, गोंद धागे अब उत्पादन नहीं होना चाहिए)। यह craniotomy के आसपास की हड्डी पर रखें।
  14. तैयार गोंद पर एक 6 मिमी व्यास के साथ एक कवर कांच की जगह और वें के साथ इसे ठीकदंत गोंद की ई बाकी। यकीन है कि यह निर्विवाद है रहो। जब तक गोंद संदंश के साथ यह परीक्षण से सूखे और कठिन है रुको।
    नोट: एक अतिरिक्त सिंचाई इलाज की प्रक्रिया accelerates।
  15. tenting टांके हटाने और त्वचा टांके के साथ घाव को बंद करें।
  16. माउस के पार्श्व की त्वचा ऊपर खींचो। एक सुई subcutaneously डालें और धीरे द्रव संतुलन के लिए बाँझ खारा subcutaneously के 0.5 मिलीलीटर स्थानापन्न।
  17. सर्जरी के बाद, 90 मिनट के लिए गरम वसूली पिंजरे में जानवरों को रखने के लिए। रुको जब तक जानवरों नायाब उन्हें छोड़ने से पहले पूरी तरह से जाग कर रहे हैं। रुको जब तक पूरी तरह से उन्हें जानवरों के अन्य जानवरों के साथ एक पिंजरे में लौटने से पहले बरामद कर रहे हैं।
  18. कदम 1.16 में वर्णित के रूप में के बारे में 12 घंटे के बाद चमड़े के नीचे खारा मात्रा प्रतिस्थापन दोहराएँ।
  19. हमेशा सर्जरी (जैसे, पेरासिटामोल (10 मिलीग्राम / एमएल) या अन्य गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं) के बाद मौखिक गुहा में gavage के माध्यम से या सीधे पीड़ानाश लागू होते हैं।
  20. चेक जानवरों हर दिन सर्जरी के बाद की स्थिति है, और हमेशा एक पेट्री डिश सरल खाने बनाने के लिए और सर्जरी के बाद महत्वपूर्ण वजन घटाने से बचने के लिए फर्श पर पशु खाद्य मसला प्रदान करते हैं।
    नोट: intravital माइक्रोस्कोपी कपाल खिड़की तैयारी के बाद पहले दिन किया जा सकता है।
  21. isoflurane संज्ञाहरण लागू करते हैं और एक सिर धारक में पशु तय कर लो। त्वचा सीवन खोलें और कपास की कलियों और बाँझ खारा के साथ खिड़की साफ। 24 घंटे के बाद, कपाल खिड़की उस समय बिंदु है, जो इमेजिंग सक्षम बनाता द्वारा मस्तिष्कमेरु द्रव से भरा जाना चाहिए। स्थापित माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल 18 का उपयोग करके इमेजिंग प्रदर्शन।

2. दूरस्थ MCAO

नोट: MCAO प्रक्रिया सीडब्ल्यू तैयारी के बाद किया जाना चाहिए के बारे में 5 डी। यह प्रतिरक्षा स्ट्रोक प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ सीडब्ल्यू तैयारी की वजह से प्रतिक्रिया से हस्तक्षेप को कम करता है।

