Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatiseret robot flydende håndtering forsamling af modulære DNA enheder

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54703
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

Summary

Her, er en automatiseret arbejdsproces kan udføre modulære DNA "enhed" forsamling med en modulær kloning DNA forsamling metode på væske-håndtering robotter præsenteret. Protokollen bruger en intuitiv software-værktøj til at generere flydende handleren valglister for kombinatorisk DNA enhed bibliotek generation, som vi viser ved hjælp af to flydende håndtering platforme.

Abstract

Seneste fremskridt inden for modulære DNA forsamling teknikker har aktiveret syntetiske biologer at teste betydeligt mere af den tilgængelige "designrummet" repræsenteret af "enheder" lavet som kombinationer af individuelle genetiske komponenter. Men manuel montage af så stort antal enheder er tidskrævende, fejlbehæftet og dyrt. Den stigende raffinement og omfanget af syntetisk biologi forskning nødvendiggør en effektiv og reproducerbar måde til at rumme store, komplekse og høj overførselshastighed enhed konstruktion.

Her, er en DNA forsamling protokollen ved hjælp af Type-IIS begrænsning liv1975 baseret modulære kloning (MoClo) teknik automatiseret på to væske-håndtering robot platforme. Automatiseret væske-håndtering robotter kræver omhyggelig, ofte gange kedelige optimering af pipettering parametre for væsker af forskellig viskositet (f.eks. enzymer, DNA, vand, buffere), såvel som eksplicit programmering for at sikre korrekte aspiration og udlevering DNA dele og reagenser. Dette gør manuelle script skriftligt til komplekse forsamlinger lige så problematisk som manuel DNA forsamling, og nødvendiggør et software-værktøj, der kan automatisere script generation. Til dette formål har vi udviklet en web-baseret softwareværktøj, http://mocloassembly.com, til at generere kombinatorisk DNA enhed biblioteker fra DNA basisdele uploadet som Genbank filer. Vi giver adgang til værktøjet, og en eksportfil fra vores flydende handleren software, som omfatter optimeret flydende klasser, labware parametre og dæks-layout. Alle DNA dele brugt er tilgængelige via Addgene, og deres digitale kort kan tilgås via Boston University BDC-ICE registreringsdatabasen. Sammen, giver disse elementer et fundament for andre organisationer at automatisere modulære kloning eksperimenter og lignende protokoller.

Den automatiserede DNA forsamling arbejdsproces præsenteres her giver repeterbare, automatiske, høj overførselshastighed produktion af DNA enheder, og reducerer risikoen for menneskelige fejl som følge af gentagne manuelle pipettering. Sequencing data viser de automatiserede DNA forsamling reaktioner genereret fra denne arbejdsproces er ~ 95% korrekte og kræver så lidt som 4% som meget hands-on tid, i forhold til manuel reaktion forberedelse.

Introduction

De tidligste syntetiske biologiske genetiske enheder såsom Collins vippekontakt1 og Elowitz repressilator2 viste, at biologiske systemer kunne være frem manipuleret til at have specifikke, deterministiske funktioner. Siden da, syntetiske biologer har stræbt efter at ingeniør levende systemer til at udføre gradvist mere komplekse funktioner i tjenesten af biomaterialer3, biotherapeutics4,5,6, biobrændsel 7,8, og biosensing programmer9,10,11. At opnå disse programmer gennem kombinere modulært DNA "dele" i "enheder" med specifik funktionalitet har været et af de vigtigste mål for syntetisk biologi. Denne proces skal skalere, skal der være en teknik, der tillader oprettelsen af komplekse enheder fra store biblioteker af dele i en tid-effektive, omkostningseffektive, og vigtigst, reproducerbar måde.

Sådan en ekspansiv forsamling proces er berettiget, fordi øjeblikket feltet mangler en komplet forståelse af de regler for vellykket biologiske systemdesign og sammensætning. Dette forværres af tilstrækkeligt karakteriseret DNA dele12, manglende kompatibilitet og composability dele13og uventet, uønskede vekselvirkninger mellem genetiske komponenter inden for syntetiske enheder14, 15. i mangel af pålidelige prognosemodeller, funktionelle syntetiske genetiske enheder ankom ved trial and error, som kræver snesevis eller endda hundredvis af input-output signalstyrke varianter af en bestemt enhed er screenet og "bedst" er valgt for sammensætning med downstream elementer16. Mens moderne standardiserede DNA forsamling metoder som Golden Gate17, og modulære kloning gør18,19,20 denne proces lettere, en eksperimenterende ekspert er stadig forpligtet til at udføre hver protokol. Som syntetiske enheder vokser i størrelse og kompleksitet, den samlede tilgængelige designrum vil blive for stor for at opbygge og teste manuelt21, og processen vil være for håndværksmæssige for nogen betydelige fremskridt, som er replikerbar skal foretages i feltet.

Indtil fremkomsten af syntetisk biologi og biologiske del repositories som iGEM dele registreringsdatabasen (http://partsregistry.org), blev JBEI opgørelse af Composable elementer22og SynBioHub23, genetiske dele ikke gemt i nogen standardiseret forsamling format. Kun en lille håndfuld dele skulle klones pr. projekt, og således, mængden af kloning gjort var lille, og realiseringen af en samlet enhed blev opnåelige og trivielle i forhold til de faktiske forskningsmål. Molekylær klon blev ofte ad hoc- og udføres ved hjælp af begrænsning fordøjer baseret på begrænsning websted og liv1975 tilgængelighed ikke efter nogen standardiseret proces. Manglen standardisering gjorde det upraktisk at automatisere enhver kloning protokol, som det var usandsynligt, at den næste kloning reaktion ville følge en identisk protokol. Derudover kræves automatisere DNA forsamling betydelige monetær investering i udstyr (flydende håndtering af robotter og deres tilhørende software og labware infrastruktur) samt tid investeringen for generation af vejledningen at udvikle nøjagtige parametre til håndtering af de forskellige klasser af væsker behandles og den præcise serie af instruktioner til at køre disse protokoller. Lille skala kloning indsats ikke retfærdiggøre disse udgifter. Kombinationen af større, mere komplekse genetiske enhed design kombineret med standardiserede forsamling protokoller24,25 skaber et miljø, hvor automatisering af processerne er meget praktiske. Lave omkostninger robotteknologi som Opentrons OT-One26 dukker også op som tillader endda beskedent finansierede labs for at få adgang til denne teknologi. Derudover "cloud" laboratorier27 herunder Transcriptic og smaragd Cloud Lab samt akademiske "biofoundries" som Edinburgh genom støberi, UIUC iBioFab, og MIT-bredt støberi, seletøj robotteknologi til at samle forskellige sæt af design for en række kunder hurtigt og gentagne gange samtidig opretholde en fælles repository af grundlæggende DNA primitiver og forsamling teknologier til fremtidige ordrer.

En af de største udfordringer i automatisere processen med DNA forsamling er generation af pipettering kommandoer til flydende handleren. Mens softwareinterfaces for disse enheder er typisk let at bruge, komplekse kræver pipettering instruktioner som dem, der er nødvendige for kombinatorisk DNA forsamling videnskabsmand udtrykkeligt angive hver aspirat og dispensere kommandoen manuelt. Dette skaber en stor flaskehals i arbejdsprocessen, og efterlader script generation proces sårbare over for de samme pipettering fejl som hvis forsamlingen blev gennemført manuelt. Dette nødvendiggør et software-værktøj, der kan automatisere alle dele af denne proces, fra at designe biblioteket enhed at generere pipettering instruktionerne, og giver forskeren med plade/reagens opsætninger skal samle dem. I dette arbejde udnytter vi vores softwareværktøj hen til automatisere design af en lille kombinatorisk DNA enhed bibliotek, samt blanding af reagenser (buffer, vand, enzymer) og DNA dele (figur 1b) til 96 one-pot modulære DNA forsamling reaktioner. Brugen af værktøjet kræver ingen forudgående programmeringserfaring, skalerbare og høj overførselshastighed, og kombinatorisk som standard. Vi viser, at kloning reaktioner forberedt på to forskellige automatiseret flydende håndtering platforme udbytte korrekte sekvens-verificerede kloner med sammenlignelige frekvens reaktioner forberedt manuelt (95%), og med betydeligt mindre hands-on tid.

Protocol

1. Angiv dele anvendes i DNA enhed bibliotek og generere bruger/væske handleren vejledningen [15 min]

  1. Benytter hvilken som helst web gennemser, navigere hen til mocloassembly.com og uploade Genbank filer for alle DNA dele, der skal medtages i kombinatorisk DNA enhed design.
  2. Når alle filer er blevet uploadet, skal du vælge ønskede DNA dele og trækker dem over på den tomme lærred, placere en del typer i den tiltænkte endelige rækkefølge af DNA dele.
    Bemærk: Samlinger af dele, samt enkelte dele, kan vælges og anbringes på lærredet. Også, bestille DNA dele, således at 5' og 3' hænger ud for hver del match.
  3. Klik på 'Samle' nederst til højre på siden.
    Bemærk: Værktøjet vil kun generere gyldige, bygbar forsamlinger baseret på fire basepar udhæng, der flankerer hver del på fordøjelsen med BsaI enzym. Hvis ingen buildable DNA enheder findes baseret på de dele, der er uploadet af videnskabsmanden, angiver værktøjet at ingen forsamlinger ikke blev fundet.
  4. Gå til fanen 'Planer' og downloade filer genereret af værktøjet. Disse filer vil omfatte:
    1. Læsbar plade kort til videnskabsmand til at forberede DNA-prøver, samt reagenser, der er nødvendige for reaktionerne
    2. En» valgliste «for flydende handleren
    3. Fuldt kommenteret Genbank filer for alle DNA enheder samles
      Bemærk: Flydende håndtering af arm positionering ved adgang til eventuelle nye labware skal afprøves. Se producentens manualen for detaljerede instruktioner om hvordan man justerer den pipettering arm positionering i X, Y og Z akser som nødvendigt.

2. klargør Plasmid DNA og reagenser for forsamling [3 dage]

  1. [Dag 1] Ved hjælp af en steril podning loop og arbejder i nærheden af åben ild eller i en laminar flow hætte, streak ud bakteriel glycerol bestande på LB-agar plader suppleres med passende antibiotika. Gøre dette til alle nødvendige dele af DNA, og sørg for at sterilisere loop mellem hver prøve. Inkuber plader ved 37 ° C natten over.
    Bemærk: Frosne bakteriel glycerol bestande skal holdes på is så meget som muligt. Gentagne fryse-tø cykler lavere rentabilitet af bestanden og bør undgås.
  2. [Dag 2] Med en steril pipette tip, tandstikker eller podning løkke, og arbejder i nærheden af åben ild eller i en laminar flow hætte, podes 3 mL LB bouillon (suppleres med passende antibiotika) med en enkelt koloni fra LB-agar plader forberedt i 2.1. Inkuber kulturer natten over ved 37 ° C under omrystning på 300 RPM.
  3. [Dag 3] Rense plasmid DNA fra bakteriel kulturer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig mini prep plasmid rensning kit.
  4. Ved hjælp af den angivne MoClo_Setup.xlsx-fil, fortyndes hver prøve af plasmid DNA til en koncentration af 20 fmol/µL i vand eller TE buffer.
  5. Efter plade kort over den PDF fil genereret af værktøjet forsamling, fortyndet sted den angivne mængde af hver DNA del i passende brønden på en fuld-skirted 96-brønd PCR plade. Hold denne SetupPlate på is, indtil det skal bruges, eller segl med en folie adhesive forsegling og opbevares ved-20 ° C.
  6. På is, forberede reaktion mastermix med følgende komponenter: for hver 20 µL af reaktion tilføje 2 µL af 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL af T4 DNA Ligase (HC) og 1 µL af BsaI enzym. En regnemaskine ark er inkluderet i filen MoClo_Setup.xlsx til at hjælpe med dette.
    1. Distribuere enzym mastermix i de passende wells af en ny fuld-skirted 96-brønd PCR plade, efter plade kort for ReagentPlate i den genererede PDF. Holde denne ReagentPlate på is eller på en 96-godt kolde-blok.
      Bemærk: ReagentPlate tilberedes kun, når du er klar til at køre forsamlingen på flydende handleren.

3. Kør forsamling Script på den flydende Handler [variabel]

  1. Placere SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (på en 96-godt kolde-blok), og det nødvendige antal tomme fuld-skirted 96-brønd PCR plader på dækket af den flydende handleren. Den tomme skilte vil være OutputPlate(s) hvor Reaktionerne er samlet.
  2. Forberede den flydende handleren styre software ved at oprette forekomster af hver prøve og reagens plade forberedt, og sørg for at nævne dem nøjagtigt som de vises på plade maps genereres af mocloassembly.com, herunder en lavpunktet af rene, deioniseret vand mærket ' Reservoir'.
  3. Bruge kommandoen 'Worklist' i control-software, indlæse filen .gwl genereret af vores softwareværktøj, efterfulgt af en anden 'Worklist' kommando, som vil udføre filen .gwl indlæses i den første kommando.
  4. Udfør scriptet ved hjælp af controller-software 'Opstille' befale.
    Bemærk: Tillad altid robot flydende handleren til at afslutte udførelsen af et script før du prøver at få adgang til dæksplads.
  5. Fjerne alle plader fra flydende handler dæk. Resterende DNA kan blive frelst ved forsegling SetupPlate(s) med aluminium forsegling film og opbevaring ved-20 ° C. Forsegle OutputPlate(s) med selvklæbende folie, sted i en thermocycler eller varme-blok og køre med parametrene følgende cyklus:
    37 ° C i 2 timer, 50 ° C i 5 min, 80 ° C i 10 min, holde ved 4 ° C
    Bemærk: Når reaktion termocycler er fuldført, OutputPlate(s) kan opbevares ved-20 ° C indtil de er klar til at blive omdannet.

4. omdanne reaktioner [1 dag]

  1. Tø det nødvendige antal kompetente E. coli celle delprøver behov (10 µL/reaktion) på is.
    Bemærk: For at bevare steriliteten, følgende trin skal udføres i nærheden af åben ild eller inden for en laminar flow hætte.
    1. Mens celler optøning, forberede LB-agar plader (indeholdende relevante antibiotikum) af pipettering 50 µL af 0,1 M IPTG og 50 µL af 20 mg/mL X-GAL på overfladen. Gøre en master mix, hvis plating et stort antal reaktioner. Pels plader jævnt ved hjælp af et sterilt glasstang eller glasperler og tillade plader til hvile ved 37 ° C i mindst 15 min før plating bakterier.
      Bemærk: Tilføje Alternativt, IPTG og X-Gal til flydende agar, før plader er hældt på 2 mM IPTG og 40 µg/mL X-Gal endelige koncentration. Opbevar disse plader ud af direkte lys, som X-Gal er lysfølsomt.
  2. På is, alikvot 10 µL af kompetente celler for hver reaktion i en ny 96-brønd PCR plade. Dette vil være den Transformation plade.
  3. Tilføje 1-3 µL af hver reaktion fra OutputPlate(s) til de tilsvarende godt i Transformation plade og inkuberes i isbad i 5 min.
  4. Forsegle Transformation plade med selvklæbende film og varme chok i en thermocycler på 42 ° C til 30 s. Derefter straks pladen anbringes i isbad i 2 min.
  5. De samme pladens huller Transformation, Tilføj 150 µL af SOC medier, forsegle med en aluminium adhesive forsegling og inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 900 omdr. / min. til 1 time.
  6. Plade fuld indholdet af hver brønd af Transformation pladen på LB-agar plader forberedt i 4.1.1 ved hjælp af et sterilt glasstang eller glasperler til jævnt pels overfladen af pladen. Inkuber plader ved 37 ° C natten over.

5. klon verifikation [2 dage]

  1. Forberede en eller flere 96-brønd deep-godt kultur blokke med 1,5 mL LB bouillon (indeholdende relevante antibiotika).
    1. Svarende til trin 2.2, podes deep-godt kultur nummersekvens med enkelt hvid kolonier fra hver LB-agar plade af transformerede reaktioner.
    2. Forsegle kultur nummersekvens med en gas-gennemtrængelige segl og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning på 900 RPM.
      Bemærk: Modular kloning teknikken udnytter blå-hvid screening, så positiv CFUs vises hvide på LB-agar plade, mens Tom destination vektorer vises blå.
  2. Isolere plasmid DNA fra bakteriel kulturer (som i 2.3) og indsende til Sanger rækkefølge for at kontrollere kloner.

Representative Results

Her viser vi automatiseret modulære samling af 96 DNA enheder fra forskellige DNA basisdele (figur 1b) ved hjælp af to automatiseret robot flydende håndtering platforme. Hver transcriptional enhed er en lineær arrangement af promotor, ribosomale bindingssted, gen og transcriptional terminator, klonet til en bestemt destination vektor. TUs er en nøglekomponent i mange hierarkisk genetiske kredsløb design28,29,30 og er derfor en naturlig proof of concept for denne tilgang. Sekvens-verificerede kloner kan opnås i ~ 5 dage fra start til slut, og en oversigt over de præsenteres arbejdsgang er præsenteret i figur 1a.

Ved hjælp af beskrevet værktøj og protokollen, fanget vi flere målinger nyttige til at bestemme den optimale forsamling platform givet et defineret antal kloning reaktioner skal genereres af videnskabsmanden. Figur 2a illustrerer en sammenligning mellem forsamling reaktionstider på tværs af alle tre modaliteter. Kørselstid er den samlede tid til at fuldføre alle pipettering nødvendige skridt for at samle 96 reaktioner, som omfatter udlevering af alle DNA dele og reagenser. Hands-on gang refererer til den samlede tid et menneske var manuelt involveret i forberedelsen af kloning reaktioner eller installation af softwaren kører flydende handleren. Figur 2b sammenligner omkostninger mellem de forskellige metoder. Omkostninger præsenteret for en enkelt reaktion udarbejdet af hver metode og omfatter prisen på enzymer og engangs pipette tips, betragtning af den laveste typiske reaktion (20 µL til flydende handleren, 10 µL til manuel, 250 nL for akustisk dispenser). Enkelt kloner fra alle 96 reaktioner for både manuel og flydende handler-udarbejdet sæt blev sekventeret, med et undersæt af 12 sekventeret for akustisk dispenser reaktioner (figur 2 c). Korrekte sekvenser blev opnået for 95% af de 96 sæt, manuel og flydende handleren. 83% af akustiske dispenser prøve delmængde var korrekte, men de sidste to reaktioner undladt at give nogen hvide kolonier, sandsynligvis på grund af utilstrækkelige blanding af dråber efter udlevering af DNA og reagenser var komplet. Figur 2d illustrerer kloning reaktion effektivitetsfordele, som målt ved forholdet mellem hvide kolonier til samlede antal kolonier, som er sammenlignelige mellem manuelt (94%) og flydende handler-samlet (84%) reaktioner. Interessant, når skalering ned den endelige reaktion volumen med den akustiske dispenser, bemærket vi en markant nedgang i reaktion effektivitet når reaktioner var forberedt på mængder mindre end 1 µL (supplerende figur 1 & supplerende tabel 2). Dette er sandsynligvis på grund af fordampning under reaktion termocycler, som kan forårsage en stigning i salt koncentrationer i reaktionen.

Figure 1
Figur 1. Automatiseret DNA enhed bibliotek forsamling arbejdsproces.
(a) en oversigt over den eksperimentelle arbejdsproces præsenteret i dette arbejde. (1) forskere først uploade Genbank filer for alle DNA dele & destination vektorer de ønsker at bruge. (2) Dernæst er DNA dele skal medtages i forsamlingen valgt. (3) værktøjet vil derefter generere en valgliste for en automatiseret flydende handler, samt plade kort til at hjælpe med manuel befolkning med DNA dele og enzym mastermix. (4) ved hjælp af DNA & reagenser plader, samt den genererede valgliste, forskere udføre montage af kloning reaktioner på den flydende handleren. (5) når du er færdig, er Reaktionerne forvandlet og forgyldt for downstream analyse. (b) liste af DNA dele anvendes i dette arbejde. I alt tre initiativtagere, tre ribosomale bindende websteder, fire kodning sekvenser, og én transcriptional terminator blev brugt generere kombinatorisk biblioteket af 96 TUs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Sammenligninger på tværs af tre forskellige reaktion forsamling modaliteter.
(a) reaktion opstillingstiden for 96 reaktioner samlet manuelt, via en flydende handler, og ved en akustisk dispenser. Manuel forsamling tog 2 h 10 min, som alle var hands-on tid. Flydende handleren tog et tilsvarende beløb af tid (2 h 6 min) til at udføre kommandoerne pipettering, men kun en brøkdel af tid (5 min) var hands-on. Den akustiske dispenser tog betydeligt mindre tid til at udføre flydende overførsler (5 min) og tog minimal hands-on tid (5 min). (b) pris pr enkelt kloning reaktion for hver forsamling metode. Denne pris inkluderer omkostningerne til enzymer er anvendt, og pipette tips. (c) sekventering resultater fra enkelt kolonier af alle 96 samlet TUs. Procenten af korrekte kloner var sammenlignelige på tværs af alle montage metoder. Bemærk, at kun en delmængde (12) fuld 96 forsamlinger blev omdannet fra den akustiske dispenser forberedt prøver. To reaktioner kunne ikke give nogen hvide kolonier, sandsynligvis på grund af utilstrækkelige blanding af DNA & enzym mastermix dråber i OutputPlate. (d) sammenligning af kloning reaktion effektivitetsgevinster mellem manuel og flydende handleren forberedt reaktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Reaktion effektivitet falder med sænkning reaktion volumen.
Reaktion effektivitetsgevinster falde markant, når skalering ned reaktion mængder under 1 µL. Denne tendens ses med to forskellige endelige DNA koncentrationer; Men forskerne kan vælge for at bruge mindre mængder til at spare på udgifterne til reagens hvis lavere effektivitet kan tolereres. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1.
Tabel af DNA og ENZYM flydende klasse parametre for forskellige pipettering diskenheder. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2.
Reaktion effektivitet beregninger. Rå CFU tal er givet for 12 af de 96 transformerede reaktioner forberedt manuelt og via den flydende handler. CFU numre er ligeledes mulighed for afprøvning af mindre endelige reaktion diskenheder på den akustiske dispenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Afslutningsvis, automatisering af den komplette DNA enhed skabelsesprocessen, fra i siliciummangan design til flydende håndtering, er et levedygtigt mål med aktuelt eksisterende teknologi. Software og moderne robotteknologi mulighed for skabelse af arbejdsprocesser, der er omkostningseffektiv, tid-effektive og skalerbare, mens der også producerer mere konsekvent reproducerbare resultater end manuelle metoder. Mens automation ikke kan altid være det mest omkostningseffektive valg for udførelse af en protokol, det forbedrer eksperimentelle reproducerbarhed og frigør værdifulde forsker tid. Imidlertid afhængigt af hardwaren udnyttet, kan brug af automatisering undertiden drev omkostninger og udførelsestid langt under hvad der kan opnås gennem konventionelle manuelle metoder. Derudover automation indfanger protokoller udtrykkeligt i et formaliseret måde at forhindre ad hoc-, håndværksmæssige, og anekdotiske bedste praksis baseret eksperimenter. Her den automatiserede forsamling af modulære DNA enheder er påvist, og protokollen, elektroniske filer og fysiske DNA ressourcer nødvendig for læseren at udføre disse og lignende, eksperimenter på deres egen leveres. Vi håber, at tilgængeligheden af vores værktøj, og offentliggørelse af denne protokol vil tjene som en ressource og flytte feltet mod en mere gennemsigtig og fælles fremtid inden for DNA forsamling processer og flydende håndtering af robotteknologi.

Nytten af automatisering hardware er i høj grad afhængig af konfiguration & funktionerne i denne hardware. For eksempel, bruger vores flydende handleren systemet væske forskydning til at betjene aspirat og dispensere kommandoer. Stemplerne at drive system væske er relativt store 1 mL sprøjter, som, mens nyttigt for en vifte af diskenheder, pålægger en 2 µL nedre grænse for nøjagtig udlevering af reagenser. Som en konsekvens, vi skaleret op det samlede volumen af kloning reaktioner sat op på den flydende hændelseshandler 20 µL, da hver dispensere kommando skulle være ≥2 µL. Dette fordoblet faktisk prisen per reaktion for flydende handler-prepped reaktioner, men mængden af hands-on tid kræves for at udføre disse reaktioner blev reduceret betydeligt. I et forsøg på at løse dette problem, gentaget vi opsætningen reaktion for alle 96 reaktioner på en akustisk flydende dispenser. Denne enhed bruger sund energi for at uddele væske direkte fra den ene plade til den anden, og kan opnå dispensere diskenheder langt nedenfor (2,5 nL) hvad der er muligt med standard air deplacement baseret manuel pipetter. Du bruger denne enhed, vi var i stand til at skalere ned det samlede volumen af vores reaktioner på 250 nL, en 40-fold reduktion i forhold til manuelt indstillet reaktioner af 10 µL. På grund af de små mængder udleveret, og manglen på tip ændringer mellem pipettering trin, akustisk dispenseren var i stand til at generere de samme 96 reaktioner i en brøkdel af tid (< 5 min). De mindre reaktion mængder også spare på spildt reagenser, da vi omdanne typisk kun 1-3 µL af reaktionen. Når det er sagt, kan brug af automatisering hardware, sammenholdt med intuitiv software, stille generation af stort antal DNA forsamling reaktioner en meget bredere akademisk publikum.

Her, påvise vi nytten af vores softwareværktøj, men der er en række funktioner, som vil hjælpe med at udvide sin nytte. Først, hver gang værktøjet bruges til at generere en kombinatorisk forsamling, nye DNA en del plader skal genereres, der kræver videnskabsmanden til at manuelt udfylde disse plader for hver assembly, køres. Det ville være nyttigt, i stedet, hvis forskeren kan angive placeringen af dele i en DNA plade skal anvendes i forsamlingen. Dette ville tillade brug af høj overførselshastighed plasmid DNA oprensning kits, da forskere kunne podes kulturer fra et kit ligesom CIDAR MoClo bibliotek, og rense alle prøver sammen samtidig med at nå placeringen af hver del, angivet i sættet. For det andet understøtter værktøjet i øjeblikket kun brugen af 96-brønd plader. For større projekter, hvor flere hundrede DNA enheder skal bygges, overstige antallet af DNA, reagens og destination plader dæk kapacitet af flydende handleren. Dette problem kan, i det mindste delvis afhjælpes ved støtte til højere tæthed plade formater (384 eller 1536-godt). Endelig, værktøjet understøtter i øjeblikket kun en enkelt type af flydende handleren og DNA forsamling strategi. Mens det er relativt nemt at konvertere instruktionerne værktøj-produceret flydende handleren til en akustisk dispenser format ved hjælp af regneark software, håber vi at udvide understøttelse til mange forskellige flydende handlere, som ønsker høj grad udvide sin anvendelighed som ønsker kompatibilitet med andre almindelige DNA forsamling teknikker Gibson forsamling31.

En vigtig del af denne automatiserede forsamling økosystem er en række software-værktøjer, der giver sig udslag på højt niveau forsamling planer i automatiseringen venlig protokoller, der er udtrykkeligt planlagt til at køre på flydende håndtering robotter. Selvom en række software-værktøjer, der giver forskere til at designe forsamlinger i siliciummangan herunder Benchling, MoClo Planner og Raven32, har få evnen til at omsætte disse designs til eksekverbare instruktioner til at køre på en væske handleren. Til at afslutte, arbejde som PR-PR automatisering og dukkefører33,34,35 er begyndt at gøre disse funktioner tilgængelige. Derudover ser kommercielle enheder arbejder i dette område på måder at indføre "cloud labs", som giver eksperimentel tjenester til store grupper af slutbrugere via automatisering. Den protokol, der er skitseret i dette dokument kan tjene som et stykke af nogen af disse bestræbelser de præsenteres som en service.

Mens automatiserede forsamling af DNA-enheder er af umiddelbar og indlysende værdi for syntetisk biologi, er vores protokol nyttigt for de større samfund af molekylærbiologer samt. Automatisere DNA forsamling giver stort antal kendte, men lignende, genetiske enheder skal oprettes i parallel og kan aktivere hurtig syntesen af udtryk biblioteker for screening og test i stof udviklingsstudier. Vi håber at vores softwareværktøj vil gøre større kombinatorisk-baseret DNA forsamling indsats mere tilgængelige, og tjene som en nyttig ressource for både den syntetiske biologi, samt større akademiske samfund.

Disclosures

Densmore er formand og medstifter af gitter Automation, Inc. Timmons og McCarthy er Lattice medarbejdere. Gitter gør software og tjenester til automatisering af mange af de beskrevne proces.

Acknowledgments

Vi takker Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez og Johnson Lam for arbejde på dukkefører projekt, samt Swati Carr, Rachael Smith og Thomas Costa for hjælp med dette håndskrift. Dette arbejde blev finansieret af NSF karriere Award #1253856. Det er også finansieret af NSF ekspeditioner i Computing Award #1522074.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot Tecan Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) Tecan Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550 Labcyte Acoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT Sorvall Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro Eppendorf 950040015 Thermocycler with 96-well heat block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath Torrey Pines Scientific Heating/Chilling block for EVO 150 deck
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418 Eppendorf 5418000017 Stardard 18-well microcentrifuge
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name Company Catalog Number Comments
Resources
mocloassembly.com Lattice Automation Web-tool for combinatorial DNA assembly
mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit AddGene 1000000059 Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry CIDAR Lab Registry of plasmid DNA maps
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name Company Catalog Number Comments
Labware
50 μL Conductive Tips Tecan 30 057 818 Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates USA Scinetific 5678-0285 Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scinetific 1615-5599 Disposable microcentrifuge tubes
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane Sigma-Aldrich Z763624-100EA Breathable sealing membrane for bacterial culture plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates GeneMate T-3183-2 PCR plates used for all steps
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates GeneMate T-2451-1 Alluminum seals for PCR plate storage
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates GeneMate T-2450-1 Plastic seals for PCR plates during cycling
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler Eppendorf 22510525 96-well cold block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Sciences 2160250 Plasmid DNA purification kit
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC) Promega M1794 High concentration T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme New England Biolabs R0539L BbsI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme New England Biolabs R0535L BsaI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack Promega C1263 10x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Zymo Research I1001-25 0.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) Zymo Research X1001-25 20 mg/ml X-GAL solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate Zymo Research A1003-25 35 mg/ml Kanamycin solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt) Fisher BP26481 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media Teknova S0225 Powder media used to make SOC broth
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media Sigma-Aldrich L3022-1KG Powder media used to make LB broth
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media Sigma-Aldrich L2897-1KG LB with agar mix used for making solid media plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells Bioline BIO-85027 High efficiency chemically competent E. coli cells
http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name Company Catalog Number Comments
Primers
Primer VF 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
  2. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
  3. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  4. Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  5. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  6. Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
  7. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  8. Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
  9. Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
  10. Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
  11. Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
  12. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  13. Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
  15. Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
  16. Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
  17. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
  18. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
  19. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
  20. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  21. Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
  22. Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
  23. Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
  24. Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
  25. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
  27. Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
  28. Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
  29. Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
  30. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  31. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  32. Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
  33. Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
  34. Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
  35. Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 130 syntetisk biologi automatiseret flydende håndtering robotteknologi modulære kloning automatiseret DNA forsamling kombinatorisk bibliotek forsamling biofoundry
Automatiseret robot flydende håndtering forsamling af modulære DNA enheder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L.,… More

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L., Timmons, J., Densmore, D. M. Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices. J. Vis. Exp. (130), e54703, doi:10.3791/54703 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter