Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج الفئران من المجموعة الثانية Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

والغرض من هذا البروتوكول هو تقليد مجموعة بشرية الثانية العقدية (GBS) الاستعمار المهبل في نموذج الفئران. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتحقيق الاستجابة المناعية والعوامل البكتيرية المساهمة في GBS استمرار المهبلي، وكذلك لاختبار الاستراتيجيات العلاجية.

Abstract

العقدية القاطعة للدر (المجموعة الثانية العقدية، GBS)، هو إيجابية الجرام، المستعمر بدون أعراض في الجهاز الهضمي البشري والقناة المهبلية من 10 - 30٪ من البالغين. في الأفراد المناعة للخطر، بما في ذلك حديثي الولادة، والنساء الحوامل، وكبار السن، قد GBS التبديل إلى الممرض الغازية تسبب تعفن الدم والتهاب المفاصل والالتهاب الرئوي، والتهاب السحايا. لأن GBS هي العوامل المسببة للأمراض البكتيرية الرائدة في مجال حديثي الولادة، وتتألف الوقاية الحالية من أواخر فحص الحمل للGBS الاستعمار المهبل واللاحقة العلاج بالمضادات الحيوية الفترة المحيطة بالولادة من الأمهات GBS إيجابية. عبء المهبل GBS الثقيل هو أحد عوامل الخطر بالنسبة للأمراض الأطفال حديثي الولادة والاستعمار. للأسف، لا يعرف إلا القليل عن البلد المضيف والعوامل البكتيرية التي تشجع أو تسمح GBS الاستعمار المهبل. يصف هذا البروتوكول تقنية لإنشاء المستمر GBS الاستعمار المهبل باستخدام واحدة-β استراديول ما قبل المعالجة وأخذ العينات اليومية لتحديد مبناها البكتيريةد. ذلك مزيدا من التفاصيل أساليب لإدارة العلاجات أو الكواشف من فوائد إضافية وجمع المهبل السائل غسل وأنسجة الجهاز التناسلي. وهذا نموذج الفأر يعزز فهم التفاعل GBS المضيف ضمن بيئة المهبل، والتي سوف تؤدي إلى الأهداف العلاجية المحتملة للسيطرة الاستعمار المهبل الأمهات أثناء الحمل ومنع انتقال العدوى إلى الأطفال حديثي الولادة المعرضين للخطر. كما سيكون من مصلحة لزيادة فهمنا للتفاعلات البكتيريا في استضافة العامة في القناة المهبلية الإناث.

Introduction

العقدية القاطعة للدر، المجموعة الثانية العقدية (GBS)، هو، البكتيريا إيجابية الجرام مغلفة التي غالبا ما تكون معزولة من الأمعاء والجهاز البولي التناسلي من البالغين الأصحاء. في 1970s، ظهرت GBS وكيلا للوفيات حديثي الولادة المعدية، مع أكثر من 7000 حالة من حالات مرض حديثي الولادة سنويا 1. المبكر بداية GBS مرض (التخلص من الذخائر المتفجرة) ويحدث في الساعات أو الأيام الأولى من الحياة، ويطرح نفسه هو الالتهاب الرئوي أو ضيق في التنفس، وغالبا ما يتطور إلى تسمم الدم، في حين أن المرض تأخر ظهور (اللد) تستتبعه بعد عدة أشهر، ويقدم مع تجرثم الدم، والتي في كثير من الأحيان التقدم إلى التهاب السحايا 2. اعتبارا من عام 2002، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها توصي الفحص الشامل لGBS الاستعمار المهبل في أواخر الحمل والوقاية باستخدام المضادات الحيوية الولاد (IAP) لأمهات GBS الإيجابية 1. وعلى الرغم من الحد من المرض المبكر بداية إلى ما يقرب من 1000 حالة في الولايات المتحدة بسبب سنويا لIAP،يبقى GBS السبب الرئيسي للتسمم في حديثي الولادة في وقت مبكر الحدوث، وتأخر ظهور قوع يبقى بمنأى 1. سواء في الرحم، أثناء العمل، أو حتى في الحالات المتأخرة من البداية، تعرض الرضع لGBS يتطلب البقاء على قيد الحياة، مستعرضة من خلال عدد من البيئات المضيفة والحواجز، والتهرب المناعي، وفي حالة التهاب السحايا، عبور بالدم درجة عالية من التنظيم حاجز الدماغ 2. المنبع من هذه التفاعلات خبيثة داخل الوليد هو الاستعمار الأولي من القناة المهبلية الأمهات. الأم GBS معدلات الاستعمار المهبلية تتراوح 8-18٪ في البلدان المتقدمة والنامية، وبمعدل متوسط يقدر ب 12.7٪ 3،4. GBS استعمار القناة المهبلية أثناء الحمل قد يكون ثابتا، متقطعة، أو عابرة في الطبيعة بين النساء الفردية 5. ومن المثير للاهتمام، ويرتبط والأمهات العمر> 36 عاما مع الاستعمار المستمرة 6. عوامل الخطر البيولوجية والاجتماعية والاقتصادية العديدة لGBS الاستعمار المهبلتم تحديدها. وتشمل العوامل البيولوجية الهضمي الاستعمار GBS وغياب الملبنة في الأمعاء. ومع ذلك، كما تم المرتبطة العرق، السمنة، والنظافة، والنشاط الجنسي مع GBS النقل المهبل 7.

على الرغم من اشتهر يسبب العدوى حديثي الولادة، يسبب GBS أيضا مجموعة متنوعة من الالتهابات الأمهات على حد سواء الفترة المحيطة بالولادة وبعد الولادة. يتم زيادة GBS النقل في النساء مع تقديم المهبل 8، وفي بعض الحالات، قد يكون حتى الكيان المرض 9. بالإضافة إلى ذلك، GBS صعود الجهاز التناسلي أثناء الحمل قد يؤدي إلى عدوى داخل السلى أو شريوأمنيونيتيس 10. وعلاوة على ذلك، في ما يصل إلى 3.5٪ من حالات الحمل، GBS نشر إلى المثانة البولية أن يسبب عدوى المسالك البولية أو الجرثومية عديمة الأعراض (11). ويرتبط الجرثومية GBS خلال فترة الحمل مع زيادة خطر الاصابة بالحمى أثناء الولادة، شريوأمنيونيتيس، الولادة المبكرة، وprematurالبريد تمزق الأغشية 12. معا، ويرتبط وجود GBS داخل القناة المهبلية لالتهابات أنسجة المضيف متعددة، والقدرة على القضاء على GBS من هذا المتخصصة أمر حتمي بالنسبة للصحة الأمهات والأطفال حديثي الولادة.

حتى وقت قريب، والغالبية العظمى من عمل دراسة التفاعلات GBS مع الجهاز عنقي مهبلي اقتصر على نماذج الخلايا في المختبر 13-15. وقد كشفت هذه التجارب في المختبر العوامل البكتيرية التي تعتبر مهمة للالتزام، بما في ذلك البروتينات السطحية مثل هذه الشعرة وسيرين الغنية يكرر 17،18، وكذلك النظم التنظيمية اثنين من عناصر 15،19 واستجابة النسخي العالمية للظهارة المهبل ل GBS 19. ومع ذلك، لتوضيح كامل التفاعلات المضيف ميكروب داخل القناة المهبلية، وهذا نموذج حيوان قوي أمر ضروري. أظهر العمل في وقت مبكر أن GBS يمكن استردادها من القناة المهبلية من الفئران الملقحة 20،21 والجرذان <سوب> 22 في كل الظروف الحوامل وغير الحوامل. في عام 2005، كان على غرار المدى القصير GBS الاستعمار المهبل في الفئران لدراسة فعالية انزيم فج التحللي لعلاج GBS المهبلية خلال فترة 24 ساعة 23. بعد عدة سنوات، وقد وضعت على المدى الطويل GBS الاستعمار المهبل نموذج الفأر لدراسة العوامل المضيفة والبكتيرية التي تحكم GBS المثابرة. وقد حدد هذا النموذج العديد من العوامل التي تسهم في GBS الاستعمار، بما في ذلك الزوائد سطح 17،18 وGBS أنظمة اثنين من عناصر 19،24. وقد ساهم هذا النموذج على تحديد آليات الاستجابة المضيف 19،25، وكان يستخدم لاختبار العديد من الاستراتيجيات العلاجية، بما في ذلك الببتيدات المناعية 26 و البروبيوتيك 27. هذا البروتوكول يعطي التوجيهات اللازمة لتطعيم GBS في القناة المهبلية الماوس وتتبع فيما بعد الاستعمار وجمع عينات لإجراء المزيد من التحليلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق كل عمل الحيوانية مكتب مختبر رعاية الحيوان في جامعة ولاية سان دييغو وأجرى بموجب المعايير البيطرية مقبولة. إناث الفئران، سن 8-16 أسابيع استخدمت، لتطوير هذا الأسلوب.

1. إعداد وداخل الصفاق حقن β استراديول

  1. قياس من β استراديول (0.5 ملغ / الماوس) على وزن الورق أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE). تنبيه: β استراديول يمكن استيعابها من خلال الجلد والأغشية المخاطية.
  2. نقل بيتا استراديول إلى أنبوب مخروطي 15 مل ودوامة حتى تتم إزالة كافة كتل وβ استراديول هو مسحوق ناعم. وضع زيت السمسم (100 ميكرولتر / الماوس) في حقنة 10 مل. حقنة فلتر زيت السمسم في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على β استراديول باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. دوامة أنبوب مخروطي 15 مل حتى β استراديول هو تعليق متجانسة في زيت السمسم.
  3. وضع وβ-ESتعليق tradiol إلى حقنة 10 مل جديدة. مع 18 G، 1 في. إبرة، قسامة 100 ميكرولتر من تعليق في الحقن السلين 1 مل. تحضير حقنة واحدة لكل الماوس. وضع جديد، معقم 26 G، ½ الإضافية. إبرة في كل حقنة السلين.
  4. إدارة 0.5 ملغ من β استراديول علقت في 100 ميكرولتر من زيت السمسم (5 ملغ / مل) إلى كل فأر 24 ساعة قبل التلقيح البكتيرى. حقن كل فأر داخل التجويف البريتوني، في الأرباع أسفل البطن، فقط إلى اليمين أو اليسار من خط الوسط، كما هو موضح سابقا 28.
    ملاحظة: لا تنظيف أو لقطة من موقع الحقن ضروري.

2. المهبلي التلقيح مع GBS

  1. يوم واحد قبل التلقيح، وتنمو ثقافة السائل بين عشية وضحاها 5 مل من سلالة GBS الاهتمام، مثل A909 (المصلي الأولى أ)، في تود هيويت مرق (THB) عند 37 درجة مئوية.
  2. ثقافة فرعية ثقافة GBS بين عشية وضحاها في حجم 01:10 في THB الطازجة واحتضان عند 37 درجة مئوية. زراعةالبكتيريا إلى مرحلة منتصف السجل (OD 600 = 0،4-0،5). ملاحظة: هذا وعادة ما تأخذ 2-3 ساعة، اعتمادا على سلالة من GBS.
  3. نقل ثقافة فرعية إلى العقيمة 15 مل أنبوب وبيليه البكتيريا المخروطية في 3000 × ز لمدة 5 دقائق. نضح طاف. resuspend الكرية الجرثومي في 200 ميكرولتر من العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS).
  4. باستخدام بيليه معلق، وجلب 3-5 مل من برنامج تلفزيوني (1 مل لكل 10 الفئران) بالضبط OD 600 = 0.4 في أنبوب جديد ثقافة 5 مل. وسوف يكون هذا التركيز من ~ 1 × 10 8 وحدات تشكيل مستعمرة (كفو) / مل. نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل الجديد وإعادة بيليه البكتيريا في 3000 × ز لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
  5. Resuspend وبيليه في برنامج تلفزيوني في 10/01 حجم الأصلي. على سبيل المثال، إذا تم مكعبات 3 مل من OD 600 = 0.4، resuspend ثم في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. ملاحظة: هذا هو تعليق النهائي البكتيري (~ 1 × 10 9 كفو / مل) المستخدمة للتلقيح الحيوان.
  6. Reserve 50 ميكرولتر من هذا التعليق لتخفيف المسلسل والطلاء على أجار THB لتحديد اللقاح المحدد.
  7. تطعيم كل فأر مع 10 ميكرولتر من تعليق البكتيرية النهائي بحيث يدار أن 1 × 10 7 كفو لكل الماوس.
    1. لتطعيم، وكبح جماح الماوس يدويا عن طريق تأمين الجلد المترهل في القفا من الرقبة بين الإبهام معالج والسبابة ثم شل حركة الذيل، كما هو موضح سابقا 28.
    2. وضع 10 ميكرولتر من GBS أعدت في الخطوة 2.6 إلى هلام 200 ميكرولتر ماصة تحميل طرف. إدراج غيض من 5 إلى 10 مم في تجويف المهبل والاستغناء عن 10 ميكرولتر من اللقاح.
      ويفضل جل نصائح تحميل أكثر القياسية نصائح-200 ميكرولتر للحد من خطر الصدمة الجهاز أو الإصابة، لا سيما في الفئران الأصغر سنا أو أصغر: ملاحظة.
    3. مباشرة بعد التلقيح، والإفراج عن القفا من الرقبة ورفع النهاية الخلفية من الفأرة، ورفع الماوس من ذيله وثALKING الكفوف الأمامية على سطح صلب ل~ 1 دقيقة.
    4. تفقد البصر فتحة المهبل لأي ارتداد اللقاح. إذا لوحظ ارتجاعي، يمكن استخدام معلومات سرية جديدة ماصة للتلاعب أو توسيع فتحة المهبل، مما يسهل امتصاص من ارتجاع في التجويف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستنشق ارتجاعي عبر ماصة وإعادة تلقيح.
      ملاحظة: إذا إدارة وكلاء موضعي، والكائنات بروبيوتيك، أو البروتينات من الفائدة، ويجوز إعطاء حجم ما يصل الى 20 ميكرولتر في منطقة عازلة فيزيولوجي في القناة المهبلية.