"Src =" / files / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
चित्रा 1. दूरस्थ MCAO का अवलोकन। ए इस सेशन से पहले जहाजों के बारे में एक अच्छा सिंहावलोकन है। पहले द्विध्रुवी संपर्क के बाद बी वाहिकाओं। दूसरी द्विध्रुवी संपर्क के बाद सी वाहिकाओं। डी वाहिकाओं है, जो अब पूरी तरह से बंद हो जाती हैं के बारे में अवलोकन। कम बढ़ाई साथ ई अंतिम अवलोकन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पशु चिकित्सा स्टाफ के साथ (एक संज्ञाहरण मुखौटा और एक उचित संवेदनाहारी के शासन का प्रयोग चूहों, परामर्श से बेहोश करना जैसे, 1.5 के साथ प्रेरण - 2% isoflurane और 1.0 के साथ रखरखाव - 1.5% isoflurane 2/3 एन ओ 2 और 1/3 हे 2 में के माध्यम से एक vaporizer)।
  2. दाढ़ी और बालों को हटाने और त्वचा और एक उचित एजेंट के साथ आसपास के फर कीटाणुरहित (उदाहरण के लिए, 70% इथाइल अल्कोहल), और इसे बाद में सूखी।
  3. 36.5 डिग्री सेल्सियस पर चूहों के शरीर का तापमान बनाए 0.5 डिग्री सेल्सियस ± सर्जरी के दौरान। एक प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड, माउस का गुदा तापमान के अनुसार गर्म किया जाता है, अत्यधिक की सिफारिश की है।
  4. पार्श्व स्थिति में पशु रखें। संज्ञाहरण नकाब में नाक को ठीक और 1.0 isoflurane एकाग्रता समायोजित - 1.5%।
  5. दोनों आंखों को गीला मरहम (Dexpanthenol) को लागू करें।
  6. त्वचा सीडब्ल्यू तैयार करने के लिए बनाया चीरा का प्रयोग करें।
  7. धीरे त्वचा अलग और नीचे अस्थायी मांसपेशियों की पहचान।
  8. उच्च आवृत्ति जनरेटर की ऊर्जा को समायोजित (5 - 7 डब्ल्यू) और द्विध्रुवी मोड का उपयोग करें।
  9. electrocoagulation संदंश का प्रयोग करें और ध्यान से खोपड़ी से अस्थायी मांसपेशी को हटाने, एक मांसपेशी फ्लैप बनाने, पूरी तरह से मांसपेशियों को हटाने के बिना।
  10. लौकिक क्षेत्र के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग में पारदर्शी खोपड़ी नीचे एमसीए को पहचानें रेट्रो-Orbita पृष्ठीयएल साइनस। एमसीए विभाजन की पहचान नहीं की जा सकती है, तो पोत सबसे व्याख्यान चबूतरे की पहचान के लिए प्रयास करें।
  11. एक microdrill जबकि लगातार गर्मी के नुकसान से बचने के लिए सिंचाई के साथ एमसीए शाखा ऊपर पतली खोपड़ी।
  12. cannulas के साथ हड्डी लिफ्ट और microforceps के साथ इसे हटा दें।
  13. 5 डब्ल्यू - करने के लिए 3 उच्च आवृत्ति जनरेटर की ऊर्जा में कमी
  14. ऊपर से धमनी दृष्टिकोण और धीरे पोत उठाने के बिना दोनों पक्षों पर द्विध्रुवी संदंश के साथ यह स्पर्श करें।
  15. पोत बंटवारे को proximally और distally धमनी जमना।
  16. 30 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें, और उसके बाद स्पर्श धमनी धीरे सुनिश्चित करना है कि रक्त के प्रवाह को स्थायी रूप से बाधित है। electrocoagulation दोहराएँ अगर एक recanalization मनाया जाता है।
  17. पेशी प्रविष्टि पर 1 या 2 टांके के साथ लौकिक मांसपेशियों को ठीक करें, अस्थि दोष को कवर करने के लिए यदि संभव हो तो।
  18. घाव सिवनी और गर्म वसूली बॉक्स में जानवरों की जगह। सामान्य में, जानवरों वसूली जल्दी से उतार-चढ़ाव के बाद anesthesia।
  19. मात्रा प्रतिस्थापन के लिए, कदम 1.16 में वर्णित है, बाँझ खारा subcutaneously के 0.5 मिलीलीटर लागू होते हैं।
  20. सर्जरी के बाद, जानवरों के 90 मिनट के लिए गरम वसूली पिंजरे में रहने के लिए अनुमति देते हैं। रुको जब तक जानवरों नायाब उन्हें छोड़ने से पहले सचेत कर रहे हैं। केवल उन्हें अन्य जानवरों के साथ एक पिंजरे में लौटने के लिए जब वे पूरी तरह से ठीक हैं।
  21. मात्रा प्रतिस्थापन दोहराएँ, के रूप में कदम 1.16 में बताया गया है, 12 घंटे के बाद।
  22. पीने के पानी (जैसे, पेरासिटामोल (10 मिलीग्राम / एमएल) या अन्य गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं) के माध्यम पश्चात पीड़ानाश लागू करें।
  23. सर्जरी के बाद हर दिन पशुओं की चिकित्सा हालत की जाँच करें। खाने सरल करने के लिए और पश्चात वजन घटाने के लिए कम से कम करने के लिए फर्श पर एक पेट्री डिश में मैश किए हुए जानवर भोजन प्रदान करें।

