Summary
ここで、液体ハンドリング ロボットのクローン DNA のモジュラー アセンブリの方法を使用してモジュールの DNA「デバイス」アセンブリを実行する自動化されたワークフローが表示されます。プロトコルは、組合せの DNA デバイス ライブラリ世代は、我々 の 2 つの液体処理プラットフォームを使用して例を示す液体ハンドラー候補リストを生成するための直感的なソフトウェア ツールを使用します。
Abstract
モジュラー DNA のアセンブリ技術の最近の進歩は、テストする合成生物学を有効にしているかなり多くの利用可能な「デザイン スペース」個々 の遺伝的要素の組み合わせとして作成された「デバイス」で表されます。しかし、このような多数のデバイスの手作業による組み立ては時間のかかる、エラーを起こしやすいと高価です。洗練と合成生物学研究のスケールの増加は、大規模、複雑で、高スループット装置の建設に合わせて、再現性のある効率的な方法を必要とします。
ここでは、タイプ IIS ベース制限エンドヌクレアーゼ モジュール (MoClo) のクローニング技術を使用して DNA のアセンブリのプロトコルは 2 つの液体ハンドリング ロボット プラットフォームに自動化されています。自動液体ハンドリング ロボットを慎重に、必要とする (例えば酵素、DNA、水、バッファー)、異なる粘度の液体のため、正しい吸引できるように明示的なプログラミングおよび調剤ピペッティング パラメーターの退屈な最適化をしばしばDNA の部分および試薬。これマニュアルな DNA の集合として同様に問題が複雑なアセンブリ用手動スクリプトとスクリプトの生成を自動化できるソフトウェア ツールが必要になります。このため、web ベースのソフトウェア ツール、Genbank ファイルとしてアップロードされた DNA の基本的な部分から組合せの DNA デバイス ライブラリを生成するための http://mocloassembly.com を開発しました。我々 は、ツールへのアクセスを提供し、液体クラス、実験器具のパラメーター、およびデッキのレイアウトを含む当社の液体ハンドラー ソフトウェアからエクスポート ファイルが最適化されました。使用すべての DNA の部分は、Addgene を通じて利用可能なボストン大学 BDC 氷レジストリ経由で彼らのデジタル マップをアクセスことができます。一緒に、これらの要素は、モジュラーのクローニング実験と類似したプロトコルを自動化する他の組織のための基盤を提供します。
ここで紹介する DNA アセンブリの自動化されたワークフロー DNA デバイスの再現性、自動化、高スループットの生産を可能し、繰り返し手動ピペッティングから生じる人的エラーのリスクが軽減されます。シーケンス データこのワークフローから生成された反応が正しい 〜 95% 自動化された DNA アセンブリの表示、手動反応準備と比較して少し 4%、時間通りとして必要があります。
Introduction
コリンズ トグル スイッチ1と Elowitz リプレッシレータ2など初期の合成生物学的遺伝的デバイスを特定、決定論的機能を持っている生物学的システムがフォワード エンジニア リングを示した。以来、合成生物学は、生命生体3バイオ4,5,6、バイオ燃料のサービスで漸進的により複雑な機能を実行するシステムを設計する努力しています。7,8、およびバイオセンシング アプリケーション9,10,11。これらのアプリケーションを「デバイス」にモジュラー DNA「部品」を組み合わせて特定の機能を実現する合成生物学の主要な目標の 1 つされています。このプロセスをスケール、時間効率的に部品の大規模なライブラリから複雑なデバイスの作成ができるテクニック必要がありますコスト効率の高い、そして最も重要なは、再現性のある方法。
現在フィールドが成功した生物学的システムのデザインと構成を導くルールを完全に理解を欠いているので、このような広大な組立工程が保証されます。これが悪化して不十分に特徴づけられる DNA 部分12互換性の欠如と部品13、および合成デバイス14,内で遺伝的要素の予期しない、望ましくない相互作用の構成可能性15. 要求する数十、または対象デバイスの亜種が上映される入出力信号強度と「最高の」数百、試行錯誤によって信頼性の高い予測モデリングの不在の機能合成遺伝的デバイスの到着ダウン ストリーム要素16組成に対して選択されます。現代は、ゴールデン ゲート17、およびモジュラー クローニングなど DNA アセンブリ メソッドを標準化18,19,20やすくこのプロセス、実験の専門家は各プロトコルを実行する必要。合成デバイスのサイズと複雑さ、合計使用可能なデザイン空間で成長は大きくなりすぎたを構築し、21、およびプロセスを手動でテストれますフィールドで行われる複製可能である任意の重要な進歩のためあまりにも職人。
いずれかの登場までは、合成生物学や生物学的部分リポジトリ iGEM パーツ レジストリ (http://partsregistry.org) などの構成可能な要素の JBEI 在庫22、および SynBioHub23, 遺伝的部分が格納されていません。アセンブリの標準化された形式。プロジェクトごと複製するために必要な部品の小さい握りだけとしたがって、クローニングを行ってのボリュームが小さかったと組み立てられたデバイスの実現が達成された、具体的な研究目標と些細な比較します。アドホックが多かったのクローニングと次の標準化されたプロセスはなく、制限のサイトおよびエンドヌクレアーゼの可用性に基づいて制限のダイジェストを使用して実行されます。標準化の欠如は、次の複製反応が同じプロトコルに従うことがほとんどないものとして任意のクローニング プロトコルを自動化する実用的ではないです。さらに、正確な開発手順の生成のための時間投資だけでなく、装置 (液体ハンドリング ロボットとその関連ソフトウェアおよび実験器具インフラ) の重要な金融投資に必要な DNA のアセンブリを自動化します。液体の処理中のさまざまなクラスと正確な一連のこれらのプロトコルを実行する命令を処理するためのパラメーター。小規模の努力のクローン作成は、これらの費用を正当化しなかった。標準化されたアセンブリ プロトコル24,25と相まってより大きくより複雑な遺伝的デバイス デザインの組み合わせは、これらのプロセスの自動化が非常に実用的な環境を作成します。Opentrons OT 126のような低コストのロボットも浮上している資金も控えめラボこの技術にアクセスすることができます。さらに、「クラウド」研究所27 Transcriptic エメラルド クラウド ラボとエジンバラ ゲノム鋳造、UIUC iBioFab など学術"biofoundries"を含むと MIT 広範な鋳造、多様なアセンブルするハーネス ロボット デザインの設定お客様の様々 な迅速かつ繰り返しながら DNA の基本的なプリミティブおよび今後の注文アセンブリ技術の共通リポジトリを維持します。
DNA アセンブリのプロセスの自動化の最大の課題の一つは、液体ハンドラーのピペッティング コマンドの世代です。これらのデバイスのためのソフトウェア インターフェイスが使用することは通常容易で複雑な間、組合せの DNA アセンブリに必要なそれらのようなピペッティング命令は明示的にそれぞれの吸引を指定し、コマンドを手動で調剤する科学者を必要です。これはワークフローでは、主なボトルネックを作成し、アセンブリが手動で行われた場合と同様同じピペッティング エラーを無防備スクリプト生成プロセス。これは、ピペッティングの命令を生成する、それらを組み立てるために必要なプレート/試薬セットアップを研究者に提供する、デバイス ライブラリを設計から、このプロセスのすべての部分を自動化できるソフトウェア ツールを必要とします。この作品では、小さな組合せ DNA デバイス ライブラリのデザインだけでなく、96 ワンポット モジュラー DNA アセンブリ反応に試薬 (バッファー、水、酵素) および DNA の部分 (図 1 b) の混合を自動化する当社のソフトウェア ツールを活用します。ツールの使用はプログラミングの経験は必要ありません、スケーラブルで高スループットとデフォルトで組合せ。反応をクローン作成準備を 2 つの異なる自動液体処理プラットフォームの収量正しいシーケンス確認クローン反応手動で準備 (95%) に匹敵する周波数と大幅に短い体験の時間を示します。
Protocol
1. DNA デバイス ライブラリとユーザー/液体ハンドラー命令の生成 [15 分] で使用する部品を指定します。
- 任意の web ブラウザーを使用して、mocloassembly.com に移動し、Genbank 組合せ DNA デバイス設計に含まれるすべての DNA の部品ファイルをアップロードします。
- すべてのファイルをアップロードすると、目的の DNA 部分を選択し、DNA 部分の意図されていた最終的な順序の部分の種類を配置する空白のキャンバスにドラッグします。
注: 個々 の部品と同様、部品のコレクションすることができます選択し、キャンバス上に配置。オーバー ハングは部分一致ごとに、5' と 3'、また、DNA の部品を注文します。 - ページの右下に ' アセンブリ' をクリックします。
注: ツールだけ BsaI 酵素と消化時に各パーツの側面 4 つの塩基対のオーバー ハングに基づく無効でビルド可能なアセンブリが生成されます。科学者によってアップロードされた部品に基づくビルド可能な DNA デバイス存在しない場合、ツールはアセンブリが見つからなかったことを示します。 -
'計画' タブに移動し、ツールによって生成されたファイルをダウンロードします。これらのファイルが含まれます。
- 反応に必要な試薬と同様に DNA のサンプルを準備する科学者のマップを人間が判読できるプレート
- 液体ハンドラーの '候補リスト」
- 組み立てられるようにすべての DNA デバイス完全に注釈 Genbank ファイル
注: 液体ハンドリング アームが任意の新しい実験器具をアクセスするときに位置決めをテストする必要があります。ピペッティング腕に応じて軸 X、Y、および Z の位置を調整する方法の詳細については、製造元のマニュアルを参照してください。
2. アセンブリ [3 日間] にプラスミド DNA と試薬を準備します。
- [1 日]滅菌接種ループを使用して層流フード、適切な抗生物質を添加した LB 寒天プレートの上に細菌のグリセロールを連勝、直火の近く。これを行うにすべての必要な DNA の部品、各サンプル間のループを殺菌することを確かめるため。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
: 可能な限り、氷で冷やして株式細菌のグリセロールが凍結。凍結融解の繰り返しは株式の生存率を下げるし、避けるべきであります。 - [2 日目]滅菌ピペット チップ、つまようじ、または接種ループを使用し、直火の近くまたは層流フードの作業 2.1 準備 LB 寒天培地プレートから単一コロニーの流体培養基 LB の (適切な抗生物質を添加した) の 3 mL を接種します。300 RPM で震えながら一晩 37 ° C で文化を孵化させなさい。
- [3 日]市販の小型準備プラスミド精製キットを使用して細菌文化からプラスミド DNA を浄化します。
- 提供されている MoClo_Setup.xlsx ファイルを使用して、水または TE バッファーに 20 fmol/μ L の濃度にプラスミド DNA の各サンプルを希釈します。
- 次のアセンブリ ツールによって生成された PDF ファイルのプレート地図、完全はいた 96 ウェル PCR プレートに適切な井戸の中に各希薄 DNA 部分の示されたボリュームを配置します。氷、必要になるまでにこの SetupPlate を保持または箔接着シールで封印、-20 ° C で保存
-
氷の上で以下のコンポーネントの反応マスター ミックスの準備: 各 20 μ L 反応の T4 DNA リガーゼ バッファー、T4 DNA リガーゼ (HC) の 0.5 μ L、1 μ L BsaI 酵素の x 10 の 2 μ L を追加。計算シートは、これを支援するために MoClo_Setup.xlsx ファイルに含まれます。
- 新しいフルはいた 96 ウェル PCR プレート、生成される pdf ファイルで ReagentPlate のプレートの地図を次の適切な井戸に酵素マスター ミックスを配布します。この ReagentPlate 氷や 96 ウェルのコールド ブロックをしてください。
注: 液体ハンドラーでアセンブリを実行する準備ができたら、ReagentPlate は準備のみ必要があります。
- 新しいフルはいた 96 ウェル PCR プレート、生成される pdf ファイルで ReagentPlate のプレートの地図を次の適切な井戸に酵素マスター ミックスを配布します。この ReagentPlate 氷や 96 ウェルのコールド ブロックをしてください。
3. 液体ハンドラー [変数] でアセンブリのスクリプトを実行します。
- 液体ハンドラーのデッキ、SetupPlate(s)、(96 ウェル風邪-ブロック) に ReagentPlate(s) と空フルはいた 96 ウェル PCR プレートの必要な数を配置します。空のプレートは、反応が組み立てられる OutputPlate(s) になります。
- 液体ハンドラーを準備ラベル脱イオン水 mocloassembly.com、きれいな、トラフを含むによって生成されたプレート マップに表示されるとおりに名前を付けますことを確かめる準備、サンプルと試薬板のインスタンスを作成することにより制御ソフトウェア '貯水池」。
- 制御ソフトウェアの 'ワークリスト' コマンドを使用して、最初のコマンドでロードされた .gwl ファイルを実行する別の 'ワークリスト' コマンドに続いて、当社のソフトウェア ツールによって生成された .gwl ファイルをロードします。
- コント ローラーのソフトウェアの実行] コマンドを使用してスクリプトを実行します。
注: は、デッキ スペースにアクセスする前に、スクリプトの実行が完了するロボット液体ハンドラーを常に可能です。 - 液体ハンドラー デッキからすべてのプレートを取り外します。残りの DNA はアルミ止水膜、-20 ° C で保存すると SetupPlate(s) をシールで保存される可能性があります。シールの粘着フィルムで OutputPlate(s) たちやヒート ブロックに配置、次のサイクルのパラメーターを使用して実行します。
4 ° C で 2 時間、5 分、10 分の 80 ° C は 50 ° C の 37 ° C を保持します。
注意: 反応サイクルが完了すると、OutputPlate(s) することができます保存-20 ° C で変換する準備ができるまで。
4. 変換反応 [1 日]
-
必要な有能なエシェリヒア属大腸菌数を融解氷の上 (10 μ L 反応) 必要な因数を携帯します。
注: 無菌性を維持するために、直火の近くまたは層流フード内で次の手順を実行する必要があります。- 細胞が融解すると、0.1 M IPTG の 50 μ L 分注して表面に X GAL を 20 mg/mL の 50 μ L LB 寒天培地プレート (適切な抗生物質を含む) を準備します。めっき反応の数が多い場合は、マスター ミックスを作る。均等に滅菌ガラス棒やガラス製のビーズを使用してプレートをコートし、細菌をメッキする前に少なくとも 15 分の 37 ° C で残りの部分にプレートを許可します。
注: また、追加 IPTG と X-gal 寒天液に 2 mM IPTG と 40 μ g/mL X ギャル最終濃度で、プレートが注がれる前に。X Gal は光に敏感な直接光からこれらのプレートを格納します。
- 細胞が融解すると、0.1 M IPTG の 50 μ L 分注して表面に X GAL を 20 mg/mL の 50 μ L LB 寒天培地プレート (適切な抗生物質を含む) を準備します。めっき反応の数が多い場合は、マスター ミックスを作る。均等に滅菌ガラス棒やガラス製のビーズを使用してプレートをコートし、細菌をメッキする前に少なくとも 15 分の 37 ° C で残りの部分にプレートを許可します。
- 氷上では、新しい 96 ウェル PCR プレートに各反作用のための有能なセルの 10 μ L 分注。これは、変換プレートになります。
- 変換プレートにも対応する、OutputPlate(s) から各反作用の 1-3 μ L を追加し、氷上で 5 分間インキュベートします。
- 30 42 ° C でたちの粘着フィルム、熱ショックで変換プレート シール s。その後、すぐに 2 分間氷の上プレートを配置します。
- 変換プレートの同じ井戸、150 μ L の SOC のメディアを追加、アルミ粘着シールの場合、シール、37 ° C で 1 時間 900 RPM で振とうしながらインキュベートします。
- 4.1.1 均等に塗布してプレートの表面滅菌ガラス棒やガラス製のビーズを使用しての準備 LB 寒天培地プレート上変換プレートの各ウェルの完全な内容をプレートします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
5. クローン検証 [2 日間]
-
流体培養基 LB の (適切な抗生物質を含む) の 1.5 mL で 1 つまたは複数の 96 ウェル深井文化ブロックを準備します。
- 手順 2.2、変換反応の各 LB 寒天培地プレートから単一の白いコロニーとともに深い井戸文化ブロックを接種するのに似ています。
- ガス透過性シール文化ブロックを密封し、37 ° C で 900 RPM で震えながら一晩インキュベートします。
注: クローン技術モジュール利用正 CFUs 空デスティネーション ベクトルは青色、LB 寒天培地プレートに白が表示されますので、青白のスクリーニングします。
- (2.3) のように細菌文化からプラスミド DNA を隔離し、サンガーのため送信クローンを確認するシーケンス。
Representative Results
2 つの自動液体ハンドリング プラットフォームを使用して様々 な基本 DNA 部分 (図 1 b) から 96 の DNA デバイスの自動モジュラー アセンブリを示します。各転写ユニット、プロモーター、リボソーム結合部位、遺伝子と転写ターミネーター、特定の宛先ベクトルにクローンの線形配列です。東京理科大学は多く遺伝した階層的回路デザイン28,29,30の主要なコンポーネント、したがってこのアプローチのための概念の自然な証拠です。開始から終了まで、約 5 日間でクローンをシーケンス確認を実現でき、図 1 aに示されたワークフローの概要を提示します。
説明ツールやプロトコルを使用して、科学者によって生成される複製反応の定義された数を与えられた最適なアセンブリのプラットフォームを決定する際に役に立ついくつかの指標を捕えました。図 2 aは、すべての 3 つの様式の間で反応時間の比較を示しています。実行時間は、すべての DNA の部分および試薬の分注を含む 96 反応を組み立てるために必要なピペッティングのすべての手順を完了する時間の合計です。体験時間は、人間が手動で複製反応の準備または液体ハンドラーを実行するソフトウェアのセットアップに関与していた時間の合計を指します。図 2 bは、異なる方法の間のコストを比較します。コスト提示各法により作製した単一反応、酵素および最低の典型的な反応量を考えると、使い捨てのピペット チップの価格を含める (液体ハンドラーの 20 μ、10 μ L のマニュアル、250 音響ディスペンサー nL)。12 音響ディスペンサー反応 (図 2 c) の塩基配列のサブセットをマニュアルと液体の両方のハンドラー準備セットすべて 96 反応から単一クローン クローニングされました。正しいシーケンスは、96 のマニュアルおよび液体ハンドラーのセットの 95% を得られました。音響ディスペンサー サンプル サブセットの 83% が正しい、しかし最終的な 2 つの反応はすべて白人の植民地、DNA と試薬の分注後液滴の不十分な混合によって生じた可能性がありますが得られなかったが完了しました。図 2 dが手動で間で同等のコロニーの総数に白人が植民地の比率によって測定されたクローンの反応効率を示しています (94%) と液体ハンドラー組み立て (84%) の反応。興味深いことに、音響のディスペンサーを使用して最終的な反応ボリュームを縮小するとき私たちマーク付きの低下に気づいた反応効率反応を 1 μ L (補足図 1 & 補足テーブル 2) よりも小さいボリュームで準備されたとき。これは、反応中の塩濃度の増加を引き起こすことができる反応サイクル中に蒸発による可能性が高いです。
図 1。自動化された DNA デバイスのライブラリ アセンブリのワークフロー。
(a)この作品で提示実験ワークフローの概要。(1) 研究者はまずすべての DNA の部分と使用するデスティネーション ベクトルのため Genbank ファイルをアップロードします。(2) 次に、アセンブリに含まれる DNA 部分が選択されます。(3) ツールは、自動液体ハンドラーはプレート マップと同様に DNA の部分と酵素マスターミックスプロ マニュアルの人口を支援するための候補リストが生成されます。(4) DNA ・試薬プレートとして生成された候補リストを使用して研究者が液体ハンドラーの複製反応のアセンブリを実行します。(5) 完了すると、反応は変換、下流解析のメッキします。(b) DNA のリスト部分を使った作品。3 つのプロモーターの合計は、リボソーム結合部位、4 つの符号化順序と 1 つの転写ターミネーターが使用された 3 つは 96 tus コンビナトリアル ライブラリを生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。3 つの異なる反応アセンブリ モダリティ間で比較します。
(())反応セットアップ時間 96 反応を手動で組み立て、液体ハンドラー経由で、音響のディスペンサー。手作業による組み立ては、2 時間 10 分、ハンズオン時間をだったすべてを取った。しかしピペッティング コマンドを実行する時間 (2 時間 6 分) の同じような量を取った液体ハンドラー (5 分) その時間の一部分だけだった手。音響のディスペンサー液体転送 (5 分) を実行に大幅時間はかからなかったし、最小限のハンズオン タイム (5 分) を取った。(b)各アセンブリのメソッドの単一の複製反応あたりの価格。この価格には、ピペット チップだけでなく、使用される酵素のコストが含まれています。(c)は、東京理科大学を組み立てシーケンスすべて 96 のシングル コロニーからの結果。正しいクローンの割合は、すべてのアセンブリ メソッド間で対等だった。全 96 のアセンブリのサブセット (12) だけがサンプルを準備音響のディスペンサーから変換された注意してください。2 つの反応は、すべて白人の植民地は、DNA ・酵素、OutputPlate マスター ミックス液滴の不十分な混合によって生じた可能性がありますをもたらすに失敗しました。(d)手動および液体ハンドラーに作成された反応の反応効率をクローンの比較。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。反応のボリュームを下げると反応効率が低下します。
縮小反応 1 μ L を下回っている場合する場合、反応効率は著しくドロップします。この傾向は 2 つの異なる最終 DNA 濃度; と見られるしかし、科学者はより小さいボリュームを使用して低効率を許容できる試薬コストを節約するを選択できます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足表 1。
様々 なピペッティング ボリュームの DNA や酵素の液体クラス パラメーターの表。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足テーブル 2。
反応効率の計算。12 液体ハンドラー経由で手動で準備 96 変換反応のため CFU の生の数値を与えられます。CFU 番号音響ディスペンサーの最終反応少量のテストも提供されます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
結論としては、流体ハンドリングのsilicoのデザインから、完全な DNA デバイス作成プロセスの自動化は現在、既存の実行可能な目標技術。ソフトウェアとモダンなロボットも手動による方法よりもっと一貫して再現可能な結果を作り出している間コスト効率の高い、時間効率、拡張性の高いワークフローの作成すること。オートメーションは、プロトコルを実行するための最も費用効果が大きい選択を常にはないかもしれないが、それは実験の再現性を改善し、研究者の貴重な時間を解放します。ただし、利用するハードウェアによってオートメーションの使用時車コストと従来の手動方法を通して何を達成できるかを下回る実行時間です。さらに、オートメーションが正式な防止アドホック、職人、明示的にプロトコルをキャプチャし、逸話的なベスト ・ プラクティスに基づいて実験。ここでモジュール式の DNA デバイスの自動アセンブリは、示されて、プロトコル、電子ファイル、および物理的な DNA リソース リーダー、これらを実行するために必要なと同様、自分で実験が提供されます。我々 は願って私たちのツールの可用性がされ、このプロトコルの公開リソースとして DNA 組立工程および液体ハンドリング ロボットの領域でより透明性と共用の未来に向けてフィールドに移動します。
オートメーション ハードウェアの有用性は構成とそのハードウェアの性能に大きく依存します。たとえば、液体ハンドラーは、吸引を動かし、コマンドを分配するシステムの流体の変位を使用します。ドライブ システムの流体が比較的大きい 1 mL であるピストンは、ボリュームの範囲の試薬の正確な調剤 2 μ L 下限を課し、注射器します。その結果、反応以来 20 μ L に液体ハンドラーの設定をクローン作成の総容積をスケール アップすべて ≥2 μ L をするために必要なコマンドを調剤。しかし、それらの反応を実行するために必要な実践的な時間の量を大幅に削減、これは効果的に液体ハンドラー準備中の反応のための反応あたりのコストを倍増しました。この問題に対処するために、音響の液体ディスペンサーをすべて 96 反応に反応セットアップが繰り返されます。このデバイスは、音響エネルギーを使用して、別の 1 つのプレートから直接流体を分配して達成することができますボリュームのはるか下を調剤 (2.5 nL) 手動ピペットを用いた標準的な空気の変位で何ができます。我々 は、250 に我々 の反応の総容積を縮小するができたこのデバイスを使用して、nL、10 μ L の反応を手動で準備する 40 減。調剤量が少ないと分注ステップ間ヒント変更の欠如のため音響ディスペンサーだった同じ 96 反応を短時間で生成することができる (< 5 分)。私たちは通常、1-3 μ L の反応を変えるので小さい反応ボリュームが無駄な試薬の保存もできます。という、オートメーション ハードウェア、直感的なソフトウェアと組み合わせて使用できるアクセシブル多数 DNA アセンブリ反応の生成により多くの学術人。
ここでは、しかしその有用性を広げるを助ける機能の数は、当社のソフトウェア ツールの有用性を示す.まず、組合せのアセンブリを生成するツールを使用するたびに新しい DNA 部分プレート生成されなければなりません、手作業で実行する各アセンブリのこれらのプレートを作成する科学者を必要とします。それ参考になる、その代わりに、科学者はアセンブリで使用される DNA プレートでパーツの位置を指定する場合。研究者が CIDAR MoClo ライブラリのようなキットから文化を接種してキットで指定された各部分の井戸の場所を維持しながら一緒にすべてのサンプルを浄化するので、これは高スループット プラスミドの使用 DNA 精製キットをできるでしょう。第二に、ツールでは、現在 96 ウェルのプレートの使用のサポートをするだけ。数百 DNA デバイスの構築する必要がある大規模なプロジェクトについて行先プレート、試薬、DNA の数は、液体ハンドラーのデッキ容量を上回る可能性があります。この問題は、高密度プレート フォーマット (384 または 1536 ウェル) のサポートによって、少なくとも部分的に軽減する、でした。最後に、ツールでは、現在液体ハンドラーおよび DNA アセンブリ戦略の 1 つの型のサポートをするだけ。大きくとしてその適用可能性を広げることを多くの異なる液体ハンドラーのネイティブ サポートを展開したい液体ハンドラーのツール制作手順を表計算ソフトを使用して音響ディスペンサー形式に変換するは比較的簡単ですが、他の共通の DNA のアセンブリ技術との互換性とギブソン アセンブリ31思います。
この自動化されたアセンブリの生態系の重要な部分は、液体ハンドリング ロボットの実行がスケジュールされて明示的にオートメーションのフレンドリーなプロトコルの高度な組立を変換するソフトウェア ツールのセットです。これらのデザインを液体で実行する実行可能な命令に変換する能力があるいくつかのソフトウェア ツールを多数存在する研究者アセンブリインシリコBenchling、MoClo プランナー レイヴン32などを設計することができるが、ハンドラー。そのためには、終了、作業広報 PR オートメーションと人形33,34,35は、これらのツールを利用できるように始めているよう。さらに、この分野で働く商業エンティティは、大規模なオートメーション経由でエンドユーザーのグループ実験的サービスを提供する「クラウド ラボ」を導入する方法を見ています。このペーパーで説明されているプロトコルは、定めるこれらの努力のいずれかの部分はサービスとして記載されているに役立つことができます。
DNA デバイスの自動アセンブリは合成生物学に直接的で明らかな価値、我々 のプロトコル同様の分子生物学者の大きいコミュニティのために有用です。知られている数が多い DNA アセンブリを自動化することができますと同様、遺伝的デバイスを並行することができます作成する発現ライブラリーのスクリーニング、医薬品開発研究でテストのための迅速合成を有効にします。我々 は、我々 のソフトウェア ツールが大規模な組合せに基づく DNA アセンブリ作業によりアクセスできるようにされ、大きな学術コミュニティと同様、両方の総合的な生物学に有用なリソースとして願っています。
Disclosures
デンスモアは、大統領とオートメーション株式会社ティモンズの共同創設者とマッカーシーは格子の従業員。格子は、ソフトウェアと説明したプロセスの多くのオートメーションのためのサービスになります。
Acknowledgments
この原稿のヘルプについて取り組んで人形プロジェクト スワティ ・ カー、レイチェル ・ スミス、トマス ・ コスタ、Swapnil Bhatia、アレハンドロ Pelaez とジョンソンのラムに感謝します。この作品は、NSF のキャリアによって賄われていた賞 #1253856。それも賞 #1522074 の計算で NSF の探険によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware / Software | |||
| Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
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| Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
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| Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
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| Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
| ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
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| Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resources | |||
| mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
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| CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
| CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labware | |||
| 50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
| 2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
| Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
| Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
| Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
| Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
| PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
| T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
| BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
| BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
| T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
| Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
| Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
| SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
| LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
| LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
| Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | |||
| Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
| Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
References
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