Summary
occlusion chirurgicale d'une branche distale de l'artère cérébrale moyenne (MCAo) est un modèle fréquemment utilisé dans la recherche de course expérimentale. Ce manuscrit décrit la technique de base de MCAo permanente, combinée à l'insertion d'une fenêtre crânienne latérale, ce qui offre la possibilité pour la microscopie intravitale longitudinale chez la souris.
Abstract
Ischémie cérébrale focale (ie, accident vasculaire cérébral ischémique) peut causer des lésions cérébrales importante, conduisant à une perte sévère de la fonction neuronale et par conséquent à une foule de troubles moteurs et cognitifs. Sa prévalence élevée pose un problème de santé grave, car la course est parmi les principales causes d'invalidité à long terme et décès dans le monde 1. La récupération de la fonction neuronale est, dans la plupart des cas, que partielle. Jusqu'à présent, les options de traitement sont très limitées, notamment en raison de l'étroite fenêtre de temps pour thrombolyse 2,3. La détermination des méthodes pour accélérer la récupération d'un AVC reste un objectif médical prime; cependant, cela a été entravée par des idées mécanistes insuffisantes dans le processus de récupération. les chercheurs de l'AVC expérimentaux utilisent fréquemment des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale focale. Au-delà de la phase aiguë, la recherche de la course est de plus en plus axé sur la phase sub-aiguë et chronique suite à une ischémie cérébrale. La plupart des chercheurs d'AVC appliquent permanent ou tranocclusion sitoire du MCA chez des souris ou des rats. Chez les patients, les occlusions du MCA sont parmi les causes les plus fréquentes d'accident vasculaire cérébral ischémique 4. Outre l' occlusion proximale de la MCA en utilisant le modèle de filament, l' occlusion chirurgicale de la MCA distale est probablement le modèle le plus fréquemment utilisé dans la recherche de course expérimentale 5. Occlusion d'une extrémité distale (à la ramification des artères lenticulo-striées) MCA branche épargne généralement le striatum et affecte principalement le néocortex. occlusion des vaisseaux peut être permanent ou transitoire. Haute reproductibilité du volume de la lésion et les taux de mortalité très faibles par rapport aux résultats à long terme sont les principaux avantages de ce modèle. Ici, nous démontrons comment effectuer une fenêtre crânienne (CW) préparation latérale chronique du sinus sagittal, et ensuite comment chirurgicalement induire une course distale sous la fenêtre en utilisant une approche craniotomie. Cette approche peut être appliquée pour l'imagerie séquentielle des changements aigus et chroniques après une ischémie viaepi-éclairante, confocal à balayage laser et microscopie à deux photons intravitale.
Protocol
ÉTHIQUE ÉTAT: Les expériences impliquant des sujets animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne (G0298 / 13) et les critères ARRIVE, selon le cas. Pour cette étude, 10 à 12 semaines d'âge C57BL / 6J ont été utilisées.
1. Lateral chronique Cranial Préparation Fenêtre
- Effectuer une anesthésie par une injection sous-cutanée de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Test de sédation adéquate avec un stimulus de douleur.
- Stériliser les instruments chirurgicaux et champ opératoire avec 70% d'éthanol.
- Retirez le cuir chevelu du cou pour les yeux à l'aide d'un rasoir de rongeur.
- Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique.
- Utilisez dexpanthénol pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter la déshydratation.
- Nettoyer la zone chirurgicale pour enlever tous les poils et le stériliser avec 3 couches de 74,1% d'éthanol et 10% de 2-propanolol.
- Effectuer une ligne médianeincision du cou pour les yeux à l'aide d'un scalpel.
- SPAN le lambeau de peau avec 4 sutures tenting.
- Retirer le périoste avec précaution sur l'hémisphère gauche en grattant avec un scalpel au point où le muscle temporal commence.
NOTE: Cette préparation sert aussi à créer une zone de bonne adhérence pour la colle dentaire, qui fixe le couvercle en verre. - Effectuer une craniotomie fronto-pariétale d'un diamètre de 4 mm, en fluidifiant le crâne au niveau du bord du volet osseux à l'aide d'un micro-foret. Appliquer la solution saline pendant le forage pour éviter les blessures à la chaleur.
- Élever le volet osseux avec canules et retirez-le en utilisant microforceps.
- Irriguer soigneusement et abondamment avec une solution saline.