3. कृत्रिम उपचार

  1. चरण 1 और 2, ऊपर सहित सीडब्ल्यू तैयारी को छोड़कर उजागर मध्य मस्तिष्क की गिरफ्तारी जमना नहीं है वर्णित को हूबहू सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शनtery।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

समय और प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 2 और 3 में दिखाया जाता है। कपाल खिड़की तैयारी, बेहतर बाण साइनस (चित्रा 2 बी, सी, डी) जब एक अनुभवी सर्जन द्वारा किया जाता है एक बहुत ही कम मृत्यु दर और रुग्णता दर में परिणाम के लिए एक छोटा सा कपाल खिड़की पार्श्व के साथ। 10 पशुओं के सभी बच गया, और सभी पुरानी सीडब्ल्यू, उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यहां तक ​​कि 28 दिनों सर्जरी के बाद। घाव में संक्रमण या अन्य जटिलताओं के साथ कोई समस्या नहीं थी।

अस्थिर संज्ञाहरण और केवल मामूली मस्तिष्क क्षति, लगभग 10 करने के लिए कम जोखिम के कारण - बाहर का MCAO के बाद 15 मिनट और गर्म वसूली पिंजरे करने के लिए स्थानांतरण, सभी जानवरों जाग रहे थे, स्वतंत्र रूप से वसूली पिंजरे में चलती है, और littermates के साथ बातचीत। सामान्य में, बाहर का MCAO मॉडल की मृत्यु दर कम से कम 5% है और मुख्य रूप से संवहनी मैं का एक परिणाम के रूप में होता हैnjury और MCAO सर्जरी के दौरान बाद में नकसीर। 28 दिन की अवधि अवलोकन बाहर का MCAO निम्न के दौरान मृत्यु दर केवल बहुत कम ही होता है। आकृति विज्ञान, घाव ऊतक विज्ञान या एमआरआई (चित्रा 3 ए, बी) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, एमआरआई माप एक अनुदैर्ध्य ढंग से घाव की मात्रा और प्रगति का आकलन करने का अवसर प्रदान करते हैं। एक एमआरआई 24 घंटा प्रदर्शन के बाद ischemia स्पष्ट रूप से इस्कीमिक पुरानी सीडब्ल्यू के नीचे स्थित घाव को दर्शाया गया है, जबकि नकली सर्जरी के बाद, कोई lesioned cortical ऊतक मिला था (चित्रा 3 ए)। एमआरआई परिणाम स्पष्ट रूप से, कोर्टेक्स को घाव के सख्त प्रतिबंध दिखाने के इस प्रकार स्ट्रिएटम बख्शते, filamentous MCAO मॉडल (चित्रा 3 बी) के विपरीत। पार्श्व पुरानी सीडब्ल्यू तैयारी (figu महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा -3 सी, ऊपरी भाग) से और दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा subcortical क्षेत्रों के cortical वाहिका और microcirculation की लंबी अवधि के दृश्य के लिए सक्षम बनाता हैफिर से -3 सी, निचले हिस्से)। इसके अलावा, यह इस तरह के प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग के रूप में प्रतिदीप्ति लेबल कोशिकाओं या autofluorescence माप, साथ छवि आणविक रास्ते और सेल करने वाली सेल बातचीत संभव है। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3 डी, बाहर का MCAO मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इस्कीमिक घावों का कारण बनता है। रोधगलितांश मात्रा के बारे में, हम सर्जरी के एक सेट में 15% से नीचे एक मानक विचलन की उम्मीद है। जैसा कि ऊपर कहा, समीपस्थ MCAO के मॉडल के विपरीत, मृत्यु दर बाहर का मॉडल 5 के लिए नहीं बल्कि कम कर रहे हैं। अनुक्रमिक एमआरआई, घाव, मात्रा, और शोफ प्रगति फोकल मस्तिष्क ischemia निम्न का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। 24 घंटा और स्थायी बाहर का MCAO के बाद 96 घंटा पर एमआरआई T2 hyperintensities का कोई महत्वपूर्ण प्रगति दिखाया।

चित्र 2
चित्रा 2: लगातार कपाल खिड़की तैयार करना। (ए) प्रतिनिधि समय। <strong> (बी) के क्षेत्र में जहां craniotomy अस्थायी पेशी के लिए जगह है, पार्श्व लेता चिह्नित, बेहतर बाण साइनस को औसत दर्जे का है, और शीर्षस्थान के लिए पृष्ठीय। (सी) एक craniotomy के बाद मस्तिष्क की सतह, एक अक्षुण्ण ड्यूरा परत और जगह में कांच कवर के साथ; वृत्त बाहर का MCAO के बाद इस्कीमिक क्षेत्र का स्थान पता चलता है। (डी) फिक्स्ड कांच कवर के साथ समाप्त पुरानी कपाल खिड़की, कई हफ्तों (ख = शीर्षस्थान, टीएम = अस्थायी मांसपेशी, एसएसएस = बेहतर बाण साइनस, ऐ = ischemia के क्षेत्र) के लिए दोहराव इमेजिंग के लिए तैयार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पार्श्व जीर्ण सीडब्ल्यू और बाहर का MCAO या नकली सर्जरी का संयोजन। (ए) एमआरआई श के बाद 24 घंटे प्रदर्शन कियाAM सर्जरी किसी भी lesioned cortical ऊतक नहीं दिखा है। (बी) एमआरआई 24 घंटा प्रदर्शन के बाद ischemia स्पष्ट रूप से इस्कीमिक घाव (*) पुरानी सीडब्ल्यू के नीचे स्थित दर्शाया गया है। (सी) intravital महामारी प्रतिदीप्ति इमेजिंग (ऊपरी हिस्सा) और cortical vasculature की दो photon इमेजिंग (निचले भाग)। (डी) रोधगलितांश मात्रा 24 घंटे में एमआरआई के माध्यम से मूल्यांकन और ischemia के बाद 96 घंटा के एक मतलब घाव 96 घंटा पर 24 घंटे में 13.16 2.3 मिमी 3 की मात्रा और 12.2 1.9 मिमी 3 से पता चलता है। प्रत्येक डॉट एक व्यक्ति जानवर (एन = समूह प्रति 10 जानवरों, ± SEM मतलब है) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्ट्रोक लंबी अवधि विकलांगता और मौत के लिए दुनिया भर में 1 की प्रिंसिपल कारणों में से एक है। तीव्र उपचार, नए तरीकों और तंत्र की जांच में तेजी लाने और स्ट्रोक के बाद वसूली बढ़ाने के लिए परे एक प्रमुख चिकित्सा लक्ष्य 7 बनी हुई है। प्रायोगिक स्ट्रोक शोधकर्ताओं अक्सर फोकल मस्तिष्क ischemia के कृंतक मॉडल को रोजगार। वास्तव में, मॉडल उत्प्रेरण क्षणिक या स्थायी MCAO रोगियों 4 में फोकल मस्तिष्क ischemia का सबसे आम प्रकार से एक की नकल। एमसीए के समीपस्थ रोड़ा इसके अलावा, बाहर का MCAO की शल्य चिकित्सा के लिए रोड़ा रेशा मॉडल शायद प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान 5,19 में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मॉडल है। यहाँ, हम स्थायी बाहर का MCAO की बुनियादी तकनीक एक पार्श्व सीडब्ल्यू के साथ संयुक्त, चूहों में अनुदैर्ध्य intravital माइक्रोस्कोपी के लिए अवसर की पेशकश का वर्णन है। लंबी अवधि के परिणामों का अध्ययन करने के लिए सम्मान के साथ घाव मात्रा के उच्च reproducibility, साथ ही बहुत कम मृत्यु दर, विशेष रूप से, गिरफ्तारीई यह murine मॉडल का मुख्य लाभ। इस cortical स्ट्रोक मॉडल में, स्ट्रोक क्षेत्र और पेरी रोधगलितांश क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं पुरानी सीडब्ल्यू के माध्यम से देखे जा सकते हैं। एक बहु-प्रतिदीप्ति epifluorescence videomicroscopic प्रणाली, रक्त प्रवाह की गतिशीलता और घूम कोशिकाओं के गतिशील भर्ती का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं। रक्त वाहिकाओं dextrans या एल्बुमिन की तरह, fluorescently लेबल अणुओं के उपयोग के माध्यम से कल्पना कर रहे हैं। कक्ष या तो फ्लोरोसेंट रंगों से या ऐसे GFP पॉजिटिव जानवरों के साथ अस्थि मज्जा काइमेरा के रूप में आनुवंशिक मॉडल, द्वारा लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल करने वाली सेल बातचीत और extravascular कोशिकाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के लिए लागू किया जा सकता है। cortical सतह के नीचे 250 माइक्रोन तक की इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता है। फिर, रक्त वाहिकाओं fluorescently लेबल अणुओं का उपयोग दाग रहे हैं, और कोशिकाओं के आनुवंशिक रूप से चिह्नित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक GFP-Nestin माउस का उपयोग करके)।

कपाल खिड़कीसर्जरी ड्यूरा खोलने के बिना एक craniotomy के माध्यम से किया जाता है। एक प्रमुख ख़तरा गलती Dural परत और कोर्टेक्स जब microdrill साथ खोपड़ी खोलने के नीचे चोट पहुंचाना है। इसलिए, इस तकनीक के क्रम में ड्यूरा और प्रांतस्था, जो एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रभावों माइक्रोस्कोपी परिणाम लाती को होने वाले नुकसान से बचने के लिए कुछ तकनीकी कौशल की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, एक संभावित पतला खोपड़ी मॉडल विशेष रूप से लंबे समय में, शेष खोपड़ी की वजह से कम विश्वसनीय माइक्रोस्कोपी गुणवत्ता के द्वारा सीमित है। अक्सर, दोहराव खोपड़ी thinning जबकि सीडब्ल्यू मॉडल में, खिड़की गुणवत्ता, कई महीनों के लिए रहता है खोपड़ी regrowth या इमेजिंग गुणवत्ता 14,20 Dural उमड़ना को प्रभावित करती है, जब तक आवश्यक है। एक पतला-खोपड़ी तैयारी के साथ इस मॉडल की एक मॉडुलन संभव हो जाएगा। Dural परत मस्तिष्क पर छोड़ दिया जाना चाहिए किसी भी चोट या कोर्टेक्स की उत्तेजना से बचने के लिए। तभी इस्कीमिक क्षेत्र के लिए एक सीधा आवेदन एक प्रयोगात्मक मॉडल में वांछित है ड्यूरा फिर से किया जा सकताले जाया गया, सावधानी से और किसी भी पाटने नसों घायल हुए बिना।

एक सीडब्ल्यू के संयोजन और घूम photosensitizers के विकिरण के माध्यम से लक्षित पोत रोड़ा उत्प्रेरण, केवल बहुत छोटे इस्कीमिक घावों के लिए अग्रणी मॉडल के विपरीत, बाहर का MCAO मॉडल mimics मानव स्ट्रोक कि cortical एमसीए के इलाके 13 में स्थित हैं के बहुमत। एक क्षणिक भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए सीडब्ल्यू तैयारी की वजह से, खिड़की बाहर का MCAO सर्जरी से पहले कई दिनों के लिए तैयार रहना चाहिए।

परीक्षणों के एक नंबर का आकलन करने के कृन्तकों में कार्यात्मक रूप में अच्छी तरह से व्यवहार सभी पहलुओं उपलब्ध हैं (जैसे, चाल विश्लेषण, rotarod परीक्षण, पोल परीक्षण, चिपकने वाला हटाने परीक्षण, सीढ़ी परीक्षण, खुले मैदान परीक्षण, और मॉरिस पानी भूलभुलैया) 21। इन परीक्षणों के सभी में, MCAO के अधीन चूहों अल्पकालिक और मध्यवर्ती अवधि परिणामों के संबंध में नियंत्रण जानवरों से भी कम समय में सफलतापूर्वक प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, के आकलन के बारे मेंलंबी अवधि के परिणामों, यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि कार्यात्मक परीक्षण की संवेदनशीलता को बाहर का MCAO के मामले में बहुत ही सीमित है, साथ ही हल्के समीपस्थ MCAO 19,21-23 है।

दूरस्थ MCAO, अच्छी तरह से प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किया जाता है, कम से कम 20 मिनट के भीतर प्रेरित किया जा सकता है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इस्कीमिक घावों का उत्पादन कर सकते हैं। हालांकि, reproducibility confounders का पूरी तरह से नियंत्रण की आवश्यकता है। सर्जिकल तकनीक में अंतर रोधगलितांश आकार 24 में मतभेद पैदा हो सकती है। अलग माउस उपभेदों प्रकारों के बीच मस्तिष्क संवहनी शरीर रचना विज्ञान में प्रसरण के कारण एक अलग स्ट्रोक परिणाम दिखा सकता है। इसके अलावा, शरीर का तापमान neuronal नुकसान और ischemia के लिए संवेदनशीलता, हाइपोथर्मिया और अधिक गंभीर घाटे 25,26 करने के लिए छोटे घावों और अतिताप के प्रमुख के साथ प्रभावित करता है, तापमान नियंत्रण और रखरखाव के अन्य ischemia मॉडल 27 में अत्यधिक इस मॉडल में प्रासंगिक है, साथ ही कर रहे हैं। जैसे रक्त pressu के रूप में सामान्य, शारीरिक मापदंड मेंफिर और रक्त गैसों, परिणाम की महत्वपूर्ण confounders हैं और 28 के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एनेस्थेटिक के चुनाव को अत्यधिक महत्वपूर्ण है, जैसा कि कुछ एजेंटों प्रत्यक्ष न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव डालती है या vasoactive गुण 29 के माध्यम से परोक्ष रूप से कार्य कर सकते हैं। इसलिए, संज्ञाहरण के लिए जोखिम का मानकीकरण और जितना संभव हो कम रखा जाना चाहिए। अंत में, आवास की स्थिति, संवर्धन के उपयोग की तरह, स्ट्रोक परिणाम के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित कर सकता है, और इस तरह का मानकीकरण और अनुसंधान के क्षेत्र में वर्णित किया जाना चाहिए की रिपोर्ट 30। नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण, मानकीकरण, गुणवत्ता नियंत्रण, और रिपोर्टिंग के विकास के लिए प्रासंगिक preclinical परिणाम का उत्पादन करने के लिए अत्यंत महत्व 31 के हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe FST 21061-10
Stereotactic frame Kopf Model 930
Anaethesia system for isoflurane Draeger
Isoflurane Abott
Dumont forceps #5 FST 11251-10
Dumont forceps #7 FST 11271-30
Bipolar Forceps Erbe 20195-501
Bipolar Forceps  Erbe                              20195-022
Microdrill FST                              18000-17         
Needle holder FST 12010-14
5-0 silk suture Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber Peco Services V1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
  2. Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
  3. Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534 (2013).
  4. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  5. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  7. Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
  8. Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
  9. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  10. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
  11. Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
  12. Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
  13. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
  14. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83 (2013).
  16. Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
  17. Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
  19. Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
  20. Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
  21. Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  22. Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
  23. Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
  24. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
  25. Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  26. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  27. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
  28. Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  29. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  30. Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
  31. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 118 मस्तिष्क ischemia स्ट्रोक बाहर का MCAO कपाल खिड़की intravital माइक्रोस्कोपी दो photon माइक्रोस्कोपी
पार्श्व लगातार कपाल खिड़की तैयारी में सक्षम बनाता है<em&gt; Vivo</em&gt; चूहे में दूरस्थ मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा निम्नलिखित अवलोकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä,… More

Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä, M., Broggini, T., Vajkoczy, P., Prinz, V. Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (118), e54701, doi:10.3791/54701 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter