Summary
Här presenteras ett automatiserat arbetsflöde att utföra modulära DNA ”enhet” församlingen med en modulär kloning metod för DNA-församling på vätska-hantering robotar. Protokollet använder en intuitiv programvaruverktyg för att skapa flytande handler plocklistor för kombinatoriska DNA enhet biblioteket generation, som vi demonstrera med två vätskehantering plattformar.
Abstract
Senaste framstegen inom modulära DNA monteringstekniker har aktiverat syntetiska biologer att testa betydligt mer tillgängliga ”design space” representeras av ”enheter” skapad som en kombination av individuella genetiska komponenter. Manuell montering av sådana stora mängder enheter är dock tidskrävande, tidskrävande och kostsamma. Den ökande sofistikering och skala av syntetisk biologi forskning kräver ett effektivt och reproducerbart sätt att rymma storskalig, komplexa och hög genomströmning konstruktion.
Här, är ett DNA församlingen protokoll med hjälp av modulära kloning (MoClo) typ-IIS begränsning Amiiiiin baserat-tekniken automatiserad på två vätska-hantering robotliknande plattformar. Automatiserad hantering av flytande robotar kräver noggrann, ofta gånger tråkiga optimering av pipettering parametrar för vätskor med olika viskositet (t ex enzymer, DNA, vatten, buffertar), samt explicit programmering att säkerställa rätt aspiration och dispensering av DNA delar och reagenser. Detta gör manuell skript skriver för komplexa sammansättningar bara är problematiska som manuell DNA-församling, och kräver ett verktyg som kan automatisera generering av skript. För detta ändamål har vi utvecklat en webbaserad programvaruverktyg, http://mocloassembly.com, för att generera kombinatoriska DNA enheten bibliotek från grundläggande DNA delar upp som Genbank filer. Vi tillhandahåller åtkomst till verktyget och en export-fil från vår flytande handler programvara som inkluderar optimerad flytande klasser, labware parametrar och däck layout. Alla DNA-delar som används är tillgänglig via Addgene och deras digitala kartor kan nås via Boston University BDC ICE registret. Tillsammans ger dessa element en grund för andra organisationer att automatisera modulära kloning experiment och liknande protokoll.
Automatiserad DNA församlingen arbetsflödet presenteras här möjliggör repeterbara, automatisk, hög genomströmning produktion av DNA-enheter, och minskar risken för mänskliga fel som härrör från repetitiva manuell pipettering. Sekvensering data visar den automatiserade DNA-församlingen reaktioner som genereras från detta arbetsflöde är ~ 95% korrekt och kräver som lite som 4% som mycket hands-on tid, jämfört med manuell reaktion förberedelse.
Introduction
De tidigaste syntetiska biologiska genetiska enheterna såsom Collins omkopplaren1 och Elowitz repressilator2 visat att biologiska system fram kunde vara konstruerad för att ha specifika och deterministiska funktioner. Sedan dess har syntetiska biologer har strävat efter att ingenjör levande system att utföra successivt mer komplexa funktioner i tjänsten av biomaterial3, biotherapeutics4,5,6, biobränslen 7,8, och biosensing applications9,10,11. Att uppnå dessa program genom att kombinera modulära DNA ”delar” till ”enheter” med specifik funktionalitet har varit en av de stora målen för syntetisk biologi. För denna process att skala, måste det finnas en teknik som möjliggör skapandet av komplexa enheter från stora bibliotek med delar i en tidseffektiv, kostnadseffektiva, och viktigast av allt, reproducerbart sätt.
Sådan expansiv församling process är befogad eftersom fältet saknar för närvarande en fullständig förståelse av de regler som vägleder framgångsrikt biologiska systemdesign och komposition. Detta förvärras av otillräckligt kännetecknas DNA delar12, bristen på kompatibilitet och composability delar13och oväntade, oönskade interaktioner mellan genetiska komponenter inom syntetiska enheter14, 15. i avsaknad av tillförlitliga prognosmodeller, funktionella syntetiska genetiska enheter är anlände till genom trial and error, vilket kräver tiotals eller till hundratals, input-output signalstyrka varianter av en avsedd enhet screenas och den ”bäst” väljs för sammansättning med efterföljande element16. Medan modern standardiserade DNA montering metoder såsom Golden Gate17, och modulära kloning göra18,19,20 denna process enklare, en experimentell expert är fortfarande skyldig att utföra varje protokoll. Som syntetiska enheter växer i storlek och komplexitet, totala tillgängliga utformning utrymme kommer bli för stor för att bygga och testa manuellt21, och processen kommer att alltför hantverksmässiga för några betydande framsteg som är reproducerbart skall göras i fältet.
Fram till tillkomsten av syntetisk biologi och biologiska del databaser såsom iGEM delar registret (http://partsregistry.org) förvarades JBEI inventering av Composable element22och SynBioHub23, genetiska delar inte i någon standardiserad montering format. Endast en liten handfull delar behövs att klonas per projekt, och således kloning gjort var små, och förverkligandet av en monterad enhet var uppnåeligt och triviala jämfört med de faktiska forskningsmål. Molekylär kloning var ofta ad hoc- och utförs med begränsning smälter baserat på begränsning webbplats och Amiiiiin tillgänglighet snarare än efter någon standardiserad process. Avsaknaden av standardisering gjort det opraktiskt att automatisera kloning protokoll som det var osannolikt att nästa kloning reaktionen skulle följa ett identiskt protokoll. Dessutom krävs automatisera DNA-församling betydande monetär investering i utrustning (vätskehantering robotar och deras associerade programvara och labware infrastruktur) samt investeringen i tid för generering av instruktioner att utveckla korrekta parametrar för hantering av vätskor bearbetas de olika klasserna och exakt serie av instruktioner för att köra dessa protokoll. Liten skala kloning ansträngningar motiverar inte dessa kostnader. Kombinationen av större och mer komplexa genetiska enhet mönster tillsammans med standardiserad montering protokoll24,25 skapar en miljö där automatisering av dessa processer är mycket praktisk. Låg kostnad robotics som den Opentrons OT-ett26 framträder också som tillåter ännu blygsamt finansierade labs tillgång till denna teknik. Dessutom ”moln” laboratorier27 inklusive Transcriptic och Emerald Cloud Lab samt akademiska ”biofoundries” såsom Edinburgh genomet gjuteriet, den UIUC iBioFab, och MIT-breda gjuteriet, sele robotics att montera olika uppsättningar av mönster för en mängd olika kunder snabbt och upprepade gånger medan underhåll en gemensam informationsdatabas grundläggande DNA primitiver och montering teknik för framtida beställningar.
En av de största utmaningarna i att automatisera processen för DNA-församling är generation av pipettering kommandon för flytande hanteraren. Medan gränssnitt för dessa enheter är vanligtvis lätt att använda, komplexa kräver pipettering anvisningar som de nödvändiga för kombinatoriska DNA-församling forskaren att uttryckligen ange varje aspirera och expediera kommandot manuellt. Detta skapar en stor flaskhals i arbetsflödet, och lämnar script genereringsprocessen utsatta för samma pipettering fel som om församlingen utfördes manuellt. Detta kräver ett verktyg som kan automatisera alla delar av denna process, från att utforma enhetsbiblioteket, att generera pipettering instruktionerna, och ger forskaren plattan/reagens konfigurationer krävs att montera dem. I detta arbete utnyttjar vi vår programvaruverktyg för att automatisera utformningen av ett litet kombinatoriska DNA enhetsbibliotek samt blandning av reagenser (buffert, vatten, enzymer) och DNA delar (figur 1b) i 96 one-pot modulära DNA församlingen reaktioner. Verktyget kräver ingen tidigare erfarenhet av programmering, skalbar och hög genomströmning, och kombinatorisk som standard. Vi visar att kloning reaktioner beredd på två olika automatiserad vätskehantering plattformar avkastning rätt sekvens-verifierade kloner med jämförbar klockfrekvens till reaktioner beredd manuellt (95%), och med betydligt mindre hands-on tid.
Protocol
1. Ange delar som ska användas i DNA enhetsbiblioteket och generera användaren/flytande Handler instruktioner [15 min]
- Använda valfri webbläsare, navigera till mocloassembly.com och ladda upp Genbank filer för alla DNA delar som ska ingå i kombinatorisk DNA enhet design.
- När alla filer har laddats, markera önskad DNA delar och dra dem till den tomma duken, placera en del typer i den avsedda slutliga ordningen av DNA delar.
Obs: Samlingar av delar, samt individuella delar, kan väljas och placerad på duken. Dessutom beställa DNA delar så att de 5' och 3' överhäng för varje del match. - Klicka på 'Montera' längst ned till höger på sidan.
Obs: Verktyget genererar endast giltigt, byggbar församlingar utifrån fyra baspar överhäng som flankerar varje del vid matsmältningen med enzymet BsaI. Om inga byggbar DNA-enheter finns baserat på de delar som laddas upp av vetenskapsmannen, indikerar verktyget att inga församlingar hittades. -
Navigera till fliken 'Planer' och hämta filer som genereras av verktyget. Dessa filer kommer att omfatta:
- Läsbar plattan kartor för forskaren att förbereda DNA-prover, samt reagenser som är nödvändiga för reaktioner
- En 'plocklista' för flytande hanteraren
- Fullt kommenterad Genbank filer för alla DNA enheter monteras
Obs: Vätskehantering arm positionering vid åtkomst till eventuella nya labware måste testas. Konsultera tillverkarens handbok för detaljerade instruktioner om hur du justerar pipettering armen positionering i X, Y och Z yxor som behövs.
2. Förbered Plasmid DNA och reagenser för montering [3 dagar]
- [Dag 1] Med hjälp av en steril inympning loop och arbetar nära en öppen eld eller i en LAF, strimma ut bakteriell glycerol lager på LB-agarplattor kompletteras med anslåantibiotikummen. Gör detta för alla nödvändiga DNA delar, se till att sterilisera slingan mellan varje prov. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
Obs: Frysta bakteriell glycerol bestånd bör hållas på is så mycket som möjligt. Upprepad frysning-tining cykler sänka livskraften hos beståndet och bör undvikas. - [Dag 2] Med en steril pipettspetsen, tandpetare eller inympning loop och arbetar nära en öppen eld eller i en LAF, Inokulera 3 mL LB buljong (kompletteras med lämpligt antibiotikum) med en enda koloni från LB-agar plattorna beredd i 2.1. Inkubera kulturer över natten vid 37 ° C under omskakning vid 300 RPM.
- [Dag 3] Rena plasmid DNA från de bakteriekulturer med någon kommersiellt tillgänglig mini prep plasmid rening kit.
- Använda filen MoClo_Setup.xlsx som tillhandahålls, späd varje prov av plasmid DNA till en koncentration av 20 fmol/µL i vatten eller TE buffert.
- Efter plattan karta av den PDF-fil som genereras av verktyget församling, placera den angivna volymen av varje utspätt DNA del i lämpliga brunnen på en full-kjolar PCR-plattan med 96 brunnar. Håll denna SetupPlate på is tills det behövs, eller täta med en självhäftande folie tätning och förvaras vid-20 ° C.
-
På isen, förbereda den reaktion mastermix med följande komponenter: Lägg till 2 µL 10 x T4 DNA ligase buffert, 0,5 µL av T4 DNA Ligase (HC) och 1 µL BsaI enzym för varje 20 µL av reaktion. En kalkylator sheet ingår i filen MoClo_Setup.xlsx för att hjälpa till med detta.
- Fördela de enzym mastermix i lämpliga brunnar av en ny full-kjolar PCR-plattan med 96 brunnar, efter plattan kartan för ReagentPlate i den genererade PDF. Hålla denna ReagentPlate på isen eller på en 96-väl kalla-block.
Obs: ReagentPlate bör endast vara beredd när du är redo att köra församlingen på flytande hanteraren.
- Fördela de enzym mastermix i lämpliga brunnar av en ny full-kjolar PCR-plattan med 96 brunnar, efter plattan kartan för ReagentPlate i den genererade PDF. Hålla denna ReagentPlate på isen eller på en 96-väl kalla-block.
3. utföra montering Script på flytande hanteraren [variabel]
- Placera SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (på en 96-väl kalla-block) och det nödvändiga antalet tomma full-kjolar 96 brunnar PCR-plattor på däcket på den flytande hanteraren. Den tomma skylt(ar) blir den OutputPlate(s) där reaktionerna finns samlade.
- Förbereda den flytande handtag styra programvaran genom att skapa instanser av varje prov och reagens tallrik förberedd, se till att namnge dem exakt som de visas på plattan kartorna genereras av mocloassembly.com, inklusive ett tråg med ren, avjoniserat vatten märkt ' Reservoaren '.
- Med kommandot 'Arbetslista' i programvaran kontroll, ladda .gwl filen genereras av vår programvaruverktyg, följt av en annan 'Arbetslista'-kommando som ska köras den inlästa i det första kommandot .gwl-filen.
- Skriptet använder programvaran för handkontrollens 'Springa' kommandot.
Obs: Tillåt alltid robotic flytande hanteraren att slutföra genomförandet av ett manus innan du försöker komma åt däcksutrymme. - Ta bort alla plattor från flytande handler däck. Återstående DNA kan sparas genom att täta SetupPlate(s) med tätning aluminiumfilm och lagring vid-20 ° C. Försegla av OutputPlate(s) med självhäftande film, placera i en termocykler eller värme-blocket och kör med följande cykel parametrar:
37 ° C i 2 h, 50 ° C i 5 min, 80 ° C i 10 min, håll vid 4 ° C
Obs: När den reaktion termocykling är klar, OutputPlate(s) kan lagras vid-20 ° C tills de är redo att omvandlas.
4. förvandla reaktionerna [1 dag]
-
Tinar det erforderliga antalet behöriga E. coli cell alikvoter som behövs (10 µL/reaktion) på is.
Obs: För att upprätthålla sterilitet, följande steg bör utföras nära en öppen eld, eller inom en LAF.- Medan celler upptining, förbereda LB-agar plattor (innehållande lämpligt antibiotikum) av pipettering 50 µL 0,1 M IPTG och 50 µL 20 mg/ml X-GAL på ytan. Gör en master mix om plätering ett stort antal reaktioner. Täck plattorna jämnt med hjälp av en steril glasstav eller glaspärlor och låta plattorna vila vid 37 ° C under minst 15 minuter före plätering bakterier.
Obs: Alternativt lägga till IPTG och X-Gal flytande agar innan plattorna hälls, på 2 mM IPTG och 40 µg/mL X-Gal slutlig koncentration. Lagra dessa plåtar ur direkt ljus som X-Gal är ljuskänsliga.
- Medan celler upptining, förbereda LB-agar plattor (innehållande lämpligt antibiotikum) av pipettering 50 µL 0,1 M IPTG och 50 µL 20 mg/ml X-GAL på ytan. Gör en master mix om plätering ett stort antal reaktioner. Täck plattorna jämnt med hjälp av en steril glasstav eller glaspärlor och låta plattorna vila vid 37 ° C under minst 15 minuter före plätering bakterier.
- På isen, alikvotens 10 µL av behöriga celler för varje reaktion till en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Detta kommer att vara Transformation plattan.
- Tillsätt 1-3 µL av varje reaktion från OutputPlate(s) till motsvarande väl in Transformation plattan och inkubera på is för 5 min.
- Försegla Transformation plattan med självhäftande film och värme chock i en termocykler vid 42 ° C i 30 s. Sedan placera omedelbart plattan på is i 2 min.
- Till de samma brunnarna i omvandling plattan, tillsätt 150 µL av SOC media, försegla med en aluminium självhäftande förslutning och inkubera vid 37 ° C under omskakning vid 900 RPM för 1 hr.
- Tallrik hela innehållet i varje brunn av Transformation plattan på LB-agar plattor beredd i 4.1.1 med en steril glasstav eller glaspärlor för att jämt täcka ytan av plattan. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
5. klon kontroll [2 dagar]
-
Förbereda en eller flera 96 brunnar djupa-väl kultur block med 1,5 mL LB buljong (innehållande lämpligt antibiotikum).
- Liknar steg 2.2, Inokulera de djupa-väl kultur (n) med enstaka vita kolonier från varje LB-agarplatta transformerad reaktioner.
- Försegla de kultur (n) med en gas-permeable tätning och inkubera över natten vid 37 ° C under omskakning vid 900 RPM.
Obs: Modular kloning teknik använder Blåvit screening, så positiva CFUs visas vitt på LB-agar plattan, medan Tom destination vektorer visas blå.
- Isolera plasmid DNA från bakteriekulturer (som i 2.3) och lämna in för Sanger sekvensering att kontrollera kloner.
Representative Results
Här visar vi automatiserat modulär montering av 96 DNA enheter från olika grundläggande DNA delar (figur 1b) använder två automatiserad robot vätskehantering plattformar. Varje transkriptionell enhet är en linjär arrangemang av arrangören, ribosomal bindningsställe, gen och transkriptionell terminator, klonade in en bestämd destination vektor. TUs är en nyckelkomponent i många hierarkiska genetiska krets design28,29,30 och är därför ett naturligt proof of concept för detta tillvägagångssätt. Sekvens-verifierade kloner kan uppnås i ~ 5 dagar från början till slut, och en översikt över arbetsflödet presenterade presenteras i figur 1a.
Använda beskrivs verktyg och protokoll, fångat vi flera mätvärden användbar för att fastställa den optimala montering plattform ges ett definierat antal kloning reaktioner genereras av vetenskapsmannen. Figur 2a visar en jämförelse mellan församlingen reaktionstider över alla tre formerna. Utförandet är den totala tid att slutföra alla pipettering steg som behövs för att montera 96 reaktioner, vilket inkluderar dispensering av alla DNA delar och reagenser. Hands-on tid refererar till den totala tid som en människa var manuellt inblandad i utarbetandet av kloning reaktionerna eller installation av programvaran som körs på flytande handler. Figur 2b jämför kostnaderna mellan de olika metoderna. Redovisade kostnader är för en enda reaktion som utarbetats av varje metod och inkluderar priset för enzymer och disponibel pipettspetsar, ges lägst typiska reaktion volymen (20 µL för flytande handler, 10 µL för manuell, 250 nL för akustiska dispenser). Enda kloner från alla 96 reaktioner för både manuell och flytande handler förberedda uppsättningar var sekvenserade, med en delmängd av 12 sekvenserade för akustiska dispenser reaktioner (figur 2 c). Rätt sekvenser erhölls för 95% av de 96 manuella och flytande handler uppsättningarna. 83% av de akustiska dispenser provundergrupp var korrekta, men de sista två reaktionerna inte ge någon vit kolonier, sannolikt på grund av otillräcklig blandning av droppar efter munstycket av DNA och reagenser var komplett. Figur 2d illustrerar kloning reaktion effektivitetsvinster, mätt som kvoten mellan vita kolonier till totala antalet kolonier, som är jämförbara mellan manuellt (94%) och flytande handler-monterad (84%) reaktioner. Intressant, när skalar ned volymen slutliga reaktion med den akustiska dispensern, märkt vi en markant nedgång i reaktion effektivitet när reaktioner var beredda på volymer mindre än 1 µL (kompletterande Figur1 & kompletterande tabell2). Detta är sannolikt på grund av avdunstning under reaktion termocykling, som kan orsaka en ökning i salt koncentrationerna i reaktionen.
Figur 1. Automatiserad DNA enhet biblioteket församlingen arbetsflöde.
(a) en översikt över experimentella arbetsflödet presenteras i detta arbete. (1) forskare först ladda upp Genbank filer för alla DNA delar & destination vektorer de vill använda. (2) nästa, DNA delar som ska ingå i församlingen väljs. (3) verktyget skapar sedan en plocklista för en automatiserad flytande hanterare, samt platta kartor att hjälpa till med manuell befolkning med DNA delar och enzym mastermix. (4) använder DNA & reagenser plattor, samt den genererade plocklistan, forskare utföra montering av kloning reaktionerna på flytande hanteraren. (5) när du är klar är reaktionerna omvandlas och ströks för efterföljande analys. (b) lista av DNA delar som användes i detta arbete. Totalt tre initiativtagare, tre ribosomala bindande platser, fyra kodande sekvenser, och en transkriptionell terminator användes generera 96 TUs kombinatoriska bibliotek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförelser mellan tre olika reaktion församlingen modaliteter.
(a) reaktion ställtiden för 96 reaktioner monteras manuellt, via en flytande hanterare och en akustisk dispenser. Manuell montering tog 2 h 10 min, varav alla var hands-on tid. Den flytande handler tog en liknande tid (2 tim 6 min) att exekvera kommandon för pipettering, men endast en bråkdel av den tid (5 min) var hands-on. Den akustiska dispensern tog betydligt mindre tid att köra flytande överföringar (5 min) och tog minimala hands-on tid (5 min). (b) pris per enkel kloning reaktion för varje församling metod. I priset ingår kostnaden för enzymer som används, samt pipettspetsar. (c) sekvensering resultat från enstaka kolonier av alla 96 monterade TUs. Andelen rätta kloner var jämförbar över alla montering metoder. Observera att endast en delmängd (12) för full 96 församlingar förvandlades från akustiska dispensern beredd prover. Två reaktioner kunde inte ge någon vit kolonier, sannolikt på grund av otillräcklig blandning av DNA & enzym mastermix droppar i OutputPlate. (d) jämförelse av kloning reaktion effektivitetsvinster mellan manuell och flytande handler förberedda reaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 1. Reaktion effektivitet minskar med sänka reaktionsvolym.
Reaktion effektivitetsvinster släppa markant när skalar ned reaktion volymer nedan 1 µL. Denna trend ses med två olika slutliga DNA koncentrationer; forskare kan dock välja för att använda mindre volymer för att spara på reagens kostnader om lägre effektivitet kan tolereras. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande tabell 1.
Tabell över DNA och ENZYM flytande klass parametrar för olika pipettering av volymer. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande tabell 2.
Reaktion effektivitet beräkningar. Råa CFU nummer ges för 12 av 96 förvandlad reaktioner beredd manuellt och via flytande hanteraren. CFU nummer finns också för testning av mindre slutliga reaktion volymer på den akustiska dispensern. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Sammanfattningsvis, automatisering av komplett DNA enhet skapandeprocessen, från i-silico design till vätskehantering, är en livskraftig mål med befintliga teknik. Programvara och moderna robotics tillåter att skapa arbetsflöden som är kostnadseffektiv, tidseffektiv och skalbara, samtidigt också producerar mer konsekvent reproducerbara resultat än manuella metoder. Medan automation inte kan alltid vara det mest kostnadseffektiva valet för att köra ett protokoll, det förbättrar experimentell reproducerbarhet och frigör värdefull forskare tid. Dock beroende på hårdvaran utnyttjas, kan användning av automation ibland driva kostnaden och körningstid långt under vad som kan uppnås genom konventionella manuella metoder. Dessutom automation fångar protokoll uttryckligen i ett formaliserat sätt förebygga ad hoc, hantverksmässiga, och anekdotiska bästa praxis baserade experiment. Här automatiserad montering av modulära enheter som DNA är visat, och protokoll, elektroniska filer och fysiska DNA resurser behövs för läsaren att utföra dessa, och liknande, experiment på sina egna tillhandahålls. Vi hoppas tillgängligheten av vårt verktyg, och offentliggörandet av detta protokoll kommer att fungera som en resurs och flytta fältet mot en mer öppen och gemensam framtid i området av DNA församling processer och vätskehantering robotics.
Nyttan med automatisering hårdvara är till stor del beroende på konfiguration och funktioner i maskinvaran. Exempelvis använder våra flytande handler systemet flytande deplacement sättet att aspirera och fördela kommandon. Kolvarna att driva systemet vätskan är relativt stora 1 mL sprutor som, medan användbar för ett antal volymer, medför en 2 µL lägre gräns för korrekt dosering av reagenser. Som en följd vi dragit upp den totala volymen av kloning reaktioner ställa upp på flytande hanteraren 20 µL, eftersom varje avstå från kommandot behövde vara ≥2 µL. Detta fördubblades effektivt kostnaden per reaktion för flytande handler-prepped reaktioner, men mängden hands-on tid som krävs för att köra dessa reaktioner var signifikant reducerad. I ett försök att lösa problemet, upprepade vi den reaktion setup för alla 96 reaktioner på en akustisk flytande dispenser. Denna enhet använder ljudenergi för att dispensera vätskan direkt från en platta till en annan, och kan uppnå fördela volymer långt nedan (2.5 nL) vad som är möjligt med vanlig luft deplacement baserat manuella pipetter. Använder denna enhet vi kunnat skala ned den totala volymen av våra reaktioner på 250 nL, en 40-fold minskning jämfört med manuellt beredda reaktioner på 10 µL. På grund av små volymer dispenseras, och bristen på tip förändringar mellan pipettering steg, akustisk dispensern kunde generera samma 96 reaktioner i en bråkdel av tid (< 5 min). De mindre reaktion volymerna även Spara på bortkastade reagenser, eftersom vi vanligtvis bara omvandla 1-3 µL av reaktionen. Som sagt, kan användning av automation hårdvara, i samband med intuitiv programvara, göra generationen av stora mängder DNA församlingen reaktioner tillgängliga för en mycket bredare akademisk publik.
Här visar vi nytta av vår programvaruverktyg, men det finns ett antal funktioner som skulle hjälpa till att bredda dess användbarhet. Först, varje gång verktyget används till att generera en kombinatorisk församling, nya DNA del plattor måste genereras, som kräver vetenskapsmannen att manuellt fylla dessa plåtar för varje församling som kör. Det skulle vara användbart i stället om vetenskapsmannen kan ange platsen för delar i en DNA-tallrik för att användas i församlingen. Detta skulle tillåta användning av hög genomströmning plasmid DNA rening kit eftersom forskare kunde Inokulera kulturer från ett kit som CIDAR MoClo biblioteket, och rena alla prover tillsammans bibehållen väl platsen för varje del som anges i kit. Det andra stöder verktyget för närvarande endast användning av 96 brunnar. För större projekt där flera hundra DNA-enheter måste byggas, får antalet DNA, reagens och destination plattor överstiga däck kapaciteten för flytande hanteraren. Detta problem kan, åtminstone delvis, lindras genom stöd för högre densitet platta format (384 eller 1536-well). Slutligen stöder verktyget för närvarande endast en enda typ av flytande handler och strategi för DNA-församling. Det är relativt lätt att konvertera verktyg-producerade flytande handler instruktionerna till en akustisk dispenser format med kalkylprogram, hoppas vi att expandera inbyggt stöd till många olika flytande hanterare som kraftigt skulle bredda dess tillämplighet, som vill kompatibilitet med andra gemensamma DNA monteringstekniker Gibson församling31.
En avgörande del av denna automatiserad montering ekosystem är en uppsättning mjukvaruverktyg som översätter höga församlingen planer till automation vänliga protokoll som uttryckligen är schemalagda att köras på vätskehantering robotar. Även om det finns ett antal verktyg som tillåter forskare att utforma församlingar i-silico inklusive Benchling, MoClo Planner och Raven32, har få förmågan att översätta dessa formgivningar till körbara instruktioner att köra på en vätska handler. Att avsluta, arbetar som PR-PR Automation och dockspelare33,34,35 har börjat att göra dessa verktyg tillgängliga. Kommersiella enheter arbetar i detta område dessutom tittar på sätt att införa ”cloud labs” som ger experimentella tjänster till stora grupper av slutanvändare via automation. Protokollet beskrivs i detta dokument skulle kunna tjäna som en bit av någon av dessa insatser avses de presenteras som en tjänst.
Även automatiserad montering av DNA enheter är av omedelbar och uppenbart värde för syntetisk biologi, är våra protokoll användbart för större gemenskapen av molekylärbiologer samt. Automatisera DNA-församling tillåter ett stort antal kända, men liknande, genetiska enheter skapas parallellt och kan aktivera snabb syntesen av uttrycket bibliotek för screening och testning i drogen utvecklingsstudier. Vi hoppas att vår programvaruverktyg kommer att göra större kombinatoriska-baserad DNA församlingen ansträngningar mer tillgänglig, och tjäna som en användbar resurs för den syntetisk biologi, såväl som större akademiska världen.
Disclosures
Densmore är VD och medgrundare av galler Automation, Inc. Timmons och McCarthy är galler anställda. Gallret gör programvaror och tjänster för automatisering av många av processen som beskrivs.
Acknowledgments
Vi tackar Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez och Johnson Lam för arbete på dockspelare projektet, samt Swati Carr, Rachael Smith och Thomas Costa för hjälp med detta manuskript. Detta arbete finansierades av NSF karriär Award #1253856. Den finansieras också av NSF expeditioner i Computing Award #1522074.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware / Software | |||
| Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
| Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
| Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
| Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
| ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
| Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resources | |||
| mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
| CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
| CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labware | |||
| 50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
| 2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
| Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
| Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
| Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
| Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
| PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
| T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
| BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
| BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
| T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
| Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
| Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
| SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
| LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
| LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
| Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | |||
| Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
| Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
References
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
- Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
- Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
- Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
- Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
- Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
- Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
- Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
- Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
- Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
- Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
- Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
- Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
- Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
- Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
- Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
- Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
- Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
- Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
- Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).