- Mélanger la colle dentaire jusqu'à ce qu'il ait la consistance appropriée et n'est pas fluide (ie, la colle ne devrait plus produire des fils). Placez-le sur l'os autour de la craniotomie.
- Placez un couvercle en verre avec un diamètre de 6 mm sur la colle préparée et le fixer avec ee reste de la colle dentaire. Assurez-vous qu'il est étanche à l'eau. Attendez jusqu'à ce que la colle est sèche et dure en la testant avec une pince.
NOTE: Une irrigation supplémentaire accélère le processus de durcissement. - Retirer les sutures tenting et fermer la plaie avec des sutures de la peau.
- Tirez la peau du flanc de la souris. Insérez une voie sous-cutanée de l'aiguille et remplacer doucement 0,5 ml de solution saline sous-cutanée stérile pour l'équilibre des fluides.
- Après la chirurgie, garder les animaux dans la cage de récupération chauffée pendant 90 min. Attendez jusqu'à ce que les animaux sont complètement éveillés avant de les laisser sans surveillance. Attendez jusqu'à ce que les animaux soient complètement récupérés avant de les retourner dans une cage avec d'autres animaux.
- Répéter le remplacement du volume d'une solution saline sous-cutanée au bout d'environ 12 heures, comme décrit à l'étape 1.16.
- Toujours appliquer une analgésie par gavage , soit directement dans la cavité buccale après la chirurgie (par exemple, le paracetamol (10 mg / ml) ou d' autres médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens).
- Vérifier la état des animaux tous les jours après la chirurgie, et toujours fournissent purée aliments pour animaux sur le sol dans une boîte de Pétri pour faire manger simple et d'éviter la perte de poids critique après la chirurgie.
REMARQUE: La microscopie intravitale peut être effectuée dès le premier jour après la préparation de la fenêtre crânienne. - Appliquer isoflurane et fixer l'animal dans un support de tête. Ouvrez la suture de la peau et nettoyer la fenêtre avec des bourgeons de coton et une solution saline stérile. Après 24 heures, la fenêtre crânienne doit être rempli de liquide céphalo-rachidien par ce point de temps, ce qui permet l'imagerie. Effectuer l' imagerie en utilisant des protocoles de microscopie établis 18.
2. Distal MCAo
REMARQUE: La procédure MCAo doit être effectuée environ 5 jours après la préparation CW. Cela minimise les interférences de la réaction immunitaire provoquée par la préparation CW avec la réaction immunitaire induite AVC.
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Figure 1. Vue d'ensemble de Distal MCAo. A. Ceci est une belle vue d' ensemble sur les navires avant l'op. B. Les navires après le premier contact bipolaire. C. Les navires après second contact bipolaire. D. La vue d' ensemble sur les navires, qui sont complètement fermés maintenant. E. aperçu final avec un grossissement inférieur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Anesthésier les souris en utilisant un masque d'anesthésie et un régime anesthésique approprié, en consultation avec le personnel vétérinaire (par exemple, l' induction avec 1,5 à 2% d' isoflurane et de maintenance avec 1,0 à 1,5% d' isoflurane dans 2/3 N 2 O et 1/3 O 2 par l' intermédiaire freezer).
- Rasage et enlever les poils et désinfecter la peau et la fourrure environnante avec un agent approprié (par exemple, l' alcool éthylique à 70%), et sécher ensuite.
- Maintenir la température corporelle des souris à 36,5 ° C ± 0,5 ° C pendant une intervention chirurgicale. Une rétroaction contrôlée coussin chauffant, chauffée selon la température rectale de la souris, est fortement recommandé.
- Placer l'animal dans la position latérale. Fixer le nez dans le masque d'anesthésie et d'ajuster la concentration d'isoflurane de 1.0 - 1,5%.
- Appliquer une pommade humide (dexpanthénol) pour les deux yeux.
- Utilisez l'incision de la peau fait pour la préparation CW.
- Séparez délicatement la peau et identifier le muscle temporal dessous.
- Réglez l'énergie du générateur haute fréquence (5-7 W) et utiliser le mode bipolaire.
- Utilisez la pince électrocoagulation et retirer délicatement le muscle temporal du crâne, la création d'un lambeau musculaire, sans enlever totalement le muscle.
- Identifier le MCA en dessous du crâne transparent dans la partie rostrale de la zone temporelle, dorsale à la rétro-orbital sinus. Si la bifurcation MCA ne peut être identifié, essayez d'identifier le navire le plus rostrale.
- Thin le crâne au-dessus de la branche MCA avec un microfraise tout en irriguant en permanence pour éviter les dommages de la chaleur.
- Soulever l'os avec canules et retirez-le avec microforceps.
- Diminuer l'énergie du générateur haute fréquence à 3-5 W.
- Approchez l'artère au-dessus et en douceur le toucher avec la pince bipolaire des deux côtés sans soulever le navire.
- Coaguler l'artère amont et en aval de la bifurcation du vaisseau.
- Attendre 30 secondes, puis touchez l'artère doucement pour faire en sorte que le flux sanguin est interrompu de façon permanente. Répétez l'électrocoagulation si une recanalisation est observée.
- Fixer le muscle temporal avec 1 ou 2 points de suture à l'insertion des muscles pour couvrir le défaut osseux, si possible.
- Suturer la plaie et placer l'animal dans la zone de récupération chauffée. En général, les animaux de récupération rapidement après anest volatilehesia.
- Pour le remplacement du volume, appliquer de 0,5 ml de solution saline stérile sous-cutanée, tel que décrit à l'étape 1.16.
- Après la chirurgie, permettent aux animaux de rester dans la cage de récupération chauffée pendant 90 min. Attendez jusqu'à ce que les animaux sont conscients avant de les laisser sans surveillance. Seulement les retourner à une cage avec d'autres animaux quand ils sont complètement rétablis.
- Répéter la substitution de volume, comme expliqué à l'étape 1.16, après 12 h.
- Appliquer l' analgésie postopératoire par l' eau potable (par exemple, le paracétamol (10 mg / ml) ou d' autres médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens).
- Vérifiez l'état de santé des animaux tous les jours après la chirurgie. Fournir purée aliments pour animaux dans une boîte de Pétri sur le plancher pour simplifier manger et pour minimiser la perte de poids post-opératoire.
3. Traitement Sham
- Effectuer toutes les procédures identiques aux étapes 1 et 2, décrites CW préparation, sauf ne pas coaguler le ar cérébrale moyenne exposée ci-dessus, y compris-terie.
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Representative Results
Le calendrier et les résultats représentatifs sont présentés dans les figures 2 et 3. La préparation de la fenêtre crânienne, avec une petite fenêtre crânienne latérale du sinus longitudinal supérieur (Figure 2 B, C, D) se traduit par un taux de mortalité et de morbidité très faible lorsqu'elle est effectuée par un chirurgien expérimenté. Tous les 10 animaux ont survécu, et tout CW chronique pourrait être utilisé pour l'imagerie de haute qualité, même 28 jours après la chirurgie. Il n'y avait pas de problème avec les infections de plaies ou d'autres complications.
En raison de l'exposition à court à l'anesthésie volatile et seulement des lésions cérébrales mineures, environ 10 - 15 min après distale MCAo et transfert à la cage de récupération chauffée, tous les animaux étaient éveillés, se déplacer librement dans la cage de récupération, et d'interagir avec la même portée. D'une manière générale, la mortalité du modèle MCAo distal est inférieure à 5%, et se produit à la suite de i vasculaire principalemente préjudice et une hémorragie subséquente au cours de la chirurgie MCAo. La mortalité pendant la période d'observation de 28 jours suivant distale MCAo ne se produit que très rarement. Morphologiquement, la lésion peut être évaluée à l' aide histologie ou IRM (figure 3 A, B). En outre, les mesures IRM offrent la possibilité d'évaluer le volume de la lésion et la progression d'une manière longitudinale. Une IRM réalisée 24 heures après l' ischémie montre clairement la lésion ischémique située sous la CW chronique, alors que suite à une chirurgie factice, aucun tissu cortical lésion n'a été trouvée (figure 3A). Les résultats de l' IRM montrent clairement la limitation stricte de la lésion dans le cortex, le striatum épargnant ainsi, contrairement au modèle MCAo filamenteuse (figure 3B). La préparation CW chronique latérale permet la visualisation à long terme de la vascularisation corticale et microcirculation par epi-microscopie à fluorescence (figure 3C, partie supérieure) et des zones sous - corticales par microscopie à deux photons (Figure 3C, partie inférieure). En outre, il est possible de voies moléculaires d'image et les interactions cellule-cellule avec les cellules marquées par fluorescence ou des mesures de autofluorescence, telles que l'imagerie de fluorescence à vie. Comme cela est représenté sur la figure 3D, le modèle MCAo distal provoque des lésions ischémiques hautement reproductibles. En ce qui concerne le volume de l'infarctus, nous nous attendons à un écart-type inférieur à 15% dans un ensemble unique de chirurgies. Comme indiqué plus haut, contrairement aux modèles de MCAo proximale, les taux de mortalité sont assez faibles pour le modèle 5 distale. Séquentiel utilisant l'IRM, la lésion, le volume et la progression de l'oedème après une ischémie cérébrale focale peut être évaluée. L'IRM à 24 h et 96 h après MCAo distale permanente n'a montré aucune progression significative du T2 hypersignaux.
Figure 2: Préparation de la fenêtre crânienne chronique. (A) timeline représentant. <strong> (B) Marquage de la zone où la craniotomie a lieu, latéral au muscle temporal, en dedans du sinus longitudinal supérieur, et dorsal à bregma. (C) de la surface du cerveau après une craniotomie, avec une couche dure intacte et le verre de protection en place; le cercle montre l'emplacement de la zone ischémique après distale MCAo. (D) Terminé fenêtre chronique crânienne avec couvercle en verre fixe, prêt pour l' imagerie répétitive pendant plusieurs semaines (b = bregma, tm = muscle temporal, SSS = sinus sagittal supérieur, ai = zone d'ischémie). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Combinaison de la chirurgie CW et Distal MCAo ou Sham chronique latérale. (A) L'IRM réalisée 24 heures après shh la chirurgie ne montre aucun tissu cortical lésé. (B) L'IRM réalisée 24 heures après l' ischémie montre clairement la lésion ischémique (*) se trouvant en dessous de la CW chronique. (C) Intravitale epi-imagerie de fluorescence (partie supérieure) et de l' imagerie à deux photons (partie inférieure) de la vascularisation corticale. Volume (D) Infarctus évaluée par IRM à 24 h et 96 h après l' ischémie montre un volume moyen de lésion 13.16 2,3 mm 3 à 24 h et 12,2 1,9 mm 3 à 96 h. Chaque point représente un animal individuel (n = 10 animaux par groupe, moyenne ± SEM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L' AVC est parmi les principales causes d'invalidité à long terme et décès dans le monde 1. Au - delà de traitement aigu, la recherche de nouvelles approches et des mécanismes pour accélérer et améliorer la récupération après un AVC demeure un objectif médical premier 7. les chercheurs de l'AVC expérimentaux utilisent fréquemment des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale focale. En fait, les modèles induisant transitoire ou permanent MCAo imitent l' un des types les plus courants de l' ischémie cérébrale focale chez les patients 4. Outre l' occlusion proximale de la MCA, le modèle de filament pour l' occlusion chirurgicale de la MCAo distale est probablement le modèle le plus fréquemment utilisé dans expérimentale 5,19 de recherche sur les AVC. Ici, nous décrivons la technique de base de MCAo distale permanente combinée avec une CW latérale, offrant la possibilité pour la microscopie intravitale longitudinale chez la souris. Haute reproductibilité du volume de la lésion, ainsi que les taux de mortalité très faible, en particulier en ce qui concerne l'étude des résultats à long terme, are les principaux avantages de ce modèle murin. Dans ce modèle de course corticale, les vaisseaux sanguins dans la zone d'accident vasculaire cérébral et de la région péri-infarctus peuvent être visualisés via le CW chronique. Épifluorescence en utilisant un système multi videomicroscopic fluorescence, la dynamique de la circulation sanguine et le recrutement de cellules circulantes dynamique peut être visualisée. Les vaisseaux sanguins sont visualisés par l'utilisation de macromolécules marquées par fluorescence, comme les dextranes ou de l'albumine. Les cellules peuvent être marquées soit par des colorants fluorescents ou des modèles génétiques, tels que des chimères de moelle osseuse avec des animaux GFP-positives. En outre, pour étudier les interactions cellule-cellule et la dynamique des cellules extravasculaires, un à deux photons à balayage laser confocal microscope peut être appliqué. Imagerie jusqu'à 250 um en dessous de la surface corticale peut être effectuée. Encore une fois, les vaisseaux sanguins sont colorés en utilisant des macromolécules marquées par fluorescence, et les cellules sont marquées génétiquement (par exemple, à l'aide de la souris transgénique nestine-GFP).
La fenêtre crâniennela chirurgie est réalisée par l'intermédiaire d'une craniotomie sans ouvrir la dure-mère. Un écueil majeur est de blesser accidentellement la couche dural et le cortex sous lors de l'ouverture du crâne avec le microfraise. Par conséquent, cette technique exige une certaine habileté technique afin d'éviter des dommages à la dure et le cortex, ce qui induit une réaction et influences microscopie résultats immunitaires. En variante, un modèle de crâne amincie potentiel est limité par la qualité moins fiable en raison du crâne reste de la microscopie, en particulier à long terme. Fréquemment, répétitif crâne éclaircissage est nécessaire, alors que dans le modèle CW, la qualité de la fenêtre dure depuis plusieurs mois, jusqu'à ce que la repousse du crâne ou des influences d'épaississement dural imagerie qualité 14,20. Une modulation de ce modèle avec une préparation-crâne amincie serait possible. La couche dural doit être laissé sur le cerveau afin d'éviter toute blessure ou excitation du cortex. Seulement si une application directe à la zone ischémique est souhaitée dans un modèle expérimental de la dure peut être redéplacé, soigneusement et sans blesser des veines de pontage.
Contrairement aux modèles combinant une CW et induisant l' occlusion du vaisseau ciblé par irradiation de photosensibilisants en circulation, conduisant à des seules de très petites lésions ischémiques, les distaux MCAO modèle imite la majorité des accidents vasculaires cérébraux humains qui sont situés sur le territoire MCA 13 cortical. Pour éviter toute interférence avec une réaction inflammatoire transitoire due à la préparation CW, la fenêtre doit être préparé plusieurs jours avant la chirurgie MCAo distale.
Un certain nombre de tests pour évaluer les aspects fonctionnels, ainsi que du comportement chez les rongeurs sont disponibles (par exemple, analyse de la marche, test Rotarod, test du poteau, test de retrait adhésif, test de l' escalier, essai sur le terrain ouvert et labyrinthe aquatique de Morris) 21. Dans tous ces tests, les souris soumises à MCAo effectuent moins de succès que les animaux de contrôle par rapport aux résultats à court terme et à moyen terme. Toutefois, en ce qui concerne l'évaluation desrésultats à long terme, il faut reconnaître que la sensibilité des tests fonctionnels est très limitée en termes de distal MCAo, ainsi que légère proximale MCAo 19,21-23.
Distal MCAo, réalisée par des chirurgiens bien formés, peut être induite en moins de 20 min et peut produire des lésions ischémiques hautement reproductibles. Cependant, la reproductibilité nécessite un contrôle approfondi des facteurs confondants. Les différences dans la technique chirurgicale peuvent conduire à des différences dans la taille de l' infarctus 24. Différentes souches de souris pourraient montrer un résultat différent de la course en raison de variations de l'anatomie vasculaire cérébral entre les souches. En outre, comme la température du corps affecte une lésion neuronale et la sensibilité à l' ischémie, à l' hypothermie conduisant à des lésions et hyperthermie plus petits à des déficits plus sévères 25,26, le contrôle de la température et de la maintenance sont hautement pertinentes dans ce modèle, ainsi que dans d' autres modèles d'ischémie 27. En général, les paramètres physiologiques tels que le sang PRESSUre et le sang des gaz, sont des facteurs de confusion importants de résultats et doivent être contrôlés pour 28. En outre, le choix de l'anesthésique est très important, car certains agents peuvent exercer des effets neuroprotecteurs directs ou agir indirectement via les propriétés vasoactives 29. Par conséquent, l'exposition à une anesthésie doit être standardisée et maintenue aussi courte que possible. Enfin, les conditions de logement, comme l'utilisation de l' enrichissement, peuvent affecter les résultats AVC ainsi, et doivent donc être normalisé et décrit dans la recherche des rapports 30. Pour produire des résultats précliniques pertinents pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques, la normalisation, le contrôle de la qualité, et les rapports sont de la plus haute importance 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | Kopf | Model 930 | |
| Anaethesia system for isoflurane | Draeger | ||
| Isoflurane | Abott | ||
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Bipolar Forceps | Erbe | 20195-501 | |
| Bipolar Forceps | Erbe 20195-022 | ||
| Microdrill | FST 18000-17 | ||
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 |
References
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