Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisert robot flytende håndtering samlingen av modulære DNA enheter

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54703
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

Summary

Her vises en automatisert arbeidsflyt utføre modulære DNA "enhet" montering med en modulær kloning DNA montering metode på flytende-håndtering roboter. Protokollen bruker en intuitiv programvareverktøy for å generere flytende handler picklists for kombinasjon DNA enheten biblioteket generasjon, som viser vi bruker to flytende håndtering plattformer.

Abstract

Nylige fremskritt innen modulær DNA montering teknikker har aktivert syntetiske biologists teste betydelig mer de tilgjengelige "design space" representert ved "enheter" opprettet som kombinasjoner av genetisk komponentene. Manuell samling av så mange enheter er imidlertid tidkrevende, utsatt for feil og dyrt. Den økende raffinement og omfanget av syntetisk biologi forskning nødvendiggjør en effektivt, reproduserbare måte å imøtekomme store, komplekse og høy gjennomstrømning enhet bygg.

Her, er en DNA montering protokoll med Type IIS begrensning endonuclease basert modulære kloning (MoClo) teknikk automatisert på to væske-håndtering robot-plattformer. Automatisert væske-håndtering roboter krever forsiktig, ofte kjedelig optimalisering av pipettering parametere for væske av ulike viskositeter (f.eks enzymer, DNA, vann, buffere), samt eksplisitt programmering å sikre riktig aspirasjon og dispensing DNA deler og reagenser. Dette gjør manuell skriptet skrive for kompliserte samlinger bare så problematisk som manuell DNA montering og nødvendiggjør en Programvareverktøyet det kanne automatisere generering av skript. Dette har vi utviklet en web-basert Programvareverktøyet, http://mocloassembly.com, for å generere kombinasjon DNA enheten biblioteker fra grunnleggende DNA deler lastet opp som Genbank filer. Vi gir tilgang til verktøyet, og en eksportfil fra våre flytende hånd programvare som inkluderer optimalisert flytende klasser, labware parametere og dekk oppsett. Alle DNA deler brukes er tilgjengelig gjennom Addgene, og deres digitale kart kan nås via Boston University BDC ICE registret. Disse elementene utgjør sammen en stiftelse for andre organisasjoner til å automatisere modulære kloning eksperimenter og like protokoller.

Automatisert DNA samlingen arbeidsflyten presenteres her kan gjentas, automatisert, høy gjennomstrømming DNA-enheter og reduserer risikoen for menneskelige feil som oppstår fra repeterende manuelle pipettering. Sekvensering data viser automatisert DNA montering reaksjonene fra denne arbeidsflyten er ~ 95% korrekt og krever lite som 4% som mye hands-on tid, sammenlignet med manuell reaksjon forberedelse.

Introduction

De tidligste syntetiske biologiske genetisk enhetene som Collins vippebryter1 og Elowitz repressilator2 vist at biologiske systemer kan bli frem konstruert for å ha bestemt, deterministisk funksjoner. Siden da har syntetiske biologists forsøkt å ingeniør levende systemer til å utføre stadig mer komplekse funksjoner i tjenesten av biologisk materiale3, biotherapeutics4,5,6, biodrivstoff 7,8, og biosensing programmer9,10,11. Oppnå disse programmene gjennom kombinere modulære DNA "deler" i "enheter" med spesifikk funksjonalitet har vært en av de viktigste målene for syntetisk biologi. For denne prosessen for å skalere, må det være en teknikk som tillater etablering av komplekse enheter fra store biblioteker av deler i en tidkrevende, kostnadseffektiv, og viktigst, reproduserbare måte.

Slike en ekspansiv monteringen berettiget fordi feltet mangler for tiden en fullstendig forståelse av reglene guiding lykkes biological systemdesign og komposisjon. Dette er forsterket av utilstrekkelig preget DNA deler12, mangel på kompatibilitet og composability deler13og uventede, uønsket interaksjon mellom genetisk komponentene i syntetisk enheter14, 15. i fravær av pålitelig prediktiv modellering, funksjonelle syntetiske genetisk enheter er ankom ved prøving og feiling, som krever titusener, eller selv hundrevis, input-output signalstyrke varianter av en beregnet enhet er vist og den "best" er valgt for komposisjon med nedstrøms elementer16. Mens moderne standardisert DNA montering metoder som Golden Gate17og modulære kloning gjøre18,19,20 denne prosessen enklere, ekspert eksperimentelle er fortsatt nødvendig for å utføre hver protokoll. Syntetisk enheter vokser i størrelse og kompleksitet, totalt tilgjengelig design plass vil bli for stor for å bygge og teste manuelt21og prosessen vil bli for artisanal for betydelig fremgang som er repliserbar gjøres i feltet.

Frem til syntetisk biologi og biologiske del repositories som iGEM deler registret (http://partsregistry.org), ble JBEI lager av Composable elementer22og SynBioHub23, genetisk delene ikke lagret i noen standardisert montering format. Bare en liten håndfull deler måtte bli klonet per prosjekt, og dermed volumet av kloning gjort var liten, og realisering av en samlet enhet var oppnåelig og trivielle forhold til faktiske forskning målene. Molekylær kloning var ofte adhoc og utført ved hjelp av begrensning fordøyer basert på begrensning området og endonuclease tilgjengelig i stedet for etter standardiserte prosesser. Mangelen på standardisering gjorde det upraktisk å automatisere noen kloning protokoll som det var usannsynlig at neste kloning reaksjonen vil følge en identisk protokoll. Videre nødvendig automatisere DNA montering betydelige økonomiske investeringer i utstyr (væske roboter og deres tilhørende programvare og labware infrastruktur) og bruke tid investeringen for generering av å utvikle nøyaktig parametere for håndtering av de ulike klassene av væsker behandles og presis rekke instruksjonene for å kjøre disse protokollene. Småskala kloning innsats ikke rettferdiggjøre disse utgiftene. Kombinasjonen av større, mer komplekse genetiske enheten design kombinert med standardiserte montering protokoller24,25 skaper et miljø hvor automatisering av disse prosessene er veldig praktisk. Lavpris robotikk som Opentrons OT-en26 er også nye som lar selv beskjedent finansiert labs til denne teknologien. I tillegg "cloud" laboratorier27 inkludert Transcriptic og Emerald Cloud Lab samt akademiske "biofoundries" som Edinburgh genomet støperi, UIUC-iBioFab og MIT-bred støperiet, sele robotikk å montere mangfoldig sett av design for en rekke kunder raskt og gjentatte ganger mens opprettholde et felles oppbevaringssted for grunnleggende DNA primitive og montering teknologi for fremtidige bestillinger.

En av de største utfordringene i å automatisere prosessen med DNA montering er generering av pipettering kommandoene for flytende behandleren. Mens programvare grensesnitt for disse enhetene er vanligvis enkel å bruke, komplekse krever pipettering instruksjoner som nødvendig for kombinasjon DNA montering forskeren eksplisitt angi hver leveringstanken og dispensere kommandoen manuelt. Dette skaper en alvorlig flaskehals i arbeidsflyten, og forlater skriptet Generasjonsprosessen utsatt for samme pipettering feilene som om samlingen ble utført manuelt. Dette nødvendiggjør en Programvareverktøyet det kanne automatisere alle deler av denne prosessen, designe enhetsbiblioteket, genererer pipettering instruksjonene og gir forskeren plate/reagensen oppsett må samle dem. I dette arbeidet utnytte vi vår programvareverktøy for å automatisere utformingen av en liten kombinasjon DNA enhetsbiblioteket, samt en blanding av reagenser (buffer, vann, enzymer) og DNA deler (figur 1b) inn 96 one-pot modulære DNA montering reaksjoner. Bruk av verktøyet krever ingen tidligere erfaring med programmering, er skalerbare og høy gjennomstrømning, og kombinasjon som standard. Vi viser at kloning reaksjoner forberedt på to forskjellige automatisert flytende håndtering plattformer i yield riktig sekvens-verifiserte kloner med sammenlignbare frekvens reaksjoner forberedt manuelt (95%), og med mindre hands-on tid.

Protocol

1. Angi deler i DNA biblioteket og generere bruker og væske Handler instruksjoner [15 min]

  1. Med alle web kikker, gå til mocloassembly.com og laste opp Genbank filer for alle DNA deler som skal inkluderes i kombinasjon DNA enheten design.
  2. Når alle filene er lastet opp, Velg ønsket DNA deler og drar dem til den tomme lerretet, plassere del typene i final rekkefølge av DNA deler.
    Merk: Samlinger av deler, samt enkeltdeler, kan merket og plassert på lerretet. Også bestille DNA deler slik at 5' og 3 overhangs for hver del kamp.
  3. Klikk "Sette" nederst til høyre på siden.
    Merk: Verktøyet vil bare generere gyldig, buildable samlinger basert på fire base par overheng som flanken hver del på fordøyelsen med BsaI enzymet. Hvis ingen buildable DNA-enheter finnes basert på deler lastet opp av forskeren, vise verktøyet at ingen samlinger ble funnet.
  4. Naviger til fanen 'Planer' og laste ned filer generert av verktøyet. Disse filene vil inkludere:
    1. Lesbar plate kart for forskeren å forberede DNA-prøver, samt reagenser nødvendig for reaksjonene
    2. En plukkliste for flytende behandlingsprogrammet
    3. Fullt kommentert Genbank filer for alle DNA enheter monteres
      Merk: Flytende håndtering arm posisjonering når noen nye labware må testes. Se produsentens håndbok for detaljerte instruksjoner om hvordan du justerer pipettering arm posisjonering i X, Y og Z akser som nødvendig.

2. Forbered plasmider DNA og reagenser for samlingen [3 dager]

  1. [Dag 1] Bruker en steril inokuleringen sløyfe og arbeider nær åpen flamme eller i laminær strømning hette, strek ut bakteriell glyserol aksjer på LB-agar plater med det aktuelle antibiotikumet. Gjør dette for alle nødvendige DNA deler, og pass på å sterilisere loop mellom hvert utvalg. Inkuber plater på 37 ° C over natten.
    Merk: Frosset bakteriell glyserol aksjer bør holdes på is som mulig. Gjentatt frysing-Tin sykluser lavere levedyktigheten til lager og bør unngås.
  2. [Dag 2] Bruker et sterilt pipette tips, tannpirker eller inokuleringen sløyfe, og arbeider nær åpen flamme eller i laminær strømning hette, vaksinere 3 mL LB kjøttkraft (supplert med passende antibiotikumet) med en enkelt koloni fra LB-agar platene i 2.1. Inkuber kulturer overnatting på 37 ° C mens riste på 300 RPM.
  3. [Dag 3] Rense plasmider DNA fra bakteriekulturer bruke alle kommersielt tilgjengelig mini prep plasmider rensing kit.
  4. Bruker den angitte MoClo_Setup.xlsx-filen, fortynne hvert utvalg av plasmider DNA til en konsentrasjon på 20 fmol/µL i vann eller TE buffer.
  5. Etter plate kartet i PDF-filen som genereres av verktøyet montering, plassere det angitte volumet av hver utvannet DNA-del i riktig brønnen på en full-skirted 96-brønns PCR plate. Hold denne SetupPlate på is inntil nødvendig, eller forsegle med en folie selvklebende sel og lagre på 20 ° C.
  6. På is, forberede reaksjon mastermix med følgende komponenter: for hver 20 µL av reaksjonen legge 2 µL av 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL av T4 DNA Ligase (HC) og 1 µL av BsaI enzym. En kalkulator ark er inkludert i filen MoClo_Setup.xlsx å hjelpe med dette.
    1. Distribuere enzym-mastermix i riktige brønnene av en ny full-skirted 96-brønns PCR plate, etter plate kartet for ReagentPlate i den genererte PDF. Holde denne ReagentPlate på is eller en 96-brønns kald-blokk.
      Merk: ReagentPlate bør bare være forberedt når du vil kjøre forsamlingen på flytende behandleren.

3. kjøre montering skript på flytende behandleren [variabel]

  1. Plass SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (på 96-brønns kald-blokk) og det nødvendige antallet tomme full-skirted 96-brønns PCR plater på dekket av flytende behandleren. Tom plate(s) blir OutputPlate(s) der reaksjonene er samlet.
  2. Forbereder flytende behandleren styre programvare ved å opprette forekomster av hver prøve og reagens plate forberedt, og pass på å navngi dem nøyaktig slik de vises på plate kartene genereres av mocloassembly.com, inkludert en gjennom ren, deionisert vann merket ' Reservoaret '.
  3. Bruke kommandoen "Worklist" i Kontrollprogramvaren, laste .gwl fil generert av våre Programvareverktøyet, etterfulgt av en annen "Worklist"-kommando som vil kjøre filen .gwl lastet inn i den første kommandoen.
  4. Kjører du skript ved hjelp kontrolleren programvaren "Kjør"-kommandoen.
    Merk: La alltid robot flytende behandleren å fullføre kjøring av et skript før du prøver å få tilgang til dekksplass.
  5. Fjern alle platene fra flytende handler dekket. Gjenværende DNA kan lagres forsegle SetupPlate(s) med aluminium tetting film og lagre på 20 ° C. Forsegle OutputPlate(s) med lim, plasser i thermocycler eller varme-blokk og kjøre med følgende syklus parametere:
    37 ° C for 2 timer, 50 ° C i 5 min, 80 ° C i 10 min, holde på 4 ° C
    Merk: Når reaksjon thermocycling er fullført, OutputPlate(s) kan lagres på 20 ° C til de er klar til å bli forvandlet.

4. endre reaksjonene [1 dag]

  1. Tine den nødvendige antallet kompetent E. coli celle dele nødvendig (10 µL/reaksjon) på is.
    Merk: For å opprettholde sterilitet, følgende trinn skal utføres nær åpen flamme eller i laminær strømning hette.
    1. Mens celler er tining, forberede LB-agar plater (med passende antibiotikumet) av pipettering 50 µL av 0.1 M IPTG og 50 µL av 20 mg/mL X-GAL på overflaten. Gjøre en master blanding hvis plating mange reaksjoner. Pels platene jevnt med sterilt glass stang eller glassperler og la platene til å hvile på 37 ° C i minst 15 min før plating bakterier.
      Merk: Alternativt legge IPTG og X-Gal til flytende agar før plater er helles, 2 mM IPTG og 40 µg/mL X-Gal siste konsentrasjon. Lagre disse platene av lys som X-Gal er lys-sensitive.
  2. På is, aliquot 10 µL av kompetente celler for hver reaksjon i en ny 96-brønns PCR plate. Dette blir transformasjon platen.
  3. Legge til 1-3 µL av hver reaksjon fra OutputPlate(s) til de tilsvarende i transformasjon platen og ruge på is 5 min.
  4. Forsegle transformasjon platen med selvklebende film og varme sjokk i en thermocycler på 42 ° C for 30 s. Deretter umiddelbart plassere platen på is 2 min.
  5. Samme fordelt av transformasjon Plate, legge 150 µL av SOC media, tetning med en aluminium selvklebende segl og ruge på 37 ° C mens risting 900 RPM for 1 hr.
  6. Plate alt innholdet i hver brønn av transformasjon Plate LB-agar platene i 4.1.1 bruker sterilt glass stang eller glassperler å jevnt coat overflaten av platen. Inkuber plater på 37 ° C over natten.

5. klone bekreftelse [2 dager]

  1. Forberede en eller flere 96-brønns dyp-brønnen blokker med 1,5 mL av LB kjøttkraft (med passende antibiotikumet).
    1. Lik trinn 2.2, vaksinere dyp-brønnen block(s) med enkelt hvit kolonier fra hver LB-agar plate transformert reaksjoner.
    2. Seal kultur block(s) med en gass-permeable sel og ruge over natten på 37 ° C mens risting 900 RPM.
      Merk: Modulært kloning teknikk benytter blå-hvit screening, slik positiv CFUs vises hvite på LB-agar plate, mens tomme destinasjon vektorer vises blå.
  2. Isolere plasmider DNA fra bakteriekulturer (som 2.3) og sende til Sanger sekvensering å bekrefte kloner.

Representative Results

Her viser vi automatisert modulære montering av 96 DNA enheter fra ulike grunnleggende DNA deler (figur 1b) med to automatisert robot flytende håndtering plattformer. Hver transcriptional enhet er en lineær ordning av arrangøren, ribosomal bindende nettsted, gene og transcriptional terminator, klonet i en bestemt destinasjon vektor. TUs er en nøkkelkomponent i mange hierarkisk genetisk krets design28,29,30 og derfor et naturlig bevis på konseptet for denne tilnærmingen. Sekvens-verifiserte kloner kan oppnås i ~ 5 dager fra start til slutt, og en oversikt over presentert arbeidsflyten vises i figur 1a.

Bruke beskrevet verktøyet og protokollen, fanget vi flere beregninger nyttig for å fastslå den optimale montering plattformen gitt et definert antall kloning reaksjoner genereres av forskeren. Figur 2a illustrerer en sammenligning mellom montering reaksjonstid over alle tre modaliteter. Kjøretiden er den totale tiden å fullføre alle pipettering trinnene for å samle 96 reaksjoner, som inkluderer utlevering av alle DNA deler og reagenser. Hands-on tid refererer til den totale tiden et menneske ble manuelt involvert i utarbeidelsen av kloning reaksjonene eller oppsett av programvaren kjører flytende behandleren. Figur 2b sammenligner kostnad mellom ulike metoder. Presentert for en enkelt reaksjon utarbeidet av hver metode og inkluderer prisen enzymer og disponibel pipette-spisser, gitt den laveste typiske reaksjon volumet (20 µL for flytende handler, 10 µL for manuell, 250 nL for akustisk dispenser). Enkelt kloner fra alle 96 reaksjoner for både manuell og flytende handler forberedt sett ble sekvensert, med et delsett av 12 sekvensert for akustisk dispenser reaksjoner (figur 2 c). Riktig sekvenser ble innhentet 95% av 96 manuell og flytende behandlingsprogram. 83% av akustisk dispenser eksempel delsettet var korrekt, men siste to reaksjoner ikke gitt noen hvite kolonier, sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig blanding av dråper etter utlevering av DNA og reagenser var fullført. Figur 2d illustrerer kloning reaksjon effektivitet, målt ved forholdet mellom hvit kolonier totalt antall kolonier, som er sammenlignbare mellom manuelt (94%) og flytende hånd-montert (84%) reaksjoner. Interessant, da Nedskalering siste reaksjon volumet med akustisk dispenser, merket vi en markant nedgang i reaksjon effektivitet når reaksjoner var forberedt på volumer som er mindre enn 1 µL (supplerende figur 1 og supplerende tabell 2). Dette er sannsynligvis på grunn av fordampning under reaksjonen thermocycling, som kan føre til en økning i salt konsentrasjonene i reaksjonen.

Figure 1
Figur 1. Automatisert DNA enheten bibliotek samlingen arbeidsflyten.
(a) en oversikt over eksperimentell arbeidsflyten i dette arbeidet. (1) forskere først laste opp Genbank filer for alle DNA deler og destinasjon vektorer de ønsker å bruke. (2) deretter er DNA delene i forsamlingen merket. (3) verktøyet genererer deretter en plukkliste for en automatisert flytende handler, samt plate kart å hjelpe med manuell befolkningen med DNA deler og enzymet mastermix. (4) bruke DNA & reagenser plater, så vel som genererte valglisten, forskere kjøre montering av kloning reaksjonene på flytende behandleren. (5) en gang fullført, er reaksjonene forvandlet og belagt for nedstrøms. (b) liste av DNA deler brukes i dette arbeidet. Totalt tre arrangører, tre ribosomal bindende områder, fire koding nummerserier, og én transcriptional terminator ble brukt generere kombinasjon biblioteket av 96 TUs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Sammenligninger mellom tre ulike reaksjon montering modaliteter.
(a) reaksjon oppstillingstiden for 96 reaksjoner samlet manuelt via en flytende hånd, og av en akustisk dispenser. Manuell montering tok 2 h 10 min, alle var hands-on tid. Flytende behandlingen tok en lignende mengde tid (2 h 6 min) utføre pipettering kommandoene, men bare en brøkdel av den tiden (5 min) var praktisk. Akustisk dispenser tok mindre tid til å kjøre flytende overføringer (5 min) og tok minimal hands-on tid (5 min). (b) pris per enkelt kloning reaksjon for hver montering metode. Dette inkluderer kostnadene av enzymer som brukes, og pipette-spisser. (c) sekvensering resultater fra enkelt kolonier av alle 96 samlet TUs. Prosentandelen av riktige kloner var sammenlignbare over alle montering metoder. Merk at bare et delsett (12) i full 96 samlingene ble forvandlet fra akustisk dispenser forberedt prøver. To reaksjoner ikke gitt noen hvite kolonier, sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig blanding av DNA & enzymet mastermix dråper i OutputPlate. (d) sammenligning av kloning reaksjon effektivitet mellom manuell og flytende handler forberedt reaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1. Reaksjon effektivitet avtar med senke reaksjon volum.
Reaksjon effektivitet slippe markert når Nedskalering reaksjon volumer under 1 µL. Denne trenden er sett med to ulike siste DNA konsentrasjoner; men kan forskere velge for å bruke mindre volumer for å spare på reagens kostnader hvis lavere effektivitet kan tolereres. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1.
Tabell over DNA og ENZYM flytende parametere for ulike pipettering volumer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 2.
Reaksjon effektivitet beregninger. Rå CFU tall gis for 12 av 96 transformert reaksjoner forberedt og manuelt via flytende behandleren. CFU tall tilbys også for testing av mindre siste reaksjon volumer på akustisk dispenser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Avslutningsvis automatisering av komplett DNA enheten etableringen prosessen, fra i-sili design flytende håndtering, er et levedyktig mål med aktuelle eksisterende teknologi. Programvare og moderne roboter tillate oppretting av arbeidsflyter som er kostnadseffektiv, tidseffektive og skalerbare, mens også produsere mer konsekvent reproduserbar resultater enn manuelle metoder. Mens automatisering ikke kan alltid være det mest kostnadseffektive valget for utfører en protokoll, det blir bedre eksperimentelle reproduserbarhet og frigjør verdifulle forsker tid. Imidlertid avhengig av maskinvaren utnyttes, kan bruk av automatisering noen ganger kjøre kostnader og utførelsestid godt under hva som kan oppnås gjennom konvensjonelle manuelle metoder. Videre automatisering fanger protokoller eksplisitt i et formelt hindre ad hoc, artisanal, og anekdotiske beste praksis basert eksperimentering. Her automatisk montering av modulære DNA enheter er demonstrert, og protokollen, elektroniske filer og fysiske DNA ressurser trengs for leseren å utføre disse og lignende, eksperimenter på egen hånd er gitt. Vi håper at vårt verktøy, og utgivelsen av denne protokollen vil tjene som en ressurs og flytter feltet mot en mer åpen og felles fremtid i DNA assembly prosesser og flytende håndtering robotikk.

Nytten av automatisering maskinvare er i stor grad avhengig av konfigurasjonen og egenskapene til maskinvare. For eksempel bruker våre flytende handler system væske forskyvning betjene leveringstanken og dispensere kommandoer. Stempler at stasjonen systemet væsken er relativt stor 1 mL sprøyter, mens nyttig for en rekke volumer, pålegger en 2 µL nedre grense for nøyaktig utlevering av reagenser. Som en konsekvens vi skalert opp det totale volumet av kloning reaksjoner satt opp på den flytende behandleren 20 µL, siden hver dispensere kommandoen måtte ≥2 µL. Dette doblet effektivt kostnaden per reaksjon for flytende hånd-prepped reaksjoner, men praktisk tiden som kreves for å utføre disse reaksjonene ble betydelig redusert. I et forsøk på å løse dette problemet, gjentok vi reaksjon oppsettet for alle 96 reaksjoner på en akustisk flytende dispenser. Denne enheten bruker lyden energi til å dispensere fluid direkte fra en plate til en annen, og kan oppnå dispensere volumer langt under (2,5 nL) Hva er mulig med standard air forskyvning basert manuell pipetter. Bruker denne enheten, kunne vi redusere det totale volumet av våre reaksjoner til 250 nL, en 40-fold reduksjon sammenlignet manuelt forberedt reaksjoner på 10 µL. På grunn av små volumer utlevert, og mangel på tips endringer mellom pipettering trinn, akustisk dispenser kunne generere samme 96 reaksjonene på en brøkdel av tiden (< 5 min). Mindre reaksjon volumene også lagre på bortkastet reagenser, siden vi vanligvis bare transformere 1-3 µL av reaksjonen. Som blir sagt, kan bruk av automatisering maskinvare, sammen med intuitiv programvare, gjøre generering av store antall DNA montering reaksjoner tilgjengelig for et mye større akademisk publikum.

Her viser vi nytten av vår Programvareverktøyet, men det er flere funksjoner som ville bidra til å utvide dens nytte. Først må hver gang verktøyet brukes til å generere en kombinasjon samling, nye DNA del plater genereres, krever forskeren manuelt fylle disse platene for hver samling kjøre. Det ville være nyttig i stedet hvis forskeren kan angi plasseringen til deler i en DNA plate i samlingen. Dette vil tillate bruk av høy gjennomstrømming plasmider DNA rensing kits siden forskere kan vaksinere kulturer fra et kit som CIDAR MoClo Library, og rense alle prøver sammen samtidig godt plasseringen av hver del som er angitt i pakken. Andre støtter verktøyet for tiden bare bruk av 96-brønns plater. For større prosjekter der flere hundre DNA enheter må bygges, overskride antall DNA, reagens og destinasjon plater dekk kapasiteten til den flytende handler. Dette problemet kan være, minst delvis, lette av støtte for høyere tetthet plate formater (384 eller 1536-vel). Til slutt, verktøyet støtter for tiden bare én type flytende handler og DNA montering strategi. Mens det er relativt enkelt å konvertere verktøyet-produsert flytende handler instruksjonene til en akustisk dispenser format ved hjelp av regneark, håper vi å utvide støtten til mange forskjellige flytende handlers som sterkt utvide brukbarheten, som ønsker kompatibilitet med andre vanlige DNA montering teknikker Gibson montering31.

En viktig del av dette automatisk montering økosystemet er et sett med verktøy som oversetter høyt nivå montering planer til automatisering vennlig protokoller som eksplisitt skal kjøre på flytende håndtering roboter. Selv om en rekke verktøy eksisterer som tillater forskere å designe samlinger i sili inkludert Benchling, MoClo planlegger og Raven32, har få evnen til å oversette disse design til kjørbare instruksjonene for å kjøre på en væske behandleren. Det ender, arbeid som PR-PR automatisering og dukketeater33,34,35 har begynt å gjøre disse verktøyene tilgjengelig. I tillegg ser kommersielle selskaper arbeider i dette området på måter å innføre "Sky labs" som gir eksperimentelle tjenester til store grupper av sluttbrukere via automatisering. Protokollen beskrevet i dette dokumentet kan tjene som en del av dette arbeidet følger de presenteres som en tjeneste.

Mens automatisk montering av DNA enheter er umiddelbar og åpenbare verdi til syntetisk biologi, er våre protokollen nyttig for større fellesskap av molekylære biologer også. Automatisere DNA montering tillater mange kjente, men like, genetisk enheter i parallell og kan aktivere rask syntesen av uttrykket biblioteker for screening og teste i narkotika utviklingsstudier. Vi håper at vår Programvareverktøyet vil gjøre større kombinasjon-baserte DNA montering innsats mer tilgjengelig, og tjene som en nyttig ressurs for både den syntetisk biologi, samt større akademiske fellesskapet.

Disclosures

Densmore er President og medgrunnlegger av gitteret Automation, Inc. Timmons McCarthy er gitter ansatte. Gitter gjør programvare og tjenester for automatisering av mange av prosessen beskrevet.

Acknowledgments

Vi takker Swapnil Bhatia, Alejandro Peláez og Johnson Lam for arbeid på dukketeater prosjektet, samt Swati Carr, Rachael Smith og Thomas Costa hjelp med dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NSF karriere Award #1253856. Det er også finansiert av NSF ekspedisjoner i databehandling Award #1522074.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot Tecan Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) Tecan Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550 Labcyte Acoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT Sorvall Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro Eppendorf 950040015 Thermocycler with 96-well heat block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath Torrey Pines Scientific Heating/Chilling block for EVO 150 deck
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418 Eppendorf 5418000017 Stardard 18-well microcentrifuge
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name Company Catalog Number Comments
Resources
mocloassembly.com Lattice Automation Web-tool for combinatorial DNA assembly
mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit AddGene 1000000059 Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry CIDAR Lab Registry of plasmid DNA maps
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name Company Catalog Number Comments
Labware
50 μL Conductive Tips Tecan 30 057 818 Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates USA Scinetific 5678-0285 Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scinetific 1615-5599 Disposable microcentrifuge tubes
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane Sigma-Aldrich Z763624-100EA Breathable sealing membrane for bacterial culture plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates GeneMate T-3183-2 PCR plates used for all steps
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates GeneMate T-2451-1 Alluminum seals for PCR plate storage
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates GeneMate T-2450-1 Plastic seals for PCR plates during cycling
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler Eppendorf 22510525 96-well cold block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Sciences 2160250 Plasmid DNA purification kit
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC) Promega M1794 High concentration T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme New England Biolabs R0539L BbsI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme New England Biolabs R0535L BsaI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack Promega C1263 10x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Zymo Research I1001-25 0.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) Zymo Research X1001-25 20 mg/ml X-GAL solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate Zymo Research A1003-25 35 mg/ml Kanamycin solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt) Fisher BP26481 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media Teknova S0225 Powder media used to make SOC broth
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media Sigma-Aldrich L3022-1KG Powder media used to make LB broth
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media Sigma-Aldrich L2897-1KG LB with agar mix used for making solid media plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells Bioline BIO-85027 High efficiency chemically competent E. coli cells
http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name Company Catalog Number Comments
Primers
Primer VF 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
  2. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
  3. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  4. Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  5. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  6. Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
  7. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  8. Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
  9. Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
  10. Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
  11. Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
  12. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  13. Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
  15. Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
  16. Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
  17. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
  18. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
  19. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
  20. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  21. Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
  22. Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
  23. Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
  24. Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
  25. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
  27. Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
  28. Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
  29. Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
  30. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  31. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  32. Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
  33. Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
  34. Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
  35. Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).

Tags

Bioteknologi problemet 130 syntetisk biologi automatisert flytende håndtering robotikk modulære kloning automatisert DNA montering kombinasjon biblioteksamling biofoundry
Automatisert robot flytende håndtering samlingen av modulære DNA enheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L.,… More

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L., Timmons, J., Densmore, D. M. Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices. J. Vis. Exp. (130), e54703, doi:10.3791/54703 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter