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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54703
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

Summary

Hier ist ein automatisierte Workflow auszuführenden modulare DNA "Gerät" Montage mit einem modularen DNA Montage Klonmethode auf Liquid-Handling-Roboter präsentiert. Das Protokoll verwendet eine intuitive Software-Werkzeug zur Erzeugung von liquid Handler Auswahllisten für kombinatorische DNA Bibliothek Gerätegeneration, die wir zeigen zwei liquid Handling-Plattformen verwenden.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der modularen DNA Montagetechniken synthetischen Biologen testen aktiviert haben deutlich mehr der zur Verfügung stehenden "Design Space" vertreten durch "Geräte" als Kombinationen von einzelnen genetischen Komponenten erstellt. Manuelle Montage einer solch großen Zahl von Geräten ist jedoch zeitaufwendig, fehleranfällig und teuer. Die zunehmende Komplexität und Skala der synthetischen Biologie Forschung erfordert eine effiziente und reproduzierbare Möglichkeit, umfangreiche, komplexe und hohen Durchsatz Geräteaufbau unterzubringen.

Hier ist ein DNA-Montage-Protokoll mit der Typ-IIS Einschränkung Endonuklease basierten modularen Klonen (MoClo) Technik auf zwei Liquid-Handling-Roboter-Plattformen automatisiert. Automatisierte Liquid-Handling-Roboter erfordern eine sorgfältige, oft langwierige Optimierung der Pipettier Parameter für Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten (z.B. Enzyme, DNA, Wasser, Puffer), sowie explizite Programmierung korrekt Anspruch darauf und Abgabe DNA-Teile und Reagenzien. Dies macht manuelle Skript schreiben für komplexe Baugruppen genauso problematisch wie DNA Handbestückung und erfordert ein Softwaretool, das Skript Generation automatisieren kann. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine Web-basierte Software-Tool, http://mocloassembly.com, zur Erzeugung von kombinatorischen DNA Gerätebibliotheken aus DNA Grundbauteile als Genbank Dateien hochgeladen. Wir bieten Zugriff auf das Tool, und eine Exportdatei aus unserer liquid Handler-Software umfasst optimiert flüssige Klassen, Labware Parameter und Deckslayout. Alle verwendeten DNA-Teile sind über Addgene erhältlich, und ihre digitalen Karten können über die Boston University BDC ICE Registrierung zugegriffen werden. Zusammen bilden diese Elemente ein Fundament für andere Organisationen, modulare Klonen Experimente und ähnliche Protokolle zu automatisieren.

Die automatisierte DNA Montage Workflow hier vorgestellten ermöglicht wiederholbare, automatisierte Hochdurchsatz-DNA-Geräte und reduziert das Risiko menschlichen Versagens durch sich wiederholende manuelle Pipettieren. Sequenzierung Daten zeigen die automatisierte DNA Montage Reaktionen aus diesen Workflow generiert sind ~ 95 % richtig und so wenig wie 4 % als viel praktische Zeit erfordern, im Vergleich zu manuellen Reaktion Vorbereitung.

Introduction

Die frühesten synthetischen biologischen genetischen Geräte wie Collins Kippschalter1 und Elowitz Repressilator2 gezeigt, dass biologische Systeme nach vorne entwickelt werden könnte, um spezifische, deterministische Funktionen haben. Seitdem haben die synthetischen Biologen bemüht, lebende Systeme zur Durchführung zunehmend komplexeren Funktionalität in den Dienst der Biomaterialien3, Biotherapeutika4,5,6, Biokraftstoffe Ingenieur 7,8und Biosensoren Anwendungen9,10,11. Diese Anwendungen durch die Kombination von modularen DNA "Teile" in "Geräte" mit spezifischen Funktionen zu erreichen ist eines der wichtigsten Ziele der synthetischen Biologie gewesen. Für diesen Prozess zu skalieren, muss eine Technik, die Erstellung komplexer Geräte von großen Bibliotheken der Teile in einem Zeit-effizient ermöglicht, kostengünstig und vor allem reproduzierbar.

Eine expansive Montageprozess ist gerechtfertigt, weil derzeit das Feld fehlt ein vollständiges Verständnis der Regeln führen erfolgreiche biologische Systemdesign und Komposition. Dies wird verschärft durch unzureichend gekennzeichnete DNA Teile12, mangelnde Kompatibilität und Kombinierbarkeit der Teile13und unerwartete, unerwünschte Wechselwirkungen zwischen genetischen Komponenten innerhalb von synthetischen Geräten14, 15. in Ermangelung zuverlässiger Prognosemodelle, funktionale synthetische genetische Geräte sind angekommen, durch Versuch und Irrtum, die fordert Dutzende oder sogar Hunderte von Input-Output-Signalstärke Varianten eines beabsichtigten Geräts gezeigt und das "beste" für die Komposition mit nachgeschalteten Elementen16ausgewählt ist. Während moderne DNA-Montagemethoden wie Golden Gate17und modulare Klonen standardisiert erleichtern18,19,20 diesen Prozess, experimentelle Experte noch jedes Protokoll führen muss. Als synthetische Geräte in der Größe und Komplexität, die insgesamt verfügbaren Bauraum wachsen werden zu groß geworden, zu konstruieren und testen manuell21, und der Prozess zu handwerklichen für nennenswerte Fortschritte werden im Feld erfolgen replizierbar ist.

Bis zum Aufkommen der synthetischen Biologie und biologische Teil Repositories wie iGEM Teile Registry (http://partsregistry.org) wurden die JBEI Inventar der Composable Elemente22und SynBioHub23, genetische Teile nicht in irgendwelchen gespeichert. Standardisierte Montage-Format. Nur eine kleine Handvoll Teile pro Projekt geklont werden musste und so das Volumen des Klonens getan war klein, und die Realisierung eines montierten Gerätes war erreichbar und trivial im Vergleich zu den tatsächlichen Forschungszielen. Molekularen Klonen wurde häufig ad-hoc- und mit Beschränkungsauswahl basierend auf Beschränkung Site und Endonuklease Verfügbarkeit statt nach einer standardisierten Prozess durchgeführt. Die mangelnde Standardisierung machte es unpraktisch, jedes Klonen Protokoll zu automatisieren, da es unwahrscheinlich ist, dass die nächste Klonen Reaktion eine identische Protokoll folgen würden. Darüber hinaus verpflichtet Automatisierung DNA Montage erhebliche finanzielle Investition in Anlagen (Liquid handling Roboter und ihre zugehörigen Software und Labware Infrastruktur) sowie der Zeitaufwand für die Erzeugung von Anweisungen genau zu entwickeln Parameter für den Umgang mit den verschiedenen Klassen von Flüssigkeiten verarbeitet wird und die genaue Reihe von Anweisungen zur Ausführung dieser Protokolle. Kleinere Klonen Bemühungen rechtfertigen diese Kosten nicht. Die Kombination von größeren, komplexen genetischen Gerätekonzepte gepaart mit standardisierten Versammlung Protokolle24,25 schafft ein Umfeld, wo die Automatisierung dieser Prozesse sehr praktisch ist. Low-cost Robotik wie Opentrons OT-One26 entstehen auch noch bescheiden finanzierten Labs, um Zugang zu dieser Technologie ermöglicht. Darüber hinaus "cloud" Laboratorien27 einschließlich Transcriptic und Smaragd-Cloud-Labor sowie akademische "Biofoundries" wie die Edinburgh Genom Gießerei, der UIUC iBioFab und MIT breiten Gießerei, Kabelbaum Robotik vielfältig zusammenzubauen setzt der Entwürfe für eine Vielzahl von Kunden schnell und wiederholt, während ein gemeinsames Repository basic DNA primitive und Montagetechnologien für zukünftige Bestellungen erhalten.

Eine der größten Herausforderungen bei der Automatisierung des Prozesses der DNA-Versammlung ist die Generation der Pipettier Befehle für den liquid Handler. Während die Software-Schnittstellen für diese Geräte in der Regel einfach zu bedienen, komplexe sind erfordern Pipettieren Anweisungen wie für kombinatorische DNA Montage den Wissenschaftler, der explizit angeben, jedes Aspirat und Befehl manuell zu verzichten. Dies schafft einen größeren Engpass im Workflow und lässt die Skript-Generierung anfällig für die gleichen Pipettieren Fehler, als ob die Assembly manuell durchgeführt wurden. Dies erfordert ein Softwaretool, das alle Teile dieses Prozesses, von der Gestaltung der Gerätebibliothek, generieren die Pipettieren Anweisungen und Bereitstellung des Forschers mit der Platte/Reagenz-Setups erforderlich, um sie zusammenzufügen automatisieren kann. Dabei nutzen wir unsere Software-Tool, um die Gestaltung einer kleinen kombinatorische DNA Gerät Bibliothek sowie das Mischen der Reagenzien (Wasser, Puffer, Enzyme) und DNA-Teile (Abbildung 1 b) in 96 ein-Topf modulare DNA Montage Reaktionen zu automatisieren. Verwendung des Werkzeugs erfordert keine Vorkenntnisse in der Programmierung, ist skalierbar und hohen Durchsatz und kombinatorische standardmäßig. Wir zeigen, dass Klonen Reaktionen auf zwei verschiedene automatisierte liquid Handling-Plattformen richtige Reihenfolge überprüft Klone Ausbeute mit vergleichbarer Häufigkeit zu Reaktionen manuell vorbereitet (95 %) und mit deutlich weniger Arbeitsaufwand beträgt vorbereitet.

Protocol

1. Geben Sie Teile in DNA Gerätebibliothek und generieren Benutzer/Liquid Handler Anweisungen [15 min] verwendet werden

  1. Mit Hilfe eines Webbrowsers, navigieren Sie zu mocloassembly.com und hochladen Sie Genbank-Dateien für alle Teile der DNA, die in die kombinatorische DNA Gerätekonstruktion enthalten sein werden.
  2. Nachdem alle Dateien hochgeladen haben, wählen Sie die gewünschte DNA-Teile und ziehen Sie sie auf die leere Leinwand, indem Teiletypen in die vorgesehenen endgültigen Reihenfolge der DNA-Teile.
    Hinweis: Sammlungen der Teile, sowie einzelne Teile können ausgewählt und platziert auf der Leinwand. Bestellen Sie DNA-Teile auch, so dass 5' und 3' Überhänge für jedes Spiel Teil.
  3. Klicken Sie auf unten rechts auf der Seite "zusammenfügen".
    Hinweis: Das Tool generiert nur gültige, bebaubare Assemblys basierend auf den vier Basenpaaren Überhängen, die jedes Teil bei der Verdauung mit dem BsaI Enzym flankieren. Gäbe es keine bebaubare DNA-Geräte basierend auf den Teilen des Wissenschaftlers hochgeladen, zeigt das Tool, dass keine Assemblys gefunden wurden.
  4. Navigieren Sie zur Registerkarte 'Pläne' und Herunterladen von Dateien durch das Tool generiert. Diese Dateien umfassen:
    1. Lesbare Platte Karten für den Wissenschaftler DNA-Proben sowie Reagenzien für die Reaktionen vorbereiten
    2. Eine "Auswahlliste" für den liquid Handler
    3. Vollständig mit Anmerkungen versehene Genbank-Dateien für alle DNA-Geräte montiert werden
      Hinweis: Liquid handling Arm Positionierung beim Zugriff auf jede neue Labware muss getestet werden. Handbuch des Herstellers detaillierte Anweisungen zum Pipettieren Studienarm mit Positionierung in der X, Y und Z Achsen nach Bedarf anpassen.

2. bereiten Sie Plasmid-DNA und Reagenzien für die Montage [3 Tage]

  1. [Tag1] Mit einem sterilen Impfschlinge und arbeiten in der Nähe einer offenen Flamme oder in eine laminare Strömung Haube, Streifen, bakterielle Glycerin Bestände auf LB-Agar-Platten ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum. Dies gilt für alle erforderlichen DNA-Teile, und achten Sie auf die Schleife zwischen jeder Probe zu sterilisieren. Über Nacht inkubieren Sie Platten bei 37 ° C.
    Hinweis: Bakterielle Glycerin eingefroren, die Bestände auf Eis so viel wie möglich gehalten werden soll. Wiederholte Frost-Tau-wechseln die Lebensfähigkeit des Bestands zu senken und sollte vermieden werden.
  2. [Tag2] Mit einem sterilen Pipettenspitze, Zahnstocher oder Impfschlinge, und arbeiten in der Nähe einer offenen Flamme oder in einem Laminar-Flow-Haube, impfen 3 mL LB Brühe (ergänzt mit entsprechenden Antibiotikum) mit einer einzigen Kolonie von den LB-Agar-Platten in 2.1 vorbereitet. Inkubieren Sie Kulturen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 300 u/min.
  3. [Tag3] Plasmid-DNA aus der Bakterienkulturen mit jeder handelsüblichen Mini-Vorbereitung Plasmid Reinigung Kit zu reinigen.
  4. Mithilfe der MoClo_Setup.xlsx-Datei zur Verfügung gestellt, jede Probe von Plasmid DNA zu einer Konzentration von 20 Fmol/µL in Wasser oder TE-Puffer verdünnen.
  5. Im Anschluss an die Platte Karte der PDF-Datei generiert durch das Montagewerkzeug verdünnt statt der angegebenen Lautstärke der einzelnen DNA-Teil in den entsprechenden Brunnen auf einer vollständig umgangen 96-Well-PCR-Platte. Halten Sie diese SetupPlate auf dem Eis bis benötigt, oder mit einer Folie selbstklebende Dichtung Dichtung und Lagerung bei-20 ° C.
  6. Auf dem Eis, bereiten die Reaktion Mastermix mit den folgenden Komponenten: für jeweils 20 µL Reaktion hinzufügen 2 µL 10 x T4 DNA-Ligase Puffer, 0,5 µL des T4 DNA-Ligase (HC) und 1 µL BsaI Enzym. Ein Rechner-Blatt ist in der MoClo_Setup.xlsx Datei gerne mit diesem enthalten.
    1. Verteilen Sie das Enzym Mastermix in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen vollständig umgangen 96-Well PCR Platte nach der Platte-Karte für die ReagentPlate in der generierten PDF-Datei. Halten Sie diese ReagentPlate auf Eis oder auf einer 96-Well-Kälte-Block.
      Hinweis: Die ReagentPlate sollte nur wenn Sie bereit sind für die Montage auf der liquid Handler ausgeführt vorbereitet werden.

3. führen Sie Montage-Skript auf der Liquid Handler [Variable]

  1. Legen Sie die SetupPlate(s), die ReagentPlate(s) (auf einer 96-Well-Kälte-Block) und die erforderliche Anzahl von leeren vollständig umgangen 96-Well-PCR-Platten auf dem Deck des flüssigen Handlers. Die leeren Teller werden die OutputPlate(s), wo die Reaktionen zusammengesetzt werden.
  2. Vorbereiten den liquiden Handler Steuerungssoftware durch Erstellen von Instanzen von jeder Probe und Reagenz Platte vorbereitet, achten Sie darauf, sie zu nennen, genau wie auf den Teller-Karten erzeugte mocloassembly.com, einschließlich einen Trog von sauberem, deionisiertes Wasser mit der Bezeichnung angezeigt " Reservoir ".
  3. Mit dem "Arbeitsvorrat" Befehl in der Steuerungssoftware, laden Sie die .gwl-Datei generiert durch unsere Software-Tool, gefolgt von einer anderen "Arbeitsvorrat"-Befehl, der die .gwl-Datei geladen, in den ersten Befehl ausgeführt wird.
  4. Führen Sie das Skript mit der Controller-Software "Ausführen" Befehl.
    Hinweis: Lassen Sie immer des Roboter liquiden Handlers um die Ausführung eines Skripts bevor Sie versuchen, Zugriff auf den Platz an Deck zu vervollständigen.
  5. Entfernen Sie alle Platten aus dem liquid Handler-Deck. Verbleibende DNA kann gespeichert werden, durch das Versiegeln der SetupPlate(s) mit Alu-Siegelfolie und Lagerung bei-20 ° C. Abdichtung der OutputPlate(s) mit Klebefolie, in einem Thermocycler oder Hitze-Block platzieren und mit den folgenden Zyklus Parametern ausführen:
    37 ° C für 2 h, 50 ° C für 5 min, 80 ° C für 10 min bei 4 ° C zu halten
    Hinweis: Nach Abschluss der Reaktion Thermocyclings, können OutputPlate(s) bei-20 ° C gespeichert, bis sie bereit sind, umgewandelt werden.

4. verändern Sie die Reaktionen [1 Tag]

  1. Tauen Sie die erforderliche Anzahl von kompetenten E. Coli Zelle Aliquote benötigt (10 µL/Reaktion) auf Eis.
    Hinweis: Um Sterilität zu gewährleisten, sollten die folgenden Schritte in der Nähe einer offenen Flamme oder innerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
    1. Während Zellen Auftauen sind, bereiten Sie LB-Agar-Platten (mit entsprechenden Antibiotikum) durch Pipettieren 50 µL 0.1 M IPTG und 50 µL von 20 mg/mL X-GAL auf der Oberfläche. Machen Sie einen master-Mix, wenn eine große Anzahl von Reaktionen zu Plattieren. Bestreichen Sie die Platten gleichmäßig mit einem sterilen Glasstab oder Glasperlen und die Platten bei 37 ° C für mindestens 15 Minuten Ruhe vor der Beschichtung Bakterien.
      Hinweis: Alternativ fügen Sie IPTG und X-Gal flüssigen Agar bevor Platten, bei 2 mM IPTG und 40 µg/mL X-Gal Endkonzentration gegossen werden hinzu. Speichern Sie diese Platten aus direktem Licht, wie X-Gal lichtempfindlich ist.
  2. Auf dem Eis, aliquoten 10 µL kompetente Zellen für jede Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte. Dies wird die Transformation-Platte sein.
  3. Fügen Sie 1-3 µL jeder Reaktion aus der OutputPlate(s) mit den entsprechenden gut in der Transformation-Platte und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  4. Die Transformation Dichtplatte mit Klebstoff Film- und Hitze Schock in einem Thermocycler bei 42 ° C für 30 s. Dann setzen Sie sofort die Platte für 2 min auf Eis.
  5. In der gleichen Vertiefungen der Transformation-Platte 150 µL SOC Medien hinzufügen, mit einer Aluminium selbstklebende Dichtung Dichtung und unter Schütteln bei 900 u/min für 1 h bei 37 ° C inkubieren.
  6. Platte den gesamten Inhalt von jedem Bohrloch der Transformation Platte auf den LB-Agar-Platten in 4.1.1 mit einem sterilen Glasstab oder Glasperlen, gleichmäßig beschichten die Oberfläche der Platte zubereitet. Über Nacht inkubieren Sie Platten bei 37 ° C.

(5) Klonen Sie Überprüfung [2 Tage]

  1. Bereiten Sie ein oder mehrere Tiefbrunnen 96-Well-Kultur-Blöcke mit 1,5 mL LB Brühe (mit entsprechenden Antibiotikum).
    1. Ähnlich wie bei Schritt 2.2, Tiefbrunnen Kultur Speicherblöcke mit einzelnen weißen Kolonien von jeder LB-Agar-Platte des transformierten Reaktionen zu impfen.
    2. Die Kultur-Blöcke mit einer gasdurchlässigen Dichtung Dichtung und über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 900 u/min inkubieren.
      Hinweis: Das modulare Klonen Technik nutzt screening-blau-weiß, so positive KBE erscheint weiß auf der LB-Agar-Platte, während leere Ziel Vektoren blau erscheinen.
  2. Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen (wie in 2.3) zu isolieren und legt für die Sanger Sequenzierung Klone zu überprüfen.

Representative Results

Hier zeigen wir die automatisierte modulare Montage von 96 DNA-Geräten aus verschiedenen grundlegenden DNA Teile (Abbildung 1 b) mit zwei automatisierte Roboter liquid-Handling-Plattformen. Jede transkriptionelle Einheit ist eine lineare Anordnung der Promotor, ribosomalen Bindungsstelle, gen, und transkriptionelle Terminator, in ein bestimmtes Ziel-Vektor kloniert. TUs sind eine Schlüsselkomponente in vielen hierarchischen genetischen Schaltkreis Designs28,29,30 und sind daher ein natürlicher Proof of Concept für diesen Ansatz. Sequenz verifiziert Klone von Anfang bis Ende in ~ 5 Tagen erreicht werden können, und ein Überblick über die dargestellten Workflow ist in Figur 1apräsentiert.

Mit dem beschriebenen Tool und Protokoll, haben wir mehrere Metriken hilfreich bei der Bestimmung der optimalen Montageplattform angesichts eine definierte Anzahl von Klonen Reaktionen des Wissenschaftlers generiert werden. Abbildung 2a zeigt einen Vergleich zwischen Reaktionszeiten Montage über alle drei Modalitäten. Ausführungszeit ist die Gesamtzeit zum Pipettieren alle Schritte benötigt, um 96 Reaktionen zu montieren inklusive Abgabe aller DNA-Teile und Reagenzien. Hands-on-Zeit bezieht sich auf die Gesamtzeit, die ein Mensch in der Vorbereitung der Klonen Reaktionen oder Einrichtung der Software läuft des liquiden Handlers manuell beteiligt war. Abbildung 2 b vergleicht Kosten zwischen den verschiedenen Methoden. Preise vorgestellt sind für eine einzige Reaktion, die durch jede Methode vorbereitet und enthalten Enzyme und Einweg-Pipettenspitzen, aufgrund des niedrigsten typische Reaktion (20 µL für liquid Handler, 10 µL für manuelle, 250 nL für akustische Dispenser). Einzelnen Klone aus alle 96 Reaktionen für manuelle und liquid Handler vorbereitet Sets wurden sequenziert, eine Teilmenge von 12 für die akustische Dispenser Reaktionen (Abbildung 2 c) sequenziert. Richtigen Sequenzen wurden 95 % der 96 manuelle und liquid Handler-Sets erhalten. 83 % der akustischen Dispenser Probe Teilmenge waren korrekt, jedoch konnte die letzten zwei Reaktionen weiße Kolonien, wahrscheinlich wegen der unzureichenden Vermischung von Tröpfchen nach der Entnahme von DNA und Reagenzien Ausbeute war komplett. Abb. 2d zeigt Klonen Reaktion Effizienz, gemessen durch das Verhältnis der weißen Kolonien, Gesamtzahl der Kolonien, die manuell zwischen vergleichbar sind (94 %) und liquid Handler montiert (84 %) Reaktionen. Interessanterweise bemerkte beim Skalieren die letzte Reaktion Lautstärke mit der akustischen Spender wir einen deutlichen Rückgang in Reaktion Effizienz wenn Reaktionen bei Lautstärken, die kleiner als 1 µL (ergänzende Abbildung1 & zusätzliche Tabelle 2) vorbereitet wurden. Dies ist wahrscheinlich durch Verdunstung während der Reaktion Thermocyclings, die eine Erhöhung der Salzkonzentration in der Reaktion hervorrufen können.

Figure 1
Abbildung 1. Automatisierte DNA Gerät Bibliothek Montage Workflow.
(a) einen Überblick über die experimentelle Workflow in dieser Arbeit vorgestellt. (1) Forscher laden zuerst Genbank-Dateien für alle DNA-Teile & Ziel Vektoren, die sie verwenden möchten. (2) als nächstes werden DNA-Teile in der Baugruppe aufgenommen werden ausgewählt. (3) das Tool generiert dann eine Auswahlliste für eine automatisierte liquid Handler, als auch Platte Karten mit manuelle Auffüllung mit DNA-Teile und Enzym Mastermix zu unterstützen. (4) mit der DNA & Reagenzien Platten sowie die generierten Auswahlliste Forscher führen die Montage von den Klonen Reaktionen auf der liquid Handler. (5) Sobald der Vorgang abgeschlossen, sind die Reaktionen umgewandelt und verchromt für nachgelagerte Analyse. (b) Liste von DNA in dieser Arbeit verwendeten Teile. Insgesamt drei Promotoren, generieren drei ribosomale Bindungsstellen, vier Codierung Sequenzen und ein transcriptional Terminator dienten die kombinatorische 96 TUs-Bibliothek. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. Vergleiche zwischen den drei unterschiedliche Reaktion Montage Modalitäten.
(a) Reaktion Rüstzeit für 96 montiert Reaktionen manuell über ein liquid Handler und eine akustische Dispenser. Manueller Montage dauerte 2 h 10 min, alle von denen war der Arbeitsaufwand beträgt. Die liquidere Handler nahm eine ähnliche Menge an Zeit (2 h, 6 min), das Pipettieren Befehle auszuführen, jedoch nur ein Bruchteil der damaligen Zeit (5 min) wurde zum Anfassen. Die akustische Spender nahmen deutlich weniger Zeit für die Ausführung von flüssigen Übertragungen (5 min) und nahmen minimalen Arbeitsaufwand beträgt (5 min). (b) Preis pro einzelnen Klonen Reaktion für jede Montage-Methode. Dieser Preis beinhaltet die Kosten für die Enzyme verwendet, sowie Pipettenspitzen. (c) Ergebnisse aus den einzelnen Kolonien alle 96-Sequenzierung TUs montiert. Der Anteil der richtigen Klone war über alle Montagemethoden vergleichbar. Beachten Sie, dass nur eine Teilmenge (12) der volle 96 Assemblys aus dem akustischen Dispenser Proben vorbereitet umgewandelt wurden. Zwei Reaktionen gegen alle weißen Kolonien, wahrscheinlich durch die unzureichende Vermischung von DNA & Enzym Mastermix Tröpfchen in die OutputPlate Ausbeute. (d) Vergleich des Klonens Reaktion Wirkungsgrade zwischen manuellen und liquid Handler vorbereitet Reaktionen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusätzliche Abbildung 1. Reaktion Effizienz sinkt mit der Reaktion Lautstärke zu verringern.
Reaktion Wirkungsgrade fallen deutlich, wenn unten Reaktion Volumen unterhalb 1 µL Skalierung. Dieser Trend wird mit zwei verschiedenen DNA-Endkonzentrationen gesehen; jedoch können Wissenschaftler anmelden verwenden kleinere Mengen Reagenz Kosten sparen, wenn niedrigere Effizienz toleriert werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Zusätzliche Tabelle 1.
Tabelle der DNA und Enzym liquid Klasse-Parameter für verschiedene Pipettieren Volumina. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Zusätzliche Tabelle 2.
Effizienzberechnungen Reaktion. Rohe KBE Zahlen sind 12 96 transformierten Reaktionen vorbereitet manuell und über die liquid Handler gegeben. KBE Zahlen sind ebenfalls vorhanden, für die Prüfung kleinerer Mengen der letzten Reaktion auf akustische Spender. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Zusammenfassend ist die Automatisierung des kompletten DNA-Gerät Entstehungsprozess, vom in-Silico -Design bis zur Handhabung von Flüssigkeiten, eine tragfähige Ziel mit den derzeit bestehenden Technologie. Software und moderne Robotik ermöglichen die Erstellung von Workflows, die kostengünstig, zeitsparend und skalierbare, sind gleichzeitig auch mehr konsistent reproduzierbaren Ergebnissen als manuelle Methoden. Während Automatisierung nicht immer die günstigste Wahl für die Ausführung eines Protokolls, experimentelle Reproduzierbarkeit verbessert und Forscher wertvolle Zeit. Jedoch kann abhängig von der Hardware verwendet, die Verwendung von Automatisierung manchmal fahren, Kosten und Ausführungszeit deutlich unter dem was durch herkömmliche manuelle Methoden erreicht werden kann. Darüber hinaus Automatisierung fängt Protokolle explizit in einer formalisierten Art und Weise verhindern, dass Ad-hoc-, artisanal, und anekdotische bewährter Grundlage experimentieren. Hier zeigt sich die automatisierte Montage von DNA Reiheneinbaugeräte, und das Protokoll, elektronische Dateien und physische DNA-Ressourcen benötigt für den Leser, diese durchzuführen, und ähnliche, Experimente auf eigene Faust werden zur Verfügung gestellt. Wir hoffen die Verfügbarkeit unserer Tools und die Veröffentlichung dieses Protokolls dient als Ressource und verschieben Sie das Feld in eine transparente und kommunale Zukunft im Bereich der DNA Montageprozesse und Flüssigkeit Umgang mit Robotik.

Die Nützlichkeit der Automatisierungshardware ist weitgehend abhängig von der Konfiguration & Fähigkeiten der Hardware. Zum Beispiel nutzt unsere liquid Handler System Flüssigkeit Verschiebung Aspirat zu betätigen und Befehle zu verzichten. Die Kolben, dass Laufwerk die Systemflüssigkeit sind relativ große 1 mL Spritzen, die nützlich sind für eine Reihe von Bänden, 2 µL Untergrenze für das genaue Dosieren von Reagenzien auferlegt. Folglich wir skaliert das Gesamtvolumen des Klonens Reaktionen einrichten auf der liquid Handler 20 µL, da jeder Befehl musste ≥2 µL zu verzichten. Dies verdoppelt effektiv die Kosten pro Reaktion für liquid Handler vorbereitet Reaktionen, aber die praktische Zeit benötigt, um diese Reaktionen führen deutlich verringert wurde. In dem Bemühen, dieses Problem zu beheben haben wir die Reaktion-Setup für alle 96 Reaktionen auf eine akustische liquid Dispenser wiederholt. Dieses Gerät nutzt Schallenergie Flüssigkeit direkt von einer Platte zur anderen zu verzichten, und erreichen Volumen weit unten zu verzichten (2,5 nL) möglich mit standard Luftverdrängung basiert manuellen Pipetten. Mit diesem Gerät konnten wir verkleinern das Gesamtvolumen unserer Reaktionen auf 250 nL, eine 40-fold Reduktion im Vergleich zu manuell vorbereitete Reaktionen von 10 µL. Wegen der kleinen Mengen verzichtet und das Fehlen des Tipp wechselt zwischen Pipettieren Schritte, akustische Dispenser war in der Lage, die gleichen 96 Reaktionen in einem Bruchteil der Zeit zu generieren (< 5 min). Die kleineren Reaktion Volumen sparen auch verschwendet Reagenzien, da wir in der Regel nur 1-3 µL der Reaktion verwandeln. Abgesehen davon kann die Verwendung von Automatisierungs-Hardware in Verbindung mit intuitiver Software, die Erzeugung einer großen Anzahl von DNA Montage Reaktionen ein viel breiteres Publikum akademischen zugänglich machen.

Hier zeigen wir den Nutzen unserer Software-Tool, aber es gibt eine Reihe von Funktionen, die helfen würden, seine Nützlichkeit zu erweitern. Zunächst müssen jedes Mal, wenn das Werkzeug verwendet wird, um eine kombinatorische Assembly zu generieren neue DNA Teil Platten generiert, erfordert des Wissenschaftlers, der diese Platten manuell für jede Assembly ausführen zu füllen. Es wäre hilfreich, stattdessen, wenn der Wissenschaftler könnte die Lage der Teile in einer DNA-Platte in der Baugruppe verwendet werden angeben. Dies würde den Einsatz von Hochdurchsatz-Plasmid DNA-Reinigung-Kits ermöglichen, da Forscher könnte Kulturen aus einem Bausatz wie CIDAR MoClo Bibliothek zu impfen, und reinigen alle Proben zusammen unter Beibehaltung der gut Lage der einzelnen Teile im Kit angegeben. Zweitens unterstützt das Tool derzeit nur die Verwendung von 96-Well Platten. Für größere Projekte, wo mehrere hundert DNA-Geräte müssen gebaut werden, darf die Anzahl der DNA-, Reagenzien und Ziel Platten Deck Kapazität des flüssigen Handlers. Dieses Problem könnte sich zumindest teilweise durch Unterstützung für höhere Dichte Plattenformate (384 oder 1536-Well) gemildert werden. Zu guter Letzt unterstützt das Tool derzeit nur eine einzige Art von liquid Handler und DNA-Montage-Strategie. Während es relativ einfach, Werkzeug produziert liquid Handler-Anweisungen zu einem akustischen Dispenser-Format mit Tabellenkalkulations-Software zu konvertieren ist, hoffen wir, nativen Unterstützung für viele verschiedene liquid Handler stark seine Anwendbarkeit als erweitern würde zu erweitern Kompatibilität mit anderen gemeinsame DNA Montagetechniken Gibson Montage31möchten.

Ein wesentlicher Bestandteil dieses automatisierte Montage Ökosystem ist eine Reihe von Software-Tools, die auf hohem Niveau Montagepläne in freundlichen Automatisierungsprotokolle übersetzt, die explizit auf Liquid handling-Robotern ausführen geplant sind. Zwar gibt es eine Reihe von Software-Tools, mit denen Forscher, Baugruppen in Silico einschließlich Benchling, MoClo Planer und Raven32zu entwerfen, haben nur wenige die Fähigkeit, diese Entwürfe in ausführbaren Anweisungen zur Ausführung auf einer Flüssigkeit zu übersetzen Handler. Zu Ende, arbeiten wie PR-PR-Automatisierung und Puppenspieler33,34,35 haben damit begonnen, diese Werkzeuge zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus sind gewerbliche Einheiten in diesem Bereich tätigen betrachten weisen einzuführen "Cloud Labs" die experimentelle für große Gruppen von Endbenutzern durch Automatisierung Dienstleistungen. Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen könnte dienen, als ein Stück von diesen Anstrengungen, sofern sie als Service präsentiert werden.

Automatisierte Montage von DNA-Geräten der sofortige und offensichtliche Wert zur synthetischen Biologie ist, eignet sich unser Protokoll für die größere Gemeinschaft von Molekularbiologen sowie. Automatisierung von DNA-Baugruppe kann viele der bekannten, aber ähnlichen genetischen Geräte Parallel und können erstellt werden ermöglichen die schnelle Synthese der Ausdruck Bibliotheken für screening und Testzwecken in Medikamentenstudien Entwicklung. Wir hoffen, dass unsere Software-Tool wird größere kombinatorische basierende DNA Montage Anstrengungen zugänglicher, und als eine nützliche Ressource für synthetische Biologie, sowie größeren akademischen Gemeinschaft dienen.

Disclosures

Densmore ist Präsident und Mitbegründer von Lattice Automation, Inc. Timmons und McCarthy sind Gitter Mitarbeiter. Gitter macht Software und Dienstleistungen für die Automatisierung vieler der Prozess beschrieben.

Acknowledgments

Wir danken Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez und Johnson Lam für Arbeit an den Puppenspieler Projekt, sowie Swati Carr, Rachael Smith und Thomas Costa für Hilfe mit diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziert durch NSF Karriere Award #1253856. Es wird auch von der NSF-Expeditionen in Computing Award #1522074 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot Tecan Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) Tecan Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550 Labcyte Acoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT Sorvall Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro Eppendorf 950040015 Thermocycler with 96-well heat block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath Torrey Pines Scientific Heating/Chilling block for EVO 150 deck
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418 Eppendorf 5418000017 Stardard 18-well microcentrifuge
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name Company Catalog Number Comments
Resources
mocloassembly.com Lattice Automation Web-tool for combinatorial DNA assembly
mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit AddGene 1000000059 Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry CIDAR Lab Registry of plasmid DNA maps
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name Company Catalog Number Comments
Labware
50 μL Conductive Tips Tecan 30 057 818 Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates USA Scinetific 5678-0285 Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scinetific 1615-5599 Disposable microcentrifuge tubes
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane Sigma-Aldrich Z763624-100EA Breathable sealing membrane for bacterial culture plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates GeneMate T-3183-2 PCR plates used for all steps
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates GeneMate T-2451-1 Alluminum seals for PCR plate storage
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates GeneMate T-2450-1 Plastic seals for PCR plates during cycling
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler Eppendorf 22510525 96-well cold block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Sciences 2160250 Plasmid DNA purification kit
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC) Promega M1794 High concentration T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme New England Biolabs R0539L BbsI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme New England Biolabs R0535L BsaI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack Promega C1263 10x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Zymo Research I1001-25 0.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) Zymo Research X1001-25 20 mg/ml X-GAL solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate Zymo Research A1003-25 35 mg/ml Kanamycin solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt) Fisher BP26481 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media Teknova S0225 Powder media used to make SOC broth
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media Sigma-Aldrich L3022-1KG Powder media used to make LB broth
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media Sigma-Aldrich L2897-1KG LB with agar mix used for making solid media plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells Bioline BIO-85027 High efficiency chemically competent E. coli cells
http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name Company Catalog Number Comments
Primers
Primer VF 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs

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References

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Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L., Timmons, J., Densmore, D. M. Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices. J. Vis. Exp. (130), e54703, doi:10.3791/54703 (2017).

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