Summary
말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.
Abstract
초점 대뇌 허혈 (즉, 허혈성 뇌졸중)은 신경 기능의 심각한 손실을 결과적으로 모터 및인지 장애의 호스트로 이어지는 주요 뇌 손상의 원인이 될 수 있습니다. 스트로크 1 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다으로 높은 유병률은, 심각한 건강 부담을 포즈. 신경 기능의 회복은, 대부분의 경우, 단지 부분이다. 지금까지 치료 옵션은 매우 인해 혈전 용해 2,3의 좁은 시간 창에 특히 제한됩니다. 뇌졸중에서 회복을 가속화하는 방법을 결정하는 주요 의료 목표 남아있다; 그러나, 이는 복구 프로세스에 충분한 기계적 통계에 의해 방해되어왔다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 급성기를 넘어, 뇌졸중 연구는 점점 뇌허혈 다음 서브 급성 및 만성 단계에 초점을 맞추고 있습니다. 대부분의 행정 연구원이 적용 영구 또는 트란마우스 또는 쥐의 MCA의 지어서 transient 폐색. 환자에서 MCA 폐색의 허혈성 뇌졸중 (4)의 가장 흔한 원인들이다. 필라멘트 모델을 사용하여, MCA 폐색의 근위 외에 원위 MCA 폐색 수술 실험 스트로크 연구 5에서 가장 자주 사용되는 모델은 아마도. MCA 분기합니다 (lenticulo - 선조체 동맥의 분지에) 원위의 폐색은 일반적으로 선조체 여분 주로 신피질에 영향을 미친다. 혈관 폐색은 영구적 또는 일시적 일 수있다. 장기적인 결과에 대해 병소 용적과 매우 낮은 사망률의 재현성이 모델의 주요 이점이다. 여기, 우리는 시상 동에 만성 두개골 창 (CW) 준비 측면을 수행하고, 이후에 어떻게 개두술 방법을 사용하여 창 아래에 말단 행정을 유도 외과 적 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법을 통해 허혈성 급성 및 만성 변화 순차 촬상 적용될 수있다, 공 초점 레이저 스캐닝 및 이광자 현미경 생체 내에 에피 - 조명.
Protocol
윤리 선언문 : 동물 과목을 포함하는 실험은 적용 가능한 Landesamt FUER 아퍼 싶게 Soziales, 베를린, 독일 (G0298 / 13) 및 도착 도착 기준에 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 12 주령의 수컷 C57BL / 6J 마우스에 대한 연구, 10을 사용 하였다.
1. 측면 만성 두개골 창 준비
- 케타민 (90 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (/ kg 10 mg)의 피하 주사로 마취를 수행합니다. 통증 자극에 적절한 진정 작용에 대한 시험.
- 70 % 에탄올로 수술 도구와 수술 부위를 소독.
- 설치류 면도기를 사용하여 눈에 목 두피 머리를 제거합니다.
- 정위 프레임에 머리를 고정합니다.
- 탈수를 방지하기 위해 두 눈에 dexpanthenol 눈 연고를 사용합니다.
- 모든 머리카락을 제거하고 74.1 %의 에탄올의 3 층과 10 % 2 프로프라놀롤로 소독 할 수있는 외과 영역을 청소합니다.
- 중간 선을 수행합니다메스를 사용하여 눈 목 절개.
- 4 텐팅 (tenting) 봉합으로 피부 플랩에 걸쳐.
- 시간적 근육이 시작되는 지점에 메스를 긁어하여 왼쪽 반구에 조심스럽게 골막을 제거합니다.
주 :이 제제는 상기 커버 유리를 해결 치과 용 접착제에 대한 양호한 접착 성 영역을 생성하는 역할을한다. - microdrill를 사용하여 뼈 플랩의 가장자리에 두개골을 얇게하여 4mm의 직경 전두 - 두정엽의 개두술을 수행합니다. 열 손상을 방지하기 위해 시추하는 동안 생리 식염수를 적용합니다.
- 캐 뉼러에 뼈 플랩을 올리고 microforceps를 사용하여 제거합니다.
- 식염수로 조심스럽게 광범위하게 관개.
- 이 적절한 농도를 갖는 유체 아니다까지 치과 용 접착제를 혼합 (즉, 접착제가 더 이상 스레드를 생성 안된다). 개두술 주위의 뼈에 놓습니다.
- 제조 된 접착제에 6 mm 직경 커버 글라스를 놓고 번째로 해결치과 용 접착제의 전자 휴식. 이 방수 있는지 확인합니다. 접착제가 집게로 검사하여 하드 건조하고 될 때까지 기다립니다.
주 : 추가 관개는 경화 과정을 가속화합니다. - 텐팅 (tenting)의 봉합사를 제거하고 피부 봉합에 상처를 닫습니다.
- 마우스의 측면의 피부를 당겨. 바늘 피하에 삽입하고 부드럽게 유체 균형을 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml를 대체합니다.
- 수술 후, 90 분 동안 가열 복구 케이지에 동물을 유지합니다. 동물 무인을 떠나기 전에 완전히 깨어 때까지 기다립니다. 동물이 완전히 다른 동물 케이지에게 반환하기 전에 복구 될 때까지 기다립니다.
- 단계 1.16에 기술 된 바와 같이, 약 12 시간 후에 피하 식염수 볼륨 교체 반복한다.
- 항상 수술 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제) 후 구강으로 삽입 위관을 통해 직접 진통제를 적용한다.
- 확인 매일 수술 후 동물의 상태, 항상은 페트리 접시 간단한 식사를 만들 및 수술 후 중요한 체중 감소를 방지하기 위해 바닥에 동물 음식을 으깬 제공합니다.
주 : 생체 내에 현미경 두개 창이 제조 후 첫 날에 수행 될 수있다. - 이소 플루 란 마취를 적용하고 헤드 홀더에 동물을 고정합니다. 피부 봉합을 열고 면봉과 멸균 식염수 창을 청소합니다. 24 시간 후, 두개골 창이 영상을 가능하게 그 시점에 의해 뇌척수액으로 가득해야합니다. 설립 현미경 프로토콜 18을 사용하여 이미지를 수행합니다.
2. 말초 MCAO
참고 : MCAO 절차는 CW 준비 후 약 5 D를 수행해야합니다. 이는 뇌졸중 유도 면역 반응과 CW 제제에 의한 면역 반응의 간섭을 최소화한다.
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원위 MCAO 1. 개요도. A.이 연산 전에 선박에 대한 좋은 개요입니다. 첫 번째 바이폴라 접촉 후 B에 선박. 두 번째 바이폴라 접촉 후 C를 혈관. D. 완전히 지금은 폐쇄 된 선박에 대한 개요. 낮은 배율 E. 최종 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 수의학 직원 (과 협의에 마취 마스크와 적절한 마취 정권을 사용하여 마우스를 마취 예를 들어, 1.5 유도 - 2/3 N 2 O 1/3 O 2 1.5 % 이소 플루 란을 통해 - 2 % 이소 플루 란과 1.0 유지 보수 기화기).
- (면도하고 머리를 제거하고 적절한 에이전트로 피부와 주변 모피 소독예를 들면, 70 % 에틸 알코올), 그 후이를 건조.
- 36.5 ℃에서 쥐의 체온을 유지 수술 중에 0.5 ° C, ±. 마우스의 직장 온도에 따라 가열 피드백 제어 가열 패드는 매우 좋습니다.
- 측면 위치에 동물을 배치합니다. 마취 마스크의 코를 수정하고 1.0에 이소 플루 란 농도를 조정 - 1.5 %.
- 두 눈에 젖은 연고 (dexpanthenol)를 적용합니다.
- CW 준비를 위해 만든 피부 절개를 사용합니다.
- 부드럽게 피부를 분리하고 아래 시간 근육을 식별합니다.
- 고주파 발전기의 에너지 조절 (5-7 W)를 바이폴라 모드를 사용한다.
- electrocoagulation 집게를 사용하여 조심스럽게 완전히 근육을 제거하지 않고, 근육 플랩을 만드는 두개골에서 시간적 근육을 제거합니다.
- , 시간 영역의 주동이의 부분에 투명 두개골 아래 MCA를 확인 레트로 ORBITA에 지느러미리터의 동. MCA 분기점을 식별 할 수없는 경우, 용기가 가장 입쪽 식별하려고.
- 지속적으로 열 손상을 방지하기 위해 관개 동안 microdrill와 MCA 분기 위에 얇은 두개골.
- 캐 뉼러에 뼈를 들어 올려 microforceps으로 제거합니다.
- W. 5 - (3)에 고주파 발전기의 에너지를 감소
- 위에서 동맥에 접근 조심스럽게 용기를 해제하지 않고 양쪽에 바이폴라 집게으로 만지지.
- 용기 분기점에 근위 및 원위 혈관 응고.
- 30 초 동안 기다린 후 혈액의 흐름이 영구적으로 중단되도록 부드럽게 동맥을 터치합니다. 개통이 관찰되는 경우 electrocoagulation를 반복합니다.
- 가능하면, 뼈의 결함을 커버하는 근육에 삽입 한 2 바늘 시간적 근육 수정.
- 상처를 봉합하고, 가열 회수 상자에 동물을 배치합니다. 빨리 휘발성 ANEST 후 일반적으로, 동물 복구hesia.
- 단계 1.16의 설명에 따라 볼륨 대체를 들어, 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml에 적용됩니다.
- 수술 후, 동물은 90 분 동안 가열 복구 케이지에 체류 할 수 있습니다. 동물 무인을 떠나기 전에 의식이 될 때까지 기다립니다. 그들이 완전히 회복되는 경우에만 다른 동물과 케이지로 돌아갑니다.
- 12 시간 후, 단계 1.16에 설명 된대로 볼륨 대체를 반복합니다.
- 마시는 물 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제)를 통해 수술 후 통증을 적용한다.
- 수술 후 매일 동물의 건강 상태를 확인합니다. 식사를 단순화하고 수술 후 체중 감소를 최소화하기 위해 바닥에 페트리 접시에 으깬 동물 음식을 제공합니다.
3. 위장 치료
- 위 포함한 CW가 노출 된 중간 대뇌 아칸소 응고하지 않는 준비을 제외한 설명 된 1 단계와 2 단계로 동일하게 모든 절차를 수행tery.
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Representative Results
타임 라인 대표적인 결과는도 2 및도 3에 도시되어있다. 우수한 시상 동 (도 2 B, C, D) 숙련 된 의사에 의해 수행되는 매우 낮은 사망률과 질병률 레이트 결과 작은 두개 창 폭과 뇌 창 제제. 10 동물 모두 생존, 모든 만성 CW도 이십팔일 수술 후 고품질의 화상을 위해 사용될 수있다. 상처 감염 또는 다른 합병증 문제는 없었다.
때문에 휘발성 마취 만 작은 뇌 손상, 약 10 짧은 노출 - (15) 원위 MCAO 후 분, 가열 복구 케이지로 전송, 모든 동물은 자유롭게 복구 케이지 이동하고, 한배 새끼와 상호 작용, 깨어 있었다. 일반적으로, 말단 MCAO 모델의 치사율은 5 % 이하이며, 주로 혈관 I의 결과로서 발생njury 및 MCAO 수술시 이후의 출혈. 원위 MCAO 다음 28 일의 관찰 기간 중 사망은 매우 드물게 발생. 형태 학적으로 병변은 조직학 또는 MRI (도 3 A, B)을 사용하여 평가 될 수있다. 또한, MRI 측정 길이 방식 병소 용적과 진행을 평가하는 기회를 제공한다. 허혈는 누가 뭐라고해도 만성 CW 아래에있는 허혈성 병변을 묘사 한 후 MRI는 가짜 수술을 다음과 같은 동안, 어떤 병변 대뇌 피질의 조직 (그림 3A)를 찾을 수 없습니다, 24 시간을 수행 하였다. 자기 공명 영상 결과가 명확하므로 사상 MCAO 모델 (도 3b)는 대조적으로, 선조체 살려주는 피질 병변의 엄격한 제한을 나타낸다. 좌우 만성 CW 준비 Figu (에피 형광 현미경 (도 3c, 상부)에 의해 이광자 현미경 피질 영역 피질 혈관 및 미세 장기 시각화있게3C, 하부)을 재. 또한, 이러한 형광 수명 이미징과 같은 형광 표지 된 세포 또는 형광도 측정과 이미지 경로 분자 및 세포 간 상호 작용을 할 수있다. 도 3d에 도시 된 바와 같이, 원위 MCAO 모델 재현성 허혈성 병소가 발생. 경색 용적에 대하여, 우리는 수술 한 세트의 15 % 미만의 표준 편차를 기대한다. 전술 한 바와 같이, 기단부 MCAO 모델 달리 사망률 원위 모델 5보다는 낮다. 국소 뇌허혈 다음 순차 MRI 병변, 부피, 부종 진행을 사용하는 것이 평가 될 수있다. 24 시간 영구 말단 MCAO 후 96 시간에서 MRI는 T2의 hyperintensities의 유의 한 진행을 보이지 않았다.
그림 2 : 만성 두개골 창 준비. (A) 대표 타임 라인. <강한>는 개두술 시간적 근육 측방 위치를 취하는 영역 표시 (B)은 우수한 시상 정맥동에 내측 및 정수리에 지느러미. 온전한 경질 층 위의 커버 유리 (C) 개두술 후 뇌 표면; 원은 말초 MCAO 후 허혈 영역의 위치를 보여줍니다. 몇 주의 (b = 브레 그마, TM = 시간 근육, SSS = 우수한 시상 동, 허혈의 인공 지능 = 영역)에 대한 반복적 인 이미징을위한 준비 (D) 고정 커버 유리와 함께 완료 만성 두개골 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 측면 만성 CW 및 말초 MCAO 또는 위장 수술의 조합입니다. (가) MRI는 쉬 후 24 시간 수행오전 수술은 병변 대뇌 피질의 조직을 표시하지 않습니다. 허혈는 누가 뭐라고해도 만성 CW 아래에있는 허혈성 병변 (*)를 묘사 한 후 (나) MRI는 24 시간을 수행 하였다. (C) 생체 내에 에피 형광 이미징 (상부) 및 대뇌 혈관의 이광자 영상 (하부). (D) 경색 볼륨은 24 시간에서 MRI를 통해 평가하고, 허혈 후 96 시간은 96 시간에서 평균 병변 24 시간에서 13.16 2.3 mm 3의 볼륨과 12.2 1.9 mm (3)를 보여줍니다. 각 점은 개별 동물 (그룹 당 n = 10 동물, ± SEM을 의미한다)을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
스트로크 1 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 급성 치료, 가속 및 뇌졸중 후 회복을 향상시키기 위해 새로운 접근 방식과 메커니즘을 조사 외에도 주요 의료 목표 7 남아있다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 사실, 일시적 또는 영구적 유도 MCAO 모델은 환자 4 국소 뇌허혈의 가장 흔한 유형 중 하나를 모방. MCA 폐색의 근위 외에 원위 MCAO 수술 폐색 필라멘트 모델 실험 스트로크 연구 5,19에서 가장 자주 사용되는 모델은 아마도. 여기서는 영구 원위 MCAO의 기본 기술은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하고, 횡 CW와 함께 설명한다. 장기 연구 결과에 대하여 특히 병변 부피의 재현성뿐만 아니라 매우 낮은 사망률 아칸소이 쥐 모델의 주요 장점을 전자. 이 피질 뇌졸중 모델에서, 스트로크 영역 경색 주변 영역에서 혈관 만성 CW를 통해 가시화 될 수있다. 다중 표면 형광 형광 videomicroscopic 시스템 혈류 역학 및 순환 세포의 동적 채용 사용하는 것이 보여 질 수있다. 혈관은 덱스 트란 또는 알부민과 같은 형광 표지 된 거대 분자의 사용을 통해 시각입니다. 세포는 형광 염료에 의해 또는 GFP 양성 동물과 골수 키메라 같은 유전 적 모델에 의해 중 하나를 표시 할 수 있습니다. 또한, 세포 간 상호 작용과 혈관 외 세포의 동역학을 연구하기 위해, 두 개의 광자 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 적용 할 수있다. 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의 최대 이미징을 수행 할 수 있습니다. 또, 혈관 형광 표지 된 고분자를 사용하여 염색하고, 세포 (예를 들어, 트랜스 제닉 GFP-네 스틴 마우스를 사용하여) 표지 유전자된다.
두개골 창수술은 경질을 열지 않고 개두술을 통해 수행된다. 하나의 주요 함정은 실수로 microdrill와 두개골을 열 때 아래 경막 층과 피질을 손상하는 것입니다. 따라서,이 방법은 면역 반응에 영향을 현미경 결과를 유도 경질 및 피질의 손상을 방지하기 위해 약간의 기술을 필요로한다. 대안으로, 잠재적 인 박막화 두개골 모델은 특히 장기적으로 인해 나머지 두개골의 신뢰성이 떨어지는 현미경의 품질에 의해 제한된다. CW 모델에서 윈도우 품질 두개골 재성장 또는 품질 14, 20 촬상 경막 육화 영향까지 몇 달 동안 지속하는 반면 자주 반복 두개골 박형화가 필요하다. 시닝 - 두개골 준비이 모델의 변조가 가능하다. 경막 층은 피질의 손상이나 자극을 방지하기 위해 뇌에 남아 있어야합니다. 허혈 영역에 대한 직접적인 응용이 실험 모델에서 원하는 경우에만 경질 재 수신중하고 브리지 혈관 부상없이 움직였다.
모델링 CW를 결합하고 매우 작은 허혈성 병변로 이어지는 순환 감광제의 조사를 통해 목표 혈관 폐색을 유도 대조적으로, 말단 MCAO 모델을 모방 대뇌 피질의 MCA 영토 (13)에있는 인간의 스트로크의 대부분. 일시적인 염증 반응과의 간섭을 피하기 때문에 CW 준비에, 창은 말초 MCAO 수술 전에 몇 일을 준비해야한다.
시험의 숫자는 설치류의 기능뿐만 아니라 행동 양상을 사용할 수 있습니다 평가하기 위해 (예를 들어, 보행 분석, 로타로드 (rotarod) 시험, 극 테스트, 접착제 제거 테스트, 계단 테스트 오픈 필드 테스트 및 모리스 물 미로) 21. 이 모든 테스트에서, MCAO 대상 마우스는 단기 및 중기 결과에 대한 제어 동물보다 적은 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 평가 관련장기간의 결과는, 그 기능 테스트의 감도가 매우 원위 MCAO 환산 제한뿐만 아니라 MCAO 19,21-23 근위 온화한 것으로 인정되어야한다.
잘 훈련 된 의사에 의해 수행 원위 MCAO은 이하에서 20 분 내에 발생 될 수 있고, 재현성 허혈성 병소를 생산할 수있다. 그러나, 재현성이 혼란 변수에 대한 철저한 관리가 필요합니다. 수술 기법의 차이는 경색 크기 (24)의 차이가 발생할 수 있습니다. 다른 마우스 변종으로 인해 변종 사이의 뇌 혈관 해부학의 차이에 다른 스트로크 결과를 표시 할 수 있습니다. 체온보다 심한 결핍 25,26에 작은 병소 및 고열 선도 저체온증 허혈에 신경 손상 및 민감성에 영향 게다가, 온도 조절 및 유지 보수가 높은 모델의 관련성뿐만 아니라 다른 허혈 모델 (27)에있다. 혈액 pressu 일반적인 생리적 파라미터에서가스 재 혈액, 결과의 중요한 혼란 변수이며 28 제어되어야한다. 일부 에이전트 직접적인 신경 보호 효과를 발휘하거나 혈관 작용 특성 (29)을 통해 간접적으로 작용할 수있다 또한, 마취제의 선택은 매우 중요하다. 따라서, 마취 노출 표준화 가능한 짧게 유지되어야한다. 마지막으로, 하우징 조건은 농축의 사용 등 및 스트로크 결과에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 (30)를보고 표준화 연구에서 설명한다. 새로운 치료 방법, 표준화, 품질 관리, 및보고의 개발에 대한 중요한 임상 결과를 생성하기 위해 매우 중요하다 (31).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | Kopf | Model 930 | |
| Anaethesia system for isoflurane | Draeger | ||
| Isoflurane | Abott | ||
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Bipolar Forceps | Erbe | 20195-501 | |
| Bipolar Forceps | Erbe 20195-022 | ||
| Microdrill | FST 18000-17 | ||
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 |
References
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