Summary
Здесь представлен автоматизированный рабочий процесс для модульной сборки «устройство» ДНК методом Модульная клонирования ДНК Ассамблеи на жидкость обработки роботов. Протокол использует инструмент интуитивное программное обеспечение для генерации жидких обработчик picklists для комбинаторной ДНК устройства библиотеки поколения, которое мы продемонстрировать с помощью двух жидких обработки платформ.
Abstract
Последние достижения в модульных ДНК Ассамблея методам позволили специалисты по синтетической биологии для тестирования значительно больше доступных «дизайн пространства» представлены «устройства» создан как сочетания индивидуальных генетических компонентов. Однако ручная сборка такого большого количества устройств время трудоемких, ошибкам и дорогостоящим. Увеличение сложности и масштаба синтетической биологии исследований требует эффективной, воспроизводимый путь для размещения крупных, сложных и высокой пропускной способности устройств строительства.
Здесь на двух платформах роботизированной жидкость обработки автоматизирован ДНК Ассамблеи протокол, с помощью метода эндонуклеазы ограничения на основе модульной клонирования (MoClo) тип-IIS. Роботами жидкость обработки требуют тщательного, зачастую утомительной оптимизации параметров дозирования жидкостей различной вязкости (например, энзимы, ДНК, воды, буферы), а также явного программирования для обеспечения правильного аспирации и дозирования ДНК частей и реагенты. Это делает ручной сценарий для сложных сборок же проблематично, как ручной сборки ДНК и требует программное средство, которое можно автоматизировать генерации скрипта. С этой целью мы разработали веб-программное средство, http://mocloassembly.com, для создания комбинаторных устройства библиотеки ДНК из основных частей ДНК, загруженные как Genbank файлы. Мы предоставляем доступ к инструменту, и файл экспорта от наших жидких обработчик программное обеспечение, которое включает оптимизированные жидкого классы, лабораторные параметры и планировка. Все части ДНК, используемые доступны через Addgene, и их цифровые карты могут быть доступны через BDC льда Бостонского университета реестра. Вместе эти элементы обеспечивают основу для других организаций для автоматизации модульных клонирования экспериментов и аналогичных протоколов.
Автоматизированный документооборот Ассамблея ДНК, представленные здесь позволяет повторяемые, автоматизированное, высок объём производства устройств ДНК и снижает риск возникновения человеческой ошибки, возникающие из повторяющихся Ручное дозирование. Виртуализация данных показывают автоматизированной сборки ДНК, реакции, созданные из этого рабочего процесса на ~ 95% правильно и требуют как немного как 4%, как много практический время, по сравнению с ручной реакции подготовки.
Introduction
Ранние синтетических биологических генетических устройств, таких как Коллинз переключатель1 и Elowitz repressilator2 показали, что биологических систем может быть вперед инженерии иметь конкретные, детерминированные функции. С тех пор специалисты по синтетической биологии стремились инженер живых систем для выполнения все более сложной функциональности в службе биоматериалов3, применения инновационных технологий биотерапевтических4,5,6, биотопливо 7,8и biosensing приложения9,10,11. Достижение этих приложений путем объединения модульных ДНК «частей» в «устройства» с определенной функциональностью был одной из основных целей синтетической биологии. Для этого процесса для масштабирования, должен быть метод, который позволяет создание сложных устройств от крупных библиотек частей в времени эффективных, экономически эффективным и самое главное, воспроизводимые манере.
Такой процесс экспансивного Ассамблеи является оправданным, потому что в настоящее время поле отсутствует полное понимание правил, определяющих успешное биологической системы дизайна и композиции. Это усугубляется недостаточно характеризуется ДНК части12, отсутствие совместимости и компонуемости части13, и неожиданные, нежелательные взаимодействия между генетическими компонентами в синтетических устройств14, 15. в отсутствие надежной прогнозного моделирования, функциональных синтетические устройства генетических прибыл в методом проб и ошибок, которая требует десятки или даже сотни, ввода вывода сигнала вариантов предполагаемого устройства проверяются и «лучших» выбирается для композиции с течению элементы16. В то время как современных стандартизированных ДНК Ассамблея методы, такие как Золотые ворота17и модульные клонирования18,,1920 упростить этот процесс, экспериментальный эксперт все еще требуется для выполнения каждого протокола. Как синтетических устройств растут в размер и сложность, всего доступны дизайн пространства будет стать слишком большим для построения и тестирования вручную21и этот процесс будет слишком кустарных для любой существенный прогресс, который подлежит копированию в области.
До появления синтетической биологии и биологических часть репозиториях, таких как iGEM частей реестра (http://partsregistry.org) JBEI инвентаризации составных элементов22, SynBioHub23, генетических части и не были сохранены в любой формат стандартизированной сборки. Только небольшая горстка частей необходимо быть клонированы каждого проекта и таким образом, объем клонирования сделали была небольшой и реализации собрал устройства достижимо и тривиальным по сравнению с фактической исследовательских целей. Молекулярное клонирование часто ad hoc и выполняется с помощью ограничения дайджесты, основанный на доступность сайта и эндонуклеазы ограничения, а не после любого стандартизованный процесс. Отсутствие стандартизации сделал это непрактично, чтобы автоматизировать любой протокол клонирования как маловероятно, что следующий клонирования реакция будет следовать идентичные протокол. Кроме того Автоматизация ДНК Ассамблея требует значительных денежных инвестиций в оборудование (жидкость обработку роботов и связанная с ними инфраструктура программного обеспечения и лабораторное оборудование) а также время инвестиции для создания инструкций для разработки точных параметры для обработки различных классов обрабатываемой жидкости и точное серии инструкций для запуска этих протоколов. Малого масштаба, клонирование усилия не оправдывает эти расходы. Сочетание более крупных, более сложных генетических устройства конструкции в сочетании с Ассамблее стандартизированные протоколы24,25 создает обстановку, где автоматизация этих процессов является очень практичным. Низкая стоимость робототехника как Opentrons OT-один26 также появляются, который позволяет даже скромно финансируемых лабораторий для доступа к этой технологии. Кроме того, «облачные» лаборатории27 включая Transcriptic и изумруд облако лаборатории, а также академические «biofoundries» как Эдинбург генома литейного, UIUC iBioFab, и MIT-широкий литейное, упряжь робототехника собрать различные наборы образцов для различных клиентов быстро и многократно при сохранении общего хранилища базовых примитивов ДНК и Ассамблеи технологий для будущих заказов.
Один из самых больших проблем в автоматизации процесса сборки ДНК это поколение дозирования команд для жидкого обработчика. В то время как программное обеспечение интерфейсов для этих устройств обычно прост в использовании, сложных дозирования инструкции, как те, которые необходимы для комбинаторной ДНК Ассамблеи требуют ученым, чтобы явно указать каждый аспирата и отказаться от команды вручную. Это создает основным узким местом в рабочем процессе и оставляет процесс создания сценария подвержены же дозирования ошибки, как если Ассамблея осуществлялся вручную. Это требует программное средство, которое можно автоматизировать все части этого процесса, от проектирования устройств библиотеки, для генерации инструкциям дозирования и обеспечивая исследователь с пластины/реагент установок, необходимых для их сборки. В этой работе мы использовать наш инструмент программного обеспечения для автоматизации проектирования небольшая библиотека устройств комбинаторного ДНК, а также перемешивания реагентов (буфер, вода, ферменты) и ДНК частей (рис. 1b) в 96 Однореакторный Модульная ДНК Ассамблеи реакции. Использование инструмента требует не опыт программирования, является масштабируемой и высокой пропускной способности и комбинаторной по умолчанию. Мы покажем, что клонирование реакции подготовлен на двух платформах в различных автоматизированной обработки жидких доходность правильной последовательности проверены клоны с сопоставимыми частотой реакции подготовлен вручную (95%) и значительно меньше времени, практический.
Protocol
1. Укажите частей для использования в библиотеке устройства ДНК и генерировать инструкции обработчик пользователя/жидкости [15 мин]
- С помощью любого веб-браузера, перейдите к mocloassembly.com и загрузить файлы Genbank для всех частей ДНК, которые будут включены в комбинаторной дизайн устройства ДНК.
- После того как все файлы были загружены, выберите желаемый части ДНК и перетащите их на пустой холст, помещая часть типов в предполагаемый окончательный порядок частей ДНК.
Примечание: Коллекции частей, а также отдельных частей, могут быть выбраны и помещены на холсте. Кроме того порядок частей ДНК таким образом, что 5' и 3' Навесы для каждой части матча. - Нажмите кнопку «Сборка» в правой нижней части страницы.
Примечание: Инструмент будет создавать только действительные, работоспособна сборки, основанные на четыре пары свесы, которые обрамляют каждую часть на пищеварение с ферментом BsaI. Если устройства не работоспособна ДНК существуют основанные на частей, загружены, ученый, средство будет указано, что без сборки были найдены. -
Перейдите на вкладку «Планов» и скачивать файлы, созданного инструментом. Эти файлы будут включать:
- Удобочитаемый пластины карты для ученого подготовить образцы ДНК, а также реагентов, необходимых для реакций
- «Поля выбора» для жидкого обработчика
- Полностью аннотированной Genbank файлы для всех устройств ДНК быть собраны
Примечание: Жидкость, обработка руку позиционирования при доступе к любой новой лабораторное оборудование должны испытываться. Обратитесь к руководству производителя подробные инструкции о том, как настроить дозирования руку позиционирования в X, Y и Z оси при необходимости.
2. Подготовьте плазмида ДНК и реагенты для сборки [3 дней]
- [1 день] С помощью стерильных прививка цикла и работать вблизи открытого пламени или в Ламинарный шкаф, полоска из бактериальных глицерин запасов на LB-агар пластин, дополнена соответствующим антибиотиком. Сделайте это для всех необходимых частей ДНК, убедившись, что для стерилизации цикла между каждый образец. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
Примечание: Замороженные бактериальных глицерина, что запасы должны храниться на льду как можно больше. Циклы повторного замораживания оттаивания снижение жизнеспособности запасов и их следует избегать. - [2-й день] С помощью стерильной пипеткой кончика, зубочистки или цикла прививок и работать вблизи открытого пламени или ламинарных капюшоном, прививать 3 мл LB отвара (дополнена соответствующим антибиотиком) с одной колонии от плиты LB-агара, подготовленный в 2.1. Инкубируйте культур на ночь при 37 ° C при встряхивании в 300 об/мин.
- [День 3] Очищайте плазмида ДНК от бактериальных культур с помощью любого коммерчески доступных мини-prep плазмида очистка kit.
- Используя предоставленный файл MoClo_Setup.xlsx, разбавляют каждый образец плазмидной ДНК в концентрации 20 фмоль/мкл в воде или TE буфера.
- После пластины карту PDF-файла, созданного инструментом Ассамблея место указывается объем каждой части разреженных ДНК в соответствующие колодец на табличке полный обогнул 96-луночных ПЦР. Держите этот SetupPlate на льду, до тех пор, пока требуется, или печать с печатью клей фольги и хранить при температуре от-20 ° C.
-
На льду, подготовить mastermix реакции со следующими компонентами: для каждого 20 мкл реакции мкл 2 из 10 x T4 ДНК лигаза буфер, 0.5 мкл T4 ДНК лигаза (HC) и 1 мкл BsaI фермента. Калькулятор лист включен в файл MoClo_Setup.xlsx, чтобы помочь с этим.
- Распространите mastermix фермента в соответствующие скважины новой обогнул полный 96-луночных ПЦР плиты, после карта плиты для ReagentPlate в созданном PDF. Держите этот ReagentPlate на льду или на 96-луночных холодной блок.
Примечание: Когда будете готовы выполнить сборку на обработчик жидкость только должен быть подготовлен ReagentPlate.
- Распространите mastermix фермента в соответствующие скважины новой обогнул полный 96-луночных ПЦР плиты, после карта плиты для ReagentPlate в созданном PDF. Держите этот ReagentPlate на льду или на 96-луночных холодной блок.
3. Выполните скрипт сборки на обработчик жидкости [переменной]
- Место SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (на 96-луночных холодной блок) и необходимое количество пустых обогнул полный 96-луночных ПЦР планшетов на палубе жидкого обработчика. Пустой знаке будет OutputPlate(s), где собраны реакции.
- Подготовить обработчик жидкие управления программного обеспечения путем создания экземпляров каждого образца и реагента плиты подготовлен, убедившись назвать их точно так, как они появляются на картах пластины, порожденных mocloassembly.com, включая корыте чистой, деионизированной воды помечены ' Водохранилище '.
- Используя команду «Рабочем» в программное обеспечение управления, загрузите файл .gwl, созданный нашим программного обеспечения инструментом, последовал другой рабочий «список» команды, которая будет выполняться .gwl файла, загруженного в первой команде.
- Выполнение скрипта с помощью команды «Run» программное обеспечение контроллера.
Примечание: Всегда разрешать роботизированной жидких обработчик завершения выполнения скрипта перед попыткой получить доступ к палубе пространство. - Удалите все пластины из жидкого обработчика палубы. Оставшиеся ДНК могут быть сохранены путем герметизации SetupPlate(s) с алюминиевой пленки и герметизации и хранения при температуре-20 ° C. Уплотнение OutputPlate(s) клеевой пленкой, место в Термоциклер или тепло блок и запустить с параметрами цикла:
37 ° С в течение 2 ч, 50 ° C за 5 мин, 80 ° C в течение 10 мин, провести на 4 ° C
Примечание: После завершения реакции thermocycling OutputPlate(s) может храниться при температуре-20 ° C до тех пор, пока они готовы быть преобразованы.
4. Преобразование реакций [1 день]
-
Оттепель необходимое количество компетентных E. coli ячейки требуется аликвоты (10 мкл/реакции) на льду.
Примечание: Для сохранения стерильности, следующие шаги должны быть выполнены вблизи открытого пламени или внутри Ламинарный шкаф.- В то время как отогрева клетки, подготовьте LB-агар пластины (содержащий соответствующие антибиотик) дозирования 50 мкл 0,1 М IPTG и 50 мкл 20 мг/мл X-Гал на поверхность. Сделайте мастер смесь, если покрытие большое количество реакций. Слой пластины равномерно стерильной стеклянной палочкой или стеклянные бусы и позволяют пластины для отдыха при 37 ° C по меньшей мере 15 мин до обшивки бактерий.
Примечание: Кроме того, добавьте IPTG и X-галлон жидкий агар перед наливают пластины, на 2 мм ИПТГ и 40 мкг/мл X-Гал конечная концентрация. Храните эти пластины из прямого света, как X-Гал светочувствительной.
- В то время как отогрева клетки, подготовьте LB-агар пластины (содержащий соответствующие антибиотик) дозирования 50 мкл 0,1 М IPTG и 50 мкл 20 мг/мл X-Гал на поверхность. Сделайте мастер смесь, если покрытие большое количество реакций. Слой пластины равномерно стерильной стеклянной палочкой или стеклянные бусы и позволяют пластины для отдыха при 37 ° C по меньшей мере 15 мин до обшивки бактерий.
- На льду, кратные 10 мкл компетентных клеток для каждой реакции в новую плиту 96-луночных ПЦР. Это будет пластину преобразования.
- Мкл 1-3 каждой реакции от OutputPlate(s) на соответствующий хорошо в пластину преобразования и инкубировать на льду на 5 мин.
- Печать преобразования пластины с клей фильм и теплового шока в Термоциклер при 42 ° C за 30 s. Затем сразу же место пластину на льду на 2 мин.
- Же скважин преобразования пластины 150 мкл SOC СМИ, запечатать клейкой печатью алюминия и инкубировать при 37 ° C при встряхивании при 900 об/мин за 1 час.
- Пластина полное содержание каждой скважины преобразования пластины на тарелках LB-агар, подготовленный в 4.1.1 с помощью стерильной стеклянной палочкой или стеклянные бусины равномерно покрыть поверхность пластины. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
5. клон проверки [2 дня]
-
Подготовьте один или несколько блоков 96-луночных штанхглубинных культуры с 1,5 мл LB отвара (содержащий соответствующие антибиотики).
- Подобный шаг 2,2, прививать культура штанхглубинных блок с одной белой колоний от каждой плиты LB-агар преобразованных реакций.
- Печать культуры блок с газопроницаемой печатью и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании при 900 об/мин.
Примечание: Модульная, клонирование техника использует сине белые скрининг, поэтому положительные CFUs появится белой табличке LB-агар, в то время как пустой назначения векторов появится синий.
- Изолировать плазмида ДНК от бактериальных культур (например, 2.3) и представить для Сэнгер последовательности для проверки клонов.
Representative Results
Здесь мы показываем, автоматизированная модульная сборка 96 ДНК устройств от различных основных частей ДНК (рис. 1b) с помощью двух автоматизированных роботов жидкого обработки платформ. Каждый transcriptional единицей является линейного расположения промоутер, рибосомных привязки сайта, Джин и transcriptional Терминатор, клонированные в вектор определенного назначения. Тус являются ключевым компонентом многих иерархической цепи генетических образцов28,29,30 и поэтому естественным доказательство концепции для этого подхода. Проверка последовательности клоны могут быть достигнуты в ~ 5 дней от начала до конца, и представлен обзор процесса представлена на рисунке 1a.
Используя описанные инструмент и протокол, мы захватили несколько метрик полезным в определении оптимальной сборки платформы дают определенное количество клонирования реакций будет создан ученый. Рисунок 2a показывает сравнение между реакцией Ассамблеи раз во всех трех условий. Время выполнения является общее время для завершения всех дозирования шаги, необходимые для сборки 96 реакций, который включает в себя всех частей ДНК и реагенты. Практический время относится к общее время, которое человека вручную участвовал в подготовке клонирования реакций, или установки программного обеспечения запущен обработчик жидкости. Рисунок 2b сравнивает стоимость между различными методами. Расходы для одной реакции, подготовленные каждым методом и включают в себя цены на ферменты и одноразовые наконечники, учитывая низкие типичная реакция объем (20 мкл для жидких обработчика, 10 мкл для ручной, 250 nL для акустических распределитель). Один клоны из всех 96 реакций как ручной, так и жидких обработчик подготовлены наборы были последовательными с подмножеством 12 виртуализации для акустических распределитель реакций (рис. 2 c). Правильной последовательности были получены для 95% из 96 Наборы ручной и жидких обработчик. 83% акустических распределитель выборки подмножества были правильными, однако окончательный две реакции не приносить любой белый колоний, вероятно, вызвана недостаточной капель после дозирования реагентов и ДНК была завершена. 2d рисунок иллюстрирует клонирования эффективность реакции, как измеряется соотношение белых колоний на общее количество колоний, которые сопоставимы между вручную (94%) и жидкие обработчик собрал реакций (84%). Интересно когда масштабирование вниз том окончательной реакции с акустической колонки, мы заметили заметное падение эффективности реакции при реакции были подготовлены тома меньше, чем 1 мкл (дополнительный рисунок 1 и Дополнительная таблица 2). Это, вероятно, из-за испарения во время реакции thermocycling, который может привести к увеличению концентрации соли в реакции.
Рисунок 1. Автоматизированный ДНК устройства библиотеки Ассамблея рабочий процесс.
(a) обзор экспериментальных рабочего процесса, представленный в этой работе. (1) исследователи сначала загрузить Genbank файлов для всех частей ДНК и назначения векторов, которые они хотят использовать. (2) далее выбираются ДНК части должны быть включены в Ассамблее. (3 инструмент будет генерировать поле выбора для обработчика автоматизированной жидкость, а также плиты карты помочь с заполнением вручную с частями ДНК и фермента mastermix. (4) с использованием ДНК и реагенты пластины, а также созданного поля выбора, исследователи выполнить сборку клонирования реакций на обработчик жидкость. (5) после завершения реакции преобразования и покрытием для анализа ниже по течению. (b) список ДНК частей, используемых в этой работе. В общей сложности три промоутеров, рибосомных привязки сайтов, четыре кодирования последовательностей, и один терминатор transcriptional были использованы три создания комбинаторных библиотеки 96 ЕП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сравнение через три различных реакция Ассамблеи формы.
(()) установки время реакции для 96 реакций, собранных вручную, через обработчик жидкость и акустических распылитель. Ручной Ассамблея приняла 2 ч 10 мин, все из которых был практический момент. Обработчик жидкого приняли аналогичные количество времени (2 ч 6 мин) для выполнения команд, дозирования, однако лишь небольшая часть этого времени (5 мин) был практический. Акустические колонки занимает значительно меньше времени для выполнения жидкого переводов (5 мин) и приняла минимальный практический время (5 мин). (b) стоимость одного клонирования реакции для каждого метода сборки. Эта цена включает стоимость ферментов, используемые, а также наконечники. (c) последовательность результатов от одной колонии все 96 собрал ЕП. Процент правильных клонов сопоставимо во всех методов Ассамблеи. Обратите внимание, что только подмножество (12) полный 96 Ассамблей были преобразованы из акустической колонки подготовлены образцы. Две реакции не приносить любой белый колоний, скорее всего вызвана недостаточной ДНК и фермента mastermix капель в OutputPlate. (d) сравнение клонирования эффективность реакции между ручной и жидких обработчик подготовленные реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 1. С снижение реакции объем уменьшается эффективность реакции.
Эффективность реакции заметно падение, когда масштабирование вниз реакция объемы ниже 1 мкл. Эта тенденция наблюдается с двух разных окончательный концентрации ДНК; Однако ученые могут выбрать использовать меньшие объемы сэкономить на стоимости реагента, если ниже эффективности может быть терпимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Справочная таблица 1.
Таблица параметров жидких класса ДНК и ФЕРМЕНТ для дозирования различных томов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Справочная таблица 2.
Расчеты эффективности реакции. Сырья CFU номера даны для 12 96 преобразованные реакций, подготовлен через обработчик жидкости и вручную. КОЕ номера также предоставляются для тестирования меньшие объемы окончательной реакции на Акустические колонки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
В заключение, Автоматизация полный процесс создания устройства ДНК, от дизайна в silico жидкой обработке, является жизнеспособной цели с существующих в настоящее время технологии. Программное обеспечение и современная робототехника позволяют создавать рабочие процессы, которые являются экономически эффективным, время эффективной и масштабируемой, а также производит более последовательно воспроизводимые результаты, чем ручные методы. Хотя автоматизация не всегда может быть наиболее экономичным выбором для выполнения протокола, улучшить экспериментальные воспроизводимость и высвобождает время ценные исследователь. Однако в зависимости от используемых аппаратных, использование автоматизации иногда может управлять стоимость и время выполнения значительно ниже, что может быть достигнуто посредством обычных ручных методов. Кроме того Автоматизация захватывает протоколы явно в формализованной образом предотвращение-специальной, кустарного, и анекдотических наилучшей практики на основе экспериментов. Здесь проявляется автоматизированной сборки модульных устройств ДНК, и протокол, электронные файлы и физические ресурсы ДНК, необходимые для читателя, чтобы выполнить эти и подобные, предоставляются эксперименты на своих собственных. Мы надеемся, наличие нашего инструмента, и публикация настоящего Протокола будет служить ресурсом и переместить поле более прозрачной и коммунальной будущее в области процессов сборки ДНК и жидкости, обработка робототехники.
Целесообразность автоматизации оборудования в значительной степени зависит от конфигурации и возможности этого оборудования. Например наши жидкого обработчик использует системы жидкости перемещения нажать аспирата и отказаться от команды. Поршни, что диск системы жидкости являются относительно большой 1 мл шприцы, которая, хотя и является полезным для целого ряда томов, налагает 2 мкл нижний предел для точного дозирования реагентов. Как следствие, мы масштабируется до общего объема клонирования реакций, установить на обработчик жидкого 20 мкл, так как каждый отказаться от команды, необходимые для быть ≥2 мкл. Это фактически удваивает стоимость реакции для жидких нацелен обработчик реакций, однако практический время, необходимое для выполнения этих реакций было значительно сокращено. В целях решения этой проблемы мы повторили реакции установки для всех 96 реакций на акустических жидкого мыла. Это устройство использует ядровой энергии обойтись жидкость непосредственно от одной плиты к другой и может достичь обойтись гораздо ниже томов (2,5 nL) возможно с перемещением стандартных воздуха основан ручной пипетки. С помощью этого устройства, мы смогли сократить общий объем нашей реакции на 250 nL, разницей сокращение по сравнению с вручную подготовленные реакции 10 мкл. Из-за небольших объемов обойтись и отсутствие Подсказка изменения между дозирования шаги, Акустические колонки был способен генерировать же 96 реакций в долю времени (< 5 мин). Меньшие объемы реакции также сэкономить на впустую реагентов, поскольку мы обычно только преобразовать 1-3 мкл реакции. Это, как говорится, использование автоматизации оборудования, в сочетании с интуитивным программным обеспечением, можно сделать генерации большого количества ДНК Ассамблеи реакций доступным для гораздо более широкой академической аудитории.
Здесь мы продемонстрировать полезность нашего программного обеспечения инструментом, однако есть ряд особенностей, которые помогут расширить свою полезность. Во-первых каждый раз, когда инструмент используется для создания комбинаторных сборки, новые пластины часть ДНК должны создаваться, требующих ученый вручную заполнить эти пластины для каждого выполнения сборки. Вместо этого, было бы полезно, если ученый может указать расположение частей в ДНК пластины для использования в Ассамблее. Это позволит использовать высок объём плазмида ДНК комплекты очистки, так как исследователи могли прививать культур из комплекта как библиотека MoClo CIDAR и очистить все образцы вместе при сохранении также местоположение каждой части, указанной в наборе. Во-вторых инструмент в настоящее время поддерживает только использование 96-луночных пластин. Для более крупных проектов, где несколько сотен ДНК устройства должны быть построены количество ДНК, реагентов и назначения пластин может превышать палубе емкость жидкого обработчика. Эта проблема может быть по крайней мере частично, решены путем поддержки выше плотность плиты форматов (384 или 1536-ну). Наконец инструмент в настоящее время поддерживает только один тип жидкости обработчика и ДНК Ассамблеи стратегии. Хотя это относительно легко преобразовать инструмент производства жидких обработчика инструкции акустическая распределитель формат с помощью электронной таблицы программного обеспечения, мы надеемся расширить встроенную поддержку для многих различных жидких обработчики, которые бы значительно расширить ее применимости, как совместимость с другими общих методов Ассамблеи ДНК желаете Гибсон Ассамблея31.
Важной частью этой автоматизированной сборки экосистемы является набор программных инструментов, преобразующий планы высокого уровня Ассамблеи в автоматизации дружественных протоколы, которые явно запланированы для запуска на жидкость, обработку роботов. Хотя существует ряд средств программного обеспечения позволяют исследователям дизайн сборки в silico включая Benchling, MoClo планировщик и Ворон32, немногие имеют возможность воплотить эти проекты в исполняемых инструкций для запуска на жидкости обработчик. К этому конец, работы, такие как автоматизация PR-PR и кукловод33,34,35 начали сделать эти инструменты доступны. Кроме того коммерческие организации, работающие в этой области глядя на пути введения «облако лаборатории», которые предоставляют экспериментальные услуги для больших групп конечных пользователей через механизм автоматизации. Протокол, изложенных в настоящем документе может служить кусок какого-либо из этих усилий при условии, что они представлены в виде службы.
Хотя автоматизированной сборки ДНК устройств является непосредственной и очевидной ценность для синтетической биологии, наш протокол является полезным для более широкого сообщества молекулярные биологи также. Автоматизация сборки ДНК позволяет большое количество известных, но аналогичные, генетические устройства создаваться параллельно и могут включить быстрый синтез выражение библиотек для скрининга и тестирования в развитие исследований препарата. Мы надеемся, что наш инструмент программного обеспечения будет делать большие усилия Ассамблеи комбинаторной на основе ДНК более доступными и служить в качестве полезного ресурса для синтетической биологии, а также крупных академических кругов.
Disclosures
Денсмор является президентом и соучредителем Тиммонс решетки Automation, Inc. и Маккарти, решетки сотрудников. Решетки делает программное обеспечение и услуги для автоматизации многих из процесса, описанного.
Acknowledgments
Мы благодарим Swapnil Бхатия, Алехандро Пелаэс и Джонсон Лам за работу на кукольника проекта, а также Swati Карр, Рэйчел Смит и Томас Коста за помощь с этой рукописи. Эта работа финансировалась NSF карьеры премии #1253856. Также он финансируется NSF экспедиции в вычисления премии #1522074.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware / Software | |||
| Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
| Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
| Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
| Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
| ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
| Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resources | |||
| mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
| CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
| CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labware | |||
| 50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
| 2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
| Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
| Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
| Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
| Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
| PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
| T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
| BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
| BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
| T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
| Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
| Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
| SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
| LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
| LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
| Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | |||
| Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
| Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
References
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
- Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
- Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
- Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
- Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
- Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
- Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
- Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
- Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
- Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
- Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
- Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
- Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
- Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
- Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
- Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
- Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
- Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
- Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
- Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).
