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Neuroscience

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva Published: December 29, 2016 doi: 10.3791/54701

Summary

l'occlusione chirurgica di un ramo distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello di uso frequente nella ricerca ictus sperimentale. Questo manoscritto descrive la tecnica base di MCAO permanente, combinata con l'inserimento di una finestra cranica laterale, che offre la possibilità di longitudinale microscopia intravitale nei topi.

Abstract

Ischemia cerebrale focale (cioè, ictus ischemico) può causare gravi lesioni cerebrali, portando ad una grave perdita della funzione neuronale e di conseguenza ad una serie di motore e disabilità cognitive. La sua alta prevalenza pone un grave onere di salute, come l'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo 1. Recupero della funzione neuronale è, nella maggior parte dei casi, solo parziale. Finora, le opzioni di trattamento sono molto limitate, in particolare a causa della finestra temporale ristretta per la trombolisi 2,3. Che determina i metodi per accelerare il recupero da ictus rimane un obiettivo medico prime; tuttavia, questo è stato ostacolato dalla insufficienti intuizioni meccanicistici nel processo di recupero. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Al di là della fase acuta, la ricerca corsa è sempre più focalizzata sulla fase sub-acuta e cronica dopo ischemia cerebrale. applicare la maggior parte dei ricercatori ictus permanente o tranl'occlusione sient del MCA nei topi o ratti. Nei pazienti, occlusioni di MCA sono tra le più frequenti cause di ictus ischemico 4. Oltre l'occlusione prossimale del MCA utilizzando il modello filamento, l'occlusione chirurgica del distale MCA è probabilmente il modello più utilizzato nella ricerca ictus sperimentale 5. L'occlusione di un distale (la ramificazione delle arterie lenticulo-striate) ramo MCA risparmia tipicamente striato e colpisce soprattutto la neocorteccia. Vessel l'occlusione può essere permanente o transitorio. Alta ripetibilità volume lesione e mortalità molto bassi rispetto al risultato a lungo termine sono i principali vantaggi di questo modello. Qui, dimostriamo come eseguire una cronica finestra del cranio (CW) la preparazione lateralmente al seno sagittale, e poi come chirurgicamente indurre un ictus distale sotto la finestra utilizzando un approccio craniotomia. Questo approccio può essere applicato per l'imaging sequenziale di alterazioni acute e croniche seguente ischemia viaepi-illuminante, confocale a scansione laser, e due fotoni microscopia intravitale.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania (G0298 / 13) ei criteri arrivano, a seconda dei casi. Per questo studio, 10 a 12 settimane di età maschi C57Bl / 6J sono stati utilizzati.

1. laterale cronica cranica finestra Preparazione

  1. Eseguire anestesia con una iniezione sottocutanea di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Test per la sedazione adeguata con uno stimolo dolore.
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e campo chirurgico con il 70% di etanolo.
  3. Rimuovere il cuoio capelluto dal collo agli occhi con un rasoio roditore.
  4. Fissare la testa in un frame stereotassico.
  5. Utilizzare Dexpantenolo pomata occhio su entrambi gli occhi per evitare la disidratazione.
  6. Pulire l'area chirurgica per rimuovere tutti i peli e sterilizzare con 3 strati di 74,1% di etanolo e 10% 2-propanololo.
  7. Eseguire un linea medianaincisione dal collo agli occhi utilizzando un bisturi.
  8. Coprono l'lembo cutaneo con 4 punti di sutura in tenda.
  9. Rimuovere il periostio attentamente l'emisfero sinistro raschiando via con un bisturi al punto in cui inizia il muscolo temporale.
    NOTA: Questa preparazione serve anche per creare una buona zona adesione per la colla dentale, che fissa il vetro di copertura.
  10. Eseguire una craniotomia fronto-parietale con un diametro di 4 mm da diradamento cranio sul bordo del lembo osseo utilizzando un microtrapano. Applicare la soluzione salina durante la perforazione per evitare lesioni di calore.
  11. Elevare il lembo osseo con cannule e rimuoverlo con microforceps.
  12. Irrigare accuratamente e ampiamente con soluzione fisiologica.
  13. Mescolare la colla dentale fino ha la consistenza adeguata e non è fluido (cioè, la colla deve produrre fili più). Posizionarlo sul tessuto osseo intorno alla craniotomia.
  14. Posizionare un vetro di copertura con un diametro di 6 mm sulla colla preparata e fissarlo con the resto della colla dentale. Assicurarsi che sia a tenuta stagna. Attendere che la colla viene essiccato e duro provandola con una pinza.
    NOTA: L'irrigazione ulteriore accelera il processo di polimerizzazione.
  15. Rimuovere i punti di sutura in tenda e chiudere la ferita con punti di sutura della pelle.
  16. Tirare la pelle del fianco del mouse. Inserire una via sottocutanea ago e sostituire delicatamente 0,5 ml di sterile per via sottocutanea salina per l'equilibrio dei fluidi.
  17. Dopo l'intervento chirurgico, tenere gli animali in gabbia recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono completamente sveglio prima di lasciare incustoditi. Attendere fino a quando gli animali sono completamente recuperati prima di tornare in una gabbia con altri animali.
  18. Ripetere la sostituzione del volume di soluzione salina per via sottocutanea dopo circa 12 ore, come descritto al punto 1.16.
  19. Sempre applicare analgesia mediante sonda gastrica o direttamente nella cavità orale dopo l'intervento (ad esempio, paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
  20. Controlla il condizioni degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico, e sempre forniscono schiacciate cibo animale sul pavimento in una piastra di Petri per fare mangiare semplice e per evitare la perdita di peso dopo l'intervento critico.
    NOTA: microscopia intravitale può essere effettuata sul primo giorno dopo la preparazione finestra del cranio.
  21. Applicare isoflurano anestesia e fissare l'animale in un supporto testa. Aprire la sutura della pelle e pulire la finestra con bastoncini di cotone e soluzione salina sterile. Dopo 24 ore, la finestra del cranio deve essere riempito con liquido cerebrospinale da quel punto di tempo, che permette l'imaging. Eseguire l'imaging utilizzando protocolli di microscopia stabiliti 18.

2. distale MCAO

NOTA: La procedura MCAO deve essere eseguita su 5 d dopo la preparazione CW. Ciò minimizza l'interferenza dalla reazione immunitaria causata dalla preparazione CW con la reazione immunitaria ictus indotta.

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Figura 1. Panoramica distale MCAO. R. Questa è una bella panoramica sui vasi prima della op. B. I vasi dopo il primo contatto bipolare. C. I vasi dopo secondo contatto bipolare. D. La panoramica sui vasi, che sono completamente chiuse oggi. E. panoramica finale con ingrandimento minore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Anestetizzare il topo, utilizzando una maschera di anestesia e un regime anestetico adeguato, in consultazione con il personale veterinario (ad esempio, induzione con 1,5-2% isoflurano e manutenzione con 1,0-1,5% isoflurano in 2/3 N 2 O e 1/3 O 2 via un vaporizzatore).
  2. Shave e rimuovere i capelli e disinfettare la pelle e pelliccia circostante con un agente appropriato (ad esempio, il 70% di alcol etilico), e asciugare dopo.
  3. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante l'intervento chirurgico. Una piastra elettrica risposte controllato, riscaldato secondo la temperatura rettale del mouse, è altamente raccomandato.
  4. Posto l'animale in posizione laterale. Fissare il naso nella maschera anestesia e regolare la concentrazione isoflurano a 1,0 - 1,5%.
  5. Applicare una pomata bagnato (Dexpantenolo) per entrambi gli occhi.
  6. Utilizzare l'incisione cutanea fatta per la preparazione CW.
  7. Delicatamente separare la pelle e identificare il muscolo temporale sottostante.
  8. Regolare l'energia del generatore ad alta frequenza (5 - 7 W) e usare la modalità bipolare.
  9. Utilizzare le pinze elettrocoagulazione e rimuovere con attenzione il muscolo temporale dal cranio, la creazione di un lembo di muscolo, senza rimuovere completamente il muscolo.
  10. Identificare la MCA sotto il cranio trasparente nella parte rostrale della zona temporale, dorsale per la retro-orbital seno. Se la biforcazione MCA non può essere identificato, cercare di identificare la nave più rostrale.
  11. Sottile il teschio sopra il ramo MCA con un microtrapano mentre continua irrigazione per evitare danni dovuti al calore.
  12. Sollevare l'osso con cannule e rimuoverlo con microforceps.
  13. Diminuire l'energia del generatore ad alta frequenza 3 - 5 W.
  14. Avvicinatevi l'arteria dall'alto e toccare delicatamente con le pinze bipolari su entrambi i lati senza sollevare la nave.
  15. Coagulare dell'arteria prossimale e distale alla biforcazione nave.
  16. Attendere 30 sec, quindi toccare delicatamente l'arteria per garantire che il flusso di sangue è permanentemente interrotta. Ripetere l'elettrocoagulazione, se si osserva una ricanalizzazione.
  17. Fissare il muscolo temporale di 1 o 2 punti all'inserzione muscolare per coprire il difetto osseo, se possibile.
  18. Suturare la ferita e posizionare l'animale nella casella di recupero riscaldato. In generale, il recupero animali subito dopo Anest volatilihesia.
  19. Per la sostituzione del volume, applicano 0,5 ml di soluzione sterile salina per via sottocutanea, come descritto al punto 1.16.
  20. Dopo l'intervento chirurgico, consentono agli animali di rimanere nella gabbia di recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono coscienti prima di lasciare incustoditi. restituirli solo a una gabbia con altri animali quando sono completamente recuperati.
  21. Ripetere la sostituzione del volume, come spiegato al punto 1.16, dopo 12 ore.
  22. Applicare l'analgesia postoperatoria con acqua potabile (ad esempio, il paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
  23. Controllare la condizione medica degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico. Fornire cibo animale schiacciato in una piastra di Petri sul pavimento per semplificare mangiare e per ridurre al minimo la perdita di peso post-operatorio.

3. Trattamento Sham

  1. Eseguire tutte le procedure in modo identico ai punti 1 e 2, sopra descritti, tra cui la preparazione CW, tranne non coagulare il ar cerebrale media espostobatteria.

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Representative Results

La linea temporale e risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure 2 e 3. La preparazione finestra del cranio, con una piccola finestra laterale cranica al seno longitudinale superiore (Figura 2 B, C, D) comporta un basso tasso di mortalità e morbilità quando eseguita da un chirurgo esperto. Tutti i 10 animali sopravvissuti, e tutto CW cronico potrebbe essere utilizzato per l'imaging di alta qualità, anche 28 giorni dopo l'intervento. Non c'era alcun problema con infezioni della ferita o altre complicazioni.

A causa della breve esposizione all'anestesia volatile e solo danni cerebrali minori, circa 10 - 15 minuti dopo distale MCAO e trasferimento alla gabbia di recupero riscaldato, tutti gli animali erano svegli, muoversi liberamente nella gabbia di recupero, e l'interazione con fratellini. In generale, la mortalità del modello MCAO distale è inferiore al 5% e soprattutto si verifica a causa di i vascolarenjury e conseguente emorragia durante l'intervento chirurgico MCAO. La mortalità durante il periodo di osservazione di 28 giorni dopo distale MCAO avviene molto raramente. Morfologicamente, la lesione può essere valutata mediante esame istologico o RM (Figura 3 A, B). Inoltre, le misurazioni MRI offrono l'opportunità di valutare il volume della lesione e la progressione in modo longitudinale. Una risonanza magnetica eseguita 24 ore dopo l'ischemia descrive chiaramente la lesione ischemica situato sotto il CW cronica, mentre dopo l'intervento sham, nessun tessuto corticale leso è stata trovata (Figura 3A). I risultati MRI mostrano chiaramente la rigorosa limitazione della lesione alla corteccia, risparmiando così striato, in contrasto con il modello MCAO filamentosa (Figura 3B). La preparazione CW cronica laterale permette la visualizzazione a lungo termine della vascolarizzazione corticale e microcircolazione epi-microscopio a fluorescenza (Figura 3C, parte superiore) e di aree sottocorticali mediante microscopia a due fotoni (Figuri 3C, parte bassa). Inoltre, è possibile vie molecolari di immagine e cellula-cellula interazioni con cellule fluorescenza marcato o misurazioni di autofluorescenza, come l'imaging di fluorescenza vita. Come mostrato nella figura 3D, il modello MCAO distale provoca lesioni ischemiche altamente riproducibili. Per quanto riguarda il volume dell'infarto, ci aspettiamo una deviazione standard al di sotto del 15% in un unico insieme di interventi chirurgici. Come accennato in precedenza, in contrasto con i modelli di prossimale MCAO, i tassi di mortalità sono piuttosto bassi per il modello distale 5. Utilizzando la risonanza magnetica sequenziale, lesioni, il volume e la progressione dell'edema dopo ischemia cerebrale focale può essere valutata. La risonanza magnetica a 24 ore e 96 ore dopo permanente distale MCAO non ha mostrato alcuna progressione significativa del T2 iperintensità.

figura 2
Figura 2: cronica cranica Preparazione finestra. (A) cronologia rappresentante. <strong> (B) Marcatura l'area in cui la craniotomia avviene, lateralmente al muscolo temporale, mediale al seno sagittale superiore, e dorsale di bregma. (C) della superficie del cervello dopo una craniotomia, con uno strato dura intatto e il vetro di copertura in posizione; il cerchio mostra la posizione dell'area ischemica dopo distale MCAO. (D) Finito finestra del cranio cronico con vetro rivestimento fisso, pronto per l'imaging ripetitivo per diverse settimane (b = bregma, tm = muscolo temporale, SSS = seno sagittale superiore, ai = zona di ischemia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Combinazione del laterale cronica CW e distale MCAO o Sham Chirurgia. (A) La risonanza magnetica eseguita 24 ore dopo sham chirurgia non mostra alcun tessuto corticale leso. (B) La RM eseguita 24 ore dopo ischemia illustrano chiaramente la lesione ischemica (*) situato sotto il CW cronica. Imaging (C) intravitale epi-fluorescenza (parte alta) e l'imaging a due fotoni (parte bassa) della vascolarizzazione corticale. Il volume (D) Infarct valutata mediante risonanza magnetica a 24 ore e 96 ore dopo l'ischemia mostra un volume medio di lesioni 13.16 2,3 millimetri 3 a 24 ore e il 12,2 1,9 millimetri 3 a 96 ore. Ogni punto rappresenta un singolo animale (n = 10 animali per gruppo, media ± SEM). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo 1. Al di là di trattamento acuto, indagare nuovi approcci e meccanismi per accelerare e migliorare il recupero dopo l'ictus rimane un obiettivo medica primaria 7. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Infatti, modelli inducono transitoria o permanente MCAO imitano uno dei tipi più comuni di ischemia cerebrale focale in pazienti 4. Oltre l'occlusione prossimale del MCA, il modello filamento per l'occlusione chirurgica della distale MCAO è probabilmente il modello più utilizzato nella sperimentazione 5,19 ricerche ictus. Qui, descriviamo la tecnica di base della permanente distale MCAO combinato con un CW laterali, offrendo l'opportunità di longitudinale microscopia intravitale nei topi. Alta riproducibilità di volume della lesione, così come i tassi di mortalità molto basse, in particolare per quanto riguarda lo studio risultati a lungo termine, arall'e i principali vantaggi di questo modello murino. In questo modello ictus corticale, i vasi sanguigni nella zona ictus e regione peri-infartuale possono essere visualizzati tramite il CW cronica. Utilizzando un sistema di epifluorescenza videomicroscopic multi-fluorescenza, la dinamica del flusso sanguigno e il reclutamento dinamica di cellule circolanti possono essere visualizzati. I vasi sanguigni sono visualizzati attraverso l'uso di macromolecole fluorescente, come destrani o l'albumina. Le celle possono essere etichettati o con coloranti fluorescenti o dai modelli genetici, come chimere del midollo osseo con gli animali GFP-positive. Inoltre, per studiare le interazioni cellula-cellula e le dinamiche di cellule extravascolare, a due fotoni scansione laser confocale microscopio può essere applicata. Imaging fino a 250 micron sotto la superficie corticale può essere eseguita. Anche in questo caso, i vasi sanguigni sono macchiati con macromolecole fluorescente, e le cellule sono etichettati geneticamente (ad esempio, utilizzando il mouse GFP-Nestin transgenici).

La finestra del craniointervento viene eseguito attraverso una craniotomia senza aprire la dura. Un trabocchetto principale è quello di danneggiare accidentalmente lo strato durale e la corteccia sotto quando si apre il cranio con il microtrapano. Pertanto, questa tecnica richiede una certa abilità tecnica per evitare danni alla dura e la corteccia, che induce un immunitarie risultati reazione e influenze microscopia. In alternativa, un potenziale modello assottigliato-cranio è limitato dalla qualità microscopia meno affidabile a causa del cranio rimanente, soprattutto nel lungo termine. Spesso, ripetitivo cranio diradamento è necessario, mentre nel modello CW, la qualità della finestra si protrae per diversi mesi, fino a quando la ricrescita cranio o influenze ispessimento durale di imaging di qualità 14,20. Una modulazione di questo modello con una preparazione assottigliato-teschio sarebbe possibile. Lo strato durale deve essere lasciato sul cervello per evitare eventuali lesioni o di eccitazione della corteccia. Solo se una diretta applicazione alla zona ischemica è desiderato in un modello sperimentale può la dura essere rispostato, con attenzione e senza ferire eventuali vene ponte.

In contrasto con i modelli combinano un CW e inducendo occlusione di vasi mirato tramite irradiazione di fotosensibilizzatori circolanti, portando a solo piccole lesioni ischemiche, i distali MCAO modello imita la maggioranza di tratti umani che si trovano nel territorio MCA corticale 13. Per evitare interferenze con una reazione infiammatoria transitoria dovuta alla preparazione CW, la finestra deve essere preparato diversi giorni prima dell'intervento MCAO distale.

Un certo numero di test per valutare aspetti funzionali oltre che comportamentali nei roditori sono disponibili (ad esempio, analisi del cammino, prova rotarod, prova di polo, test di rimozione adesivo, test della scala, test a campo aperto, e il labirinto d'acqua di Morris) 21. In tutti questi test, i topi sottoposti a MCAO eseguire meno successo rispetto agli animali di controllo rispetto ai risultati a breve e medio termine. Tuttavia, per quanto riguarda la valutazione dellarisultati a lungo termine, si deve riconoscere che la sensibilità del test funzionale è molto limitata in termini di distale MCAO, così come lieve prossimale MCAO 19,21-23.

Distale MCAO, eseguita da chirurghi ben addestrati, può essere indotta in meno di 20 minuti e può produrre lesioni ischemiche altamente riproducibili. Tuttavia, la riproducibilità richiede un controllo accurato dei fattori confondenti. Le differenze di tecnica chirurgica può portare a differenze nella dimensione dell'infarto 24. Diversi ceppi di topo possono mostrare un risultato diverso ictus a causa di variazioni di anatomia vascolare cerebrale tra i ceppi. Inoltre, come temperatura corporea influenza danno neuronale e suscettibilità alla ischemia, ipotermia con lesioni più piccole e ipertermia a più gravi deficit 25,26, controllo di temperatura e di manutenzione sono molto importanti in questo modello, così come in altri modelli di ischemia 27. In generale, i parametri fisiologici, come pressio sanguere e dei gas del sangue, sono importanti fattori confondenti di risultati e devono essere controllate per il 28. Inoltre, la scelta dell'anestetico è molto importante, in quanto alcuni agenti possono esercitare effetti neuroprotettivi diretti o agire indirettamente tramite le proprietà vasoattive 29. Pertanto, l'esposizione all'anestesia dovrebbe essere standardizzato e mantenuto il più breve possibile. Infine, le condizioni abitative, come l'uso di arricchimento, possono influenzare il risultato della corsa così, e, quindi, dovrebbero essere standardizzati e descritto in Rapporti di ricerca 30. Per produrre risultati preclinici rilevanti per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici, la standardizzazione, il controllo di qualità, e la segnalazione sono della massima importanza 31.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe FST 21061-10
Stereotactic frame Kopf Model 930
Anaethesia system for isoflurane Draeger
Isoflurane Abott
Dumont forceps #5 FST 11251-10
Dumont forceps #7 FST 11271-30
Bipolar Forceps Erbe 20195-501
Bipolar Forceps  Erbe                              20195-022
Microdrill FST                              18000-17         
Needle holder FST 12010-14
5-0 silk suture Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber Peco Services V1200

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References

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Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä,More

Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä, M., Broggini, T., Vajkoczy, P., Prinz, V. Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (118), e54701, doi:10.3791/54701 (2016).

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