3. ينظف المهبل التجويف لتحديد GBS تحميل

  1. إعداد واحد أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل في الماوس عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. فقط قبل ينظف، قبل الرطب مسحة في برنامج تلفزيوني.
  2. كبح الماوس كما هو موضح في الخطوة 2.7.1 وتضاف مسحة 10 مم في تجويف المهبل. تناوب بلطف مسحة 4 مرات في اتجاه عقارب الساعة و 4 مرات عكس اتجاه عقارب الساعة، وتطبيق ضغط طفيف على جدار المهبل.
  3. نقل مسحة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قبل الطلاء، ودوامة أنبوب microcentrifuge ل~ 15 ثانية للافراج عن البكتيريا من مسحة. متسلسل تمييع كل عينة في برنامج تلفزيوني ولوحة 20 ميكرولتر من التخفيفات 1:10 من خلال 1: 10000 على لوحات المتوسطة أجار التفاضلية إعداد فقا لتعليمات الشركة الصانعة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. سوف تظهر المستعمرات GBS إما ردي مشرق أو بنفسجي فاتح اللون. سيتم مستعمل النباتات المحلية الأخرى، أو سوف تظهر كما المستعمرات أزرق، أبيض، أو رمادي.

4. جمع السائل المهبلي الغسل

  1. كبح الماوس كما هو موضح في الخطوة 2.7.1. باستخدام 200 ميكرولتر هلام تحميل ماصة، الماصة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في تجويف المهبل. الماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 4 مرات داخل التجويف، ثم سحب وحدة التخزين بالكامل في نفس طرف ماصة. ملاحظة: إذا كان السائل غسل سميكا مع المخاطية، معيار 200 ميكرولتر ماصةيمكن استخدامها لجمع السائل غسل النهائي.
  2. إذا إنقاذ السائل غسل لتحليل خلوى أو كفو الكمي، موزعة في أنبوب microcentrifuge 0.7 مل. إذا تحديد مرحلة الشياع، موزعة على الأقل 5 ميكرولتر من السائل غسل على شريحة زجاجية ومراقبة الخلايا تحت التكبير 100X على المجهر الضوئي. ملاحظة: للحصول على أمثلة من مراحل داقية، انظر الشكل 1.

5. تشريح الأنسجة والتجانس

  1. لكل الماوس، وإعداد ثلاثة أنابيب 2 مل سقف المسمار (واحد لكل الأنسجة: المهبل وعنق الرحم، والرحم). ملء كل أنبوب مع وافرة (0،4-0،5 غرام) 1.0 مم حبات زركونيا لتغطية الجزء السفلي على شكل مخروطي للأنبوب.
  2. الأوتوكلاف أنابيب مستعدة قبل جمع الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، وخاصة إذا كان قياس الحمولة الجرثومية. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى كل أنبوب. وزن كل أنبوب بعد التعقيم وسجل للرجوع إليها في المستقبل لحساب تعافى وزن الأنسجة.
    3. 2 الخنق وخلع عنق الرحم. رش أسفل البطن بطني مع 70٪ ETOH. مع مقص العقيمة، وفتح تجويف بطني حوضي، ورفع الجلد مرة أخرى وعضلات البطن، وتهجير الأمعاء بحيث يتعرض الجهاز التناسلي.
  3. تعقيم مقص مع 70٪ ETOH، محو نظيفة إذا لزم الأمر، وقطع كل من قرون الرحم منتصف طولها ما بين جسم الرحم والمبايض. باستخدام مقص وملقط، والدهون الحشوية منفصل، الأغشية، والمثانة البولية بعيدا عن الجهاز التناسلي، والانتقال caudally.
  4. تعقيم مقص كما هو موضح في الخطوة 5.4. قطع مستعرض المهبل أقرب إلى الفرج ممكن لفصل الجهاز التناسلي من الجسم. رفع وإزالة الجهاز التناسلي سليمة ووضعه في طبق بتري معقمة.
  5. باستخدام شفرة حلاقة جديدة، فصل الرحم من عنق الرحم في قطع عرضية واحدة. تعقيم شفرة حلاقة مع 70٪ETOH، ثم فصل عنق الرحم من المهبل في قطع عرضية واحدة. ملاحظة: لن يكون هناك الحد الأدنى من أنسجة الرحم لا تزال تعلق على عنق الرحم. سيكون هناك كمية ضئيلة من الأنسجة المهبلية لا تزال تعلق على عنق الرحم.
  6. باستخدام ملقط معقم، ونقل كل من الأنسجة في كل أنابيب 2 مل من التي تحتوي على برنامج تلفزيوني والمجانسة الخرز. تنظيف ملقط مع 70٪ ETOH بين التعامل مع كل الأنسجة.
  7. تزن كل 2 مل أنبوب سقف المسمار وطرح الوزن الأصلي من أنبوب لتحديد وزن الأنسجة. تختلف الأوزان الأنسجة عادة ما بين 20 - 100 ملغ. بإحكام اغلاق أنابيب سقف المسمار وتجانس الأنسجة لمدة 1 دقيقة على السرعة القصوى في الخالط الأنسجة.
  8. لتحديد الحمولة الجرثومية، متسلسل تمييع 25 ميكرولتر من جناسة الأنسجة والتخفيفات لوحة 1:10 من خلال 1: 10000 على لوحات المتوسطة أجار التفاضلية. احتضان لوحات كما هو موضح في الخطوة 3.3. لتخزين العينات لتقدير خلوى، وتجميد الخليط الأنسجة في -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلال تطوير هذا النموذج، لوحظ متعددة بشأن العوامل التي تؤثر على مدة GBS الاستعمار المهبل. لتحديد مرحلة كيف داقية في الآثار التلقيح GBS استمرار البكتيرية، ونظموا الفئران في يوم من التلقيح عن طريق السائل غسل المهبل. ويوضح الشكل 1 المراحل الأربع لدورة داقية الماوس، على النحو الذي يحدده الرطب جبل المهبل السائل غسل، وهي طريقة راسخة 29. تم تقسيم الفئران إلى مجموعات على أساس هذه المرحلة الأولية، وتمت مراقبة GBS استمرار مع مرور الوقت عبر ينظف المهبل. كان تحت الاستعمار الفئران الملقحة في مرحلة مقدمات الوداق مع GBS أطول من أي مرحلة أخرى من شبق، ولا سيما في هجوع الودق في وقت التلقيح (الشكل 2). وبناء على هذه النتائج، في النموذج الحالي، يتم التعامل مع الفئران مع β استراديول يوم واحد قبل GBS التلقيح لمزامنتها إلى مرحلة مقدمات الوداق. وقد أظهرت نماذج الفئران الأخرى من التهابات المسالك التناسلية وزيادة قدرة الكائن الممرض أن تستمر عندما أصيب الفئران في مرحلة الشبق من خلال العلاج استراديول خارجي 30،31. لتحديد ما إذا حدث هذه الظاهرة أيضا أثناء الاستعمار المهبل مع GBS، تم رصد GBS استمرار أثناء العلاج المتكرر-β استراديول. شبق حقت تعزيز GBS A909 (أميركية نوع مجموعة الثقافة، آي تي سي سي # ايه-1138) استمرار في CD-1 الفئران، مع 90٪ الاستعمار 2 أسابيع بعد التلقيح (الشكل 3A). في تجربة نموذجية مع جرعة واحدة من β استراديول قبل التلقيح، وكان تحت الاستعمار٪ فقط 40-50 من الفئران الاسبوع بعد التطعيم واحد (الشكل 4). يعني تعافى GBS كفو من هذه الفئران يقلد النسبة المئوية للاستعمار (الشكل 3B). على الرغم من أن تم الحصول على هذه النتائج من تجارب مستقلة، والشياطين هذه البياناتtrate أن الحفاظ على شبق مستمر يعزز GBS استمرار المهبل في أغلب CD-1 الفئران.

أثناء إجراء تجارب الاستعمار باستخدام البشرية المختلفة GBS يعزل، لوحظ أن سلالات تفاوتت في قدرتها على الاستمرار في CD-1 الفئران، تتراوح بين عدة أيام إلى ما بعد شهر. من سلالات اختبار، وكان NCTC 10/84 أقصر مدة، A909 وCOH1 استمرت لمدة 1-2 أسابيع، في حين استمرت سلالة CJB111 في معظم الفئران لمدة أسبوعين (الشكل 4)، وحتى إلى ما بعد شهر (لا تظهر البيانات) . حتى الآن، لم يكن هناك أي ارتباط الملحوظ من المصلي والقدرة على الاستمرار في القناة المهبلية الماوس؛ ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن فروق ذات دلالة إحصائية بين سلالات GBS الفردية 25. وتطرق البحث إلى قدرة GBS لاستعمار متعددة خطوط الماوس الفطرية والأباعد. استمرت GBS سلالة A909 في القناة المهبلية لمدة أسبوع تقريبا في الأباعد CD-1الفئران والجرذان FVB الفطرية (الشكل 5). بدلا من ذلك، كان تحت الاستعمار غالبية الفطرية BALB / ج و C57BL / 6 في أسبوع واحد (الشكل 5) وبقي المستعمر لمدة شهر أو بعده (لا تظهر البيانات).

باستخدام هذا البروتوكول، وتصور GBS الاستعمار المهبل في الجسم الحي، فحقن الفئران مع البلازميد، معربا عن GFP GBS سلالة وجمع الأنسجة للفحص المجهري الفلورسنت. تم الكشف عن GFP-GBS كلا التمسك الفئران ظهارة المهبل (الشكل 6A) وعلى مقربة من النباتات المهبلية المحلية الأخرى (الشكل 6B). تم الكشف عن أي إشارة GFP في الفئران التي قد مسح GFP-GBS في وقت جمع الأنسجة (لا تظهر البيانات).

شكل 1
الشكل 1: تحديد مرحلة الشياع من غير ملوثين الفئران المهبل الغسل السائل. (A) مقدمات الوداق: وفرة الأنوية الخلايا الظهارية الحرشفية (الأسهم السوداء). (ب) شبق: وفرة متقرن الخلايا الظهارية الحرشفية (الأسهم الزرقاء). (C) تلية الوداق: خليط من الخلايا الظهارية الحرشفية الأنوية ومتقرن وفي الغالب الكريات البيض (الأسهم الرمادية). (D) هجوع الودق: الكريات البيض وفيرة. التكبير = 100X، شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: دقي المرحلة الآثار المهبل إصرار GBS. في المئة من CD-1 الفئران مع المستعمر، 1 × 10 7 كفو GBS A909 مع مرور الوقت. تم تجميع الفئران (ن = 7-11 / مجموعة) بناء على خشبة المسرح وداقية في وقت GBS التلقيح، على النحو الذي يحدده غسيل مهبلي مائع. يظهر تجربة واحدة مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من الأعمال المنشورة سابقا وطبع بإذن 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): استمرار العلاج مع β استراديول يعزز GBS المهبل الثبات. في المئة المستعمرة (A) أو استردادها كفو (ب) من CD-1 الفئران (ن = 10) تلقيح مع 1 × 10 7 كفو GBS A909 والحفاظ على المعاملة β استراديول. تم حقن الفئران مع β استراديول يوم واحد قبل GBS التلقيح وفي أيام 1 و 3 و 5 بعد التطعيم. يظهر تجربة واحدة مستقلة. خط في الفقرة (ب) يمثل يعني تعافى كفو. 708fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: GBS سلالات تختلف في قدرتها على الاستمرار في المهبل المسالك. الأباعد CD-1 الفئران تم حقن (ن = 10 / مجموعة) مع جرعة واحدة من β استراديول يوم واحد قبل GBS التلقيح مع 1 × 10 7 كفو من السلالات GBS معين. وأجريت التجارب مع كل سلالة بشكل مستقل وتكررت ثلاث مرات على الأقل. يظهر نتيجة ممثل واحد. تم تعديل هذا الرقم من الأعمال المنشورة سابقا وطبع بإذن 25. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

pload / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
الرقم 5: الفأر سلالات تختلف في قدرتها على أن تكون المستعمر مع GBS في المهبل المسالك. تم حقن الفئران من سلالات خلفية أشار بجرعة واحدة من β استراديول قبل يوم واحد لتلقيح مع 1 × 10 7 كفو من GBS A909. وأجريت التجارب مع كل سلالة بشكل مستقل وتكررت مرتين على الأقل. يظهر نتيجة ممثل واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: التصوير فلوري GBS داخل ماوس المهبلية المسالك. تصور GFP- معربا عن GBS (الأخضر) على طول ظهارة المهبل عند التكبير = 630X، شريط مقياس = 50 ميكرومتر (A)، وعلى مقربة من endogenouالصورة الميكروبات المهبلية في التكبير = 1،000X، شريط النطاق = 20 ميكرون (B). الزرقاء وصمة عار = دابي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: تجميع GBS سلالات وخطوط ماوس المستغلة للدراسات الاستعمار المهبل. يشار إلى GBS سلالات الخلفية، وخطوط الماوس، وجرعة β استراديول. ويسلط الضوء على الدراسات التي تستخدم النموذج الذي وصفها في هذا العمل في الرمادي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتعزيز النهوض فهم التفاعلات GBS مع كل من المضيف والميكروبات الأخرى في سياق المضيف، مطلوب نموذج حيواني. يصف هذا العمل الجوانب التقنية لإنشاء GBS الاستعمار المهبل في الفئران. هذا البروتوكول يحقق> 90٪ الاستعمار من الفئران من دون استخدام التخدير لتطعيم البكتيريا أو لجمع عينات مسحة،-مثبطات المناعة لتمكين الاستعمار، المهبل قبل الغسل، أو مضافة إلى رشاقته اللقاح. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يوضح استنساخ قوي، مع تقلب متواضع بين التجريبي في كل من طول GBS استمرار وعبء البكتيرية. نتائج تمثيلية تبين في هذه الدراسة هي تجميع لتجارب مستقلة وينبغي أن تكون مرجعا لتصميم التجارب في المستقبل؛ ومع ذلك، ينبغي إجراء مقارنات مباشرة عبر سلالات GBS وخطوط الفأر مع الرعاية.

هذا نموذج يحاكي colonizati البشريعلى أن في الغشاء المخاطي الاستعمار GBS المهبل من الفئران يبدو أن تقتصر على الجهاز التناسلي. وعلى الرغم من صعود في عنق الرحم والرحم وقد لوحظ مع العديد من GBS سلالات 25، الفئران لا يظهر أعراض الاعتلال أو الوفاة، حتى بعد أشهر من الاستعمار. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على GBS وسلالات الماوس درس، والفئران عرض ثابت أو عابرة الاستعمار المهبل، وهو أمر مفيد لدراسة العوامل البكتيرية واستضافة الاستجابات المناعية، على التوالي. في هذا النموذج، بعض الفئران عرض الاستعمار متقطعة. ومن غير المعروف حاليا ما إذا كانت الفئران تصبح استعمارها في نقطة زمنية لاحقة أو إذا انخفض الاستعمار أقل من الحد من الكشف، وعادة 50-100 كفو، في نقطة زمنية معينة. وتجدر الإشارة، لم يحترم انتقال بين الفئران عندما استعمرت ويتم إيواء الفئران غير المستعمر معا على مدى عدة أسابيع (لا تظهر البيانات).

يستخدم هذا الأسلوب وسيلة انتقائية والتفاضلية المتاحة تجاريالGBS لتحديد البكتيرية أعباء الماوس. GBS ينمو كما مشرق الوردي أو البنفسجي المستعمرات التي هي واضحة بسهولة بعد 24 ساعة من الحضانة. وقد أظهرت هذه الوسائط لحساسية أعلى للكشف عن GBS بالمقارنة مع وسائل الإعلام الأخرى، بما في ذلك أجار الدم وغرناطة المتوسطة 32، واستخدمت في تركيبة مع الاختبارات اللاتكس حبة تراص لتأكيد GBS السريرية يعزل 18. في هذه الدراسة، استعمرت مشرق الوردي أو البنفسجي المستعمرات من غير GBS-لم تم انتشال الفئران. وبعض النباتات المحلية، وعادة الأنواع المعوية، كما تنمو المستعمرات الزرقاء، وبعض المستعمرات تظهر بيضاء، رمادي، أو شاحب جدا الوردي. الأهم من ذلك، ينبغي أن يحسب لوحات بعد 18-24 ساعة من الحضانة، كما المستعمرات غير GBS قد تتضمن الصباغ الوردي إذا تركت في الحاضنة أو على الفوق لفترات أطول. وقد لاحظنا، كما تم الإبلاغ عن 32 سابقا، أن بعض S. المقيحة المعزولة ستشكل المستعمرات الوردي على CHROMagar StrepB، ولكن هذه جolonies عادة ما تكون أصغر من المستعمرات GBS. لم يتم عزل المقيحة S. من البكتريا المهبلية الذاتية من الفئران في هذه الدراسات، ولكن ينبغي النظر في هذه الملاحظة في العمل في المستقبل.

تم الحصول على معظم النتائج من الأباعد خط الماوس CD-1، والذي يدل على الاستجابات المناعية الفطرية قوية خلال الأيام القليلة الأولى بعد التلقيح، مع إزالة البكتيريا لاحقا في معظم الفئران 19. لقد اختبرت الآخرين أيضا ضغوطا إضافية GBS ولقد لوحظ استمرار أطول الأوقات 33،34. منذ تطوير هذا النموذج، بدأت جماعات أخرى لتطوير نماذج الماوس مماثلة من GBS الاستعمار المهبلي لدراسة تأثير المضيف الاستجابات المناعية 33،35، والعلاجات الوقائية 36،37، ونقل إلى الجنين في الرحم 34،38. ويمكن تفسير هذه الاختلافات من خلال مجموعة متنوعة من العوامل، بما في ذلك العوامل الوراثية التي تؤثر على الاستجابات المناعية وركان تكوين البكتريا المهبلية الأم. قمنا بتجميع قائمة من سلالات GBS وخطوط الماوس منها التي تم دراستها حتى الآن في GBS دراسات الاستعمار المهبل (الجدول 1). عدد من الدراسات الحديثة مع النماذج الحيوانية يسلط الضوء على الاهتمام وضرورة هذه الأنواع من النماذج في مجال البحث المرضية GBS.

داخل القناة المهبلية، وينظم المناعة المخاطية بإحكام من قبل هرمونات الستيرويد 44، وحتى جرعة واحدة من β استراديول، كما هو موضح في هذا النموذج، يشوش الاستجابة المناعية. وحتى مع ذلك، هناك الاستجابات المناعية الفطرية قوية خلال الأيام القليلة الأولى من GBS الاستعمار 19،25، مما يشير إلى أن الاستجابات المناعية المتضررة سليمة إلى حد كبير. النماذج التي تنطوي على تكرار الحقن-β استراديول قد يطيل GBS استمرار المهبل، كما هو موضح في هذه الدراسة (الشكل 3) وآخرين 33. ومع ذلك، الاستجابات المناعية وphysi الجهاز التناسليology قد تكون أكثر مرتبك، مما يجعل النتائج صعبة التفسير. الأهم من ذلك أن الاختلافات وصفها في مختلف GBS يعزل ويجوز تغيير سلالات الفئران في هذه الدراسة خلال نماذج من شبق مستمر ويجب التحقيق في العمل في المستقبل. وتجدر الإشارة، لا مرحلة الشياع ولا GBS المصلي أثرت الاستعمار المهبل في نموذج الفئران 22. بالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة المهبلية الحمضية الإنسان من 3،6-4،5 45 يختلف بشكل كبير من درجة الحموضة المهبلية الفئران أكثر حيادا 6.5 46، والتي قد تؤثر على التعبير الجيني GBS والعوامل التالية التي تسهم في الاستعمار. وأخيرا، والنباتات المهبلية الأم متميزة بين البشر ونظرائهم الفئران نموذج، والعمل في المستقبل ينبغي أن تدرس الاستعمار GBS في الفئران معروف المعايشات تحمل النباتات المهبلية الإنسان.

وباختصار، فقد سعت هذه الدراسات إلى دراسة العوامل المضيفة والبكتيرية التي تحكم GBS الاستعمار المهبل. في المقام الأول، وقوية، نموذج حيواني مبتكرة من GBS العقيد المهبلonization المتقدمة في هذا العمل يمكن أن تستخدم لوصف التفاعلات المضيف ميكروب المعقدة في بيئة المهبل في الجسم الحي. المعلومات التي تم الحصول عليها من هذا النموذج بالفعل زيادة كبيرة في معرفة المكونات المناعية والجينات GBS المحددة التي تتحكم GBS استمرار المهبل. وعلاوة على ذلك، أثارت هذه النتائج أسئلة إضافية، وسوف تكون مفيدة لمزيد من تطوير علاجات جديدة للحد من GBS الاستعمار المهبل الأمهات والتعرض لاحق من الأطفال حديثي الولادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

عدوى، العدد 117، المجموعة الثانية
نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter