Summary
Het doel van dit protocol is voor de menselijke groep B Streptococcus (GBS) vaginale kolonisatie na te bootsen in een muismodel. Deze werkwijze kan worden gebruikt om immuunreacties van de gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale persistentie te onderzoeken, alsmede therapeutische strategieën testen.
Abstract
Streptococcus agalactiae (groep B streptococcus, GBS) is een Gram-positieve, asymptomatische kolonisator van het menselijke maagdarmkanaal en vaginale kanaal van 10 - 30% van de volwassenen. In immuun-gecompromitteerde individuen, met inbegrip van pasgeborenen, zwangere vrouwen en ouderen, kan GBS overschakelen naar een invasieve ziekteverwekker die aan sepsis, artritis, longontsteking en hersenvliesontsteking. Omdat GBS is een toonaangevende bacterieel pathogeen van pasgeborenen, is de huidige profylaxe bestaat uit de late zwangerschap screening voor GBS vaginale kolonisatie en de daaropvolgende peripartum antibiotische behandeling van GBS-positieve moeders. Zware GBS vaginale last is een risicofactor voor zowel de neonatale ziekte en kolonisatie. Helaas is er weinig bekend over de gastheer en bacteriële factoren die bevorderen of toestaan GBS vaginale kolonisatie. Dit protocol beschrijft een techniek voor zij hardnekkige GBS vaginale kolonisatie met één β-estradiol voorbehandeling en dagelijks bemonstering bacteriële loa bepalend. Het verdere details methoden om aanvullende therapieën of reagentia van belang te beheren en vaginale lavage vloeistof en voortplantingsorganen weefsels te verzamelen. Deze muis model zal het begrip van de GBS-gastheer interactie binnen de vaginale omgeving, die zal leiden tot een potentiële therapeutische doelen aan maternale vaginale kolonisatie controle tijdens de zwangerschap en de overdracht aan de kwetsbare pasgeboren voorkomen bevorderen. Het zal ook van belang zijn voor ons begrip van de algemene bacterie-gastheer interacties in de vrouwelijke vaginale-darmkanaal te verhogen.
Introduction
Streptococcus agalactiae, groep B Streptococcus (GBS), een ingekapselde, Gram-positieve bacterie die vaak wordt geïsoleerd uit de darm en urogenitale tractus van gezonde volwassenen. In de jaren 1970, GBS naar voren als de belangrijkste agent van besmettelijke neonatale sterfte, met meer dan 7.000 gevallen van neonatale ziekte jaarlijks 1. Early-onset GBS-infectie (EOD) komt in de eerste uren of dagen van het leven, ontstaat als longontsteking of ademhalingsproblemen, en vaak ontwikkelt tot sepsis, terwijl de late vorm van de ziekte (LOD) ontstaat na enkele maanden en presenteert met bacteriëmie, die vaak voorschotten aan meningitis 2. Met ingang van 2002, de Centers for Disease Control and Prevention beveelt universele screening voor GBS vaginale kolonisatie in de late zwangerschap en de bevalling antibioticaprofylaxe (IAP) naar GBS-positieve moeders 1. Ondanks het terugdringen van de vorm van de ziekte tot ongeveer 1000 gevallen in de Verenigde Staten jaarlijks door IAP,GBS blijft de belangrijkste oorzaak van vroege-onset neonatale sepsis, en late-onset optreden blijft onaangetast 1. Of het nu in de baarmoeder, tijdens de bevalling, of zelfs in late-onset gevallen, neonatale blootstelling aan GBS moet overleven, transversale via een aantal host-omgevingen en barrières, het immuunsysteem fraude, en, in het geval van meningitis, kruising van de sterk gereguleerde bloed- hersenbarrière 2. Stroomopwaarts van deze virulente interacties binnen de pasgeborene is de eerste kolonisatie van de maternale vaginale kanaal. Maternale GBS vaginale kolonisatie tarieven variëren 8-18% in de ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden, met een geschatte gemiddelde van 12,7% 3,4. GBS kolonisatie van de vaginale-darmkanaal tijdens de zwangerschap kan constant, intermitterend of voorbijgaande aard onder individuele vrouwen 5 zijn. Interessant is dat een leeftijd van de moeder> 36 jaar in verband met aanhoudende kolonisatie 6. Tal van biologische en sociaal-economische risicofactoren voor GBS vaginale kolonisatiegeïdentificeerd. Biologische factoren omvatten gastrointestinale GBS kolonisatie en afwezigheid van Lactobacillus in de darm. Echter, etniciteit, obesitas, hygiëne en seksuele activiteit ook in verband gebracht met GBS vaginale wagen 7.
Hoewel bekend voor het veroorzaken neonatale infecties GBS veroorzaakt ook verschillende maternale infecties zowel peripartum en postpartum. GBS slede is verhoogd bij vrouwen presenteren met vaginitis 8 en in sommige gevallen zelfs het ziektebeeld 9 zijn. Bovendien kan GBS hemelvaart van de voortplantingsorganen tijdens de zwangerschap leiden tot een intra-amniotische infectie of chorioamnionitis 10. Bovendien, tot 3,5% van de zwangerschappen, GBS verspreidt de urineblaas een urineweginfectie of asymptomatische bacteriurie 11 veroorzaken. GBS bacteriurie tijdens de zwangerschap is geassocieerd met een verhoogd risico op de bevalling koorts, chorioamnionitis, vroeggeboorte en premature breken van de vliezen 12. Samengevat, is de aanwezigheid van GBS in de vaginale kanaal houden met ontstekingen meerdere gastheerweefsels, en de mogelijkheid om GBS elimineren van deze niche is noodzakelijk voor zowel maternale en neonatale gezondheid.
Tot voor kort, de meeste werkzaamheden onderzoeken GBS interacties met de cervicovaginal tract werd alleen in vitro celmodellen 13-15. Deze in vitro experimenten bacteriële factoren die belangrijk zijn voor hechting zijn, waaronder oppervlakte-eiwitten bleek zo'n pili en serine-rijke repeats 17,18, evenals twee componenten regelsystemen 15,19 en de globale transcriptionele respons van het vaginale epitheel GBS 19. Echter, de gastheer-microbe interacties volledig helderen binnen het vaginale kanaal, een robuuste diermodel noodzakelijk. Vroeg werk aangetoond dat GBS uit de vaginale landstreek van geënte muizen 20,21 en ratten kunnen worden hersteld <sup> 22 in zowel de zwangere en niet-zwangere omstandigheden. In 2005 werd op korte termijn GBS vaginale kolonisatie gemodelleerd bij muizen om de werkzaamheid van een faag lytisch enzym te onderzoeken tot vaginale GBS behandelen gedurende een periode van 24 uur 23. Enkele jaren later, werd een lange-termijn GBS vaginale kolonisatie muismodel ontwikkeld om gastheer en bacteriële factoren die GBS doorzettingsvermogen te bestuderen. Dit model heeft talrijke GBS factoren die kolonisatie, waaronder oppervlak appendages 17,18 en GBS tweecomponentensystemen 19,24 geïdentificeerd. Dit model heeft bijgedragen tot de identificatie van gastheer respons mechanismen 19,25 en werd gebruikt om verschillende therapeutische strategieën, met inbegrip van immunomodulerende peptiden 26 en probiotica 27 te testen. Dit protocol geeft de nodige begeleiding om GBS te enten in de muis vaginale-darmkanaal en vervolgens kolonisatie te volgen en het verzamelen van monsters voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door het Bureau van Lab Animal Care in San Diego State University en uitgevoerd onder aanvaarde veterinaire normen. Vrouwelijke muizen, leeftijd 8-16 weken werden gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode.
1. Voorbereiding en intraperitoneale injectie van β-estradiol
- Meet β-estradiol (0,5 mg / muis) op weeg papier, terwijl het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). LET OP: β-oestradiol kan worden geabsorbeerd door de huid en slijmvliezen.
- Transfer β-estradiol een 15-ml conische buis en vortex totdat alle klonten worden verwijderd en de β-estradiol is een fijn poeder. Het opstellen van sesamolie (100 pl / muis) in een 10-ml spuit. Spuit-filter sesamolie in de 15 ml conische buis met het β-estradiol met een 0,45 urn filter. Vortex de 15-ml conische buis dienovereenkomstig β-estradiol is een homogene suspensie in de sesamolie.
- Het opstellen van de β-estradiol suspensie in een nieuwe 10-ml spuit. Met een 18 G, 1-in. naald, monster 100 ul van de suspensie in de 1-ml tuberculine injectiespuiten. Bereid een spuit voor elke muis. Plaats een nieuwe, steriele 26 G, ½-in. naald op elk tuberculine spuit.
- Dien 0,5 mg van het β-estradiol gesuspendeerd in 100 ui sesamolie (5 mg / ml) aan elke muis 24 uur vóór bacteriële inoculatie. Injecteer elke muis in de buikholte, in de onderbuik kwadranten, net rechts of links van de middellijn, zoals eerder beschreven 28.
OPMERKING: Geen schoonmaak of knippen van de plaats van injectie nodig is.
2. Vaginale Inenting met GBS
- Eén dag voor enting, groeien een 5-ml overnacht vloeibare cultuur van een GBS-stam van belang, zoals de A909 (serotype Ia), in Todd Hewitt bouillon (THB) bij 37 ° C.
- Subcultuur de GBS overnacht cultuur op een 01:10 volume in de frisse mensenhandel en incubeer bij 37 ° C. groeien debacterie tot mid-log-fase (OD 600 = 0,4-0,5). LET OP: Dit zal meestal duren 2-3 uur, afhankelijk van de stam van de GBS.
- Breng de subcultuur een steriele 15 ml conische buis en pellet bacteriën bij 3000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de bacteriële pellet in 200 ui steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Met de geresuspendeerde pellet, breng 3-5 ml PBS (1 ml per 10 muizen) precies OD 600 = 0,4 in een nieuwe cultuurbuis 5 ml. Dit zal een concentratie van 1 x 10 ~ 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml. Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis en opnieuw pellet de bacteriën bij 3000 x g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in PBS bij 1/10 van het oorspronkelijke volume. Wanneer bijvoorbeeld 3 ml OD 600 = 0,4 werd gepelleteerd, opnieuw in suspensie vervolgens in 300 gl PBS. Opmerking: Dit is de laatste bacteriesuspensie (~ 1 × 10 9 CFU / ml) gebruikt voor dierlijke inoculatie.
- Reserve 50 ul van deze suspensie voor seriële verdunning en uitplaten op mensenhandel agar om de exacte entstof te bepalen.
- Inoculeren elke muis met 10 ul van de uiteindelijke bacteriesuspensie zodat 1 x 10 7 CFU wordt toegediend aan elke muis.
- Om te enten, handmatig beperken de muis door het veiligstellen van de losse huid aan het nekvel tussen duim van de handler en wijsvinger en vervolgens het immobiliseren van de staart, zoals eerder 28 beschreven.
- Opstellen 10 ul van de GBS bereid in stap 2.6 in een 200-ul gel laden pipetpunt. Breng de punt 5 tot 10 mm in het vaginale lumen en verdeel de 10 pl inoculum.
OPMERKING: Gel plaatsen Tips voorkeur boven standaard 200-ul tips om het risico van trauma of letsel orgaan minimaliseren, vooral bij jonge muizen of kleiner. - Onmiddellijk na inenting, laat de nekvel en verheffen het achterste einde van de muis, het opheffen van de muis bij de staart en walking de voorpoten op een harde ondergrond voor ~ 1 min.
- Inspecteer de vaginale opening voor eventuele terugstroom van entstof. Als terugstroom wordt waargenomen, kan een frisse pipettip worden gebruikt om te manipuleren of te vergroten de vaginale opening, het vergemakkelijken van de opname van het terugstromen in het lumen. Bovendien kan terugstroming worden afgezogen via een pipet en opnieuw geïnoculeerd.
LET OP: Als het toedienen van lokale agenten, probiotische organismen, of eiwitten van belang, een volume tot 20 pi in een fysiologische buffer kan worden gegeven in de vaginale-darmkanaal.
3. het schoonvegen van de Vaginale Lumen om GBS Load kwantificeren
- Bereid een 1,5-ml micro-centrifugebuis per muis door toevoeging van 100 pi PBS. Net voor zwabberen, pre-nat het staafje in PBS.
- Beperken de muis zoals beschreven in stap 2.7.1 en plaats het staafje 10 mm in de vaginale lumen. Voorzichtig draai de swab 4 keer met de klok mee en 4 keer tegen de klok in, onder lichte druk om de vaginawand.
- Breng het wattenstaafje om de 1,5-ml microcentrifuge buis met 100 ui PBS. Vóór plating, vortex de microcentrifugebuis van ~ 15 seconden om de bacteriën los te maken van het staafje. Serieel verdund elk monster in PBS en de plaat 20 pl verdunningen 1:10 tot 1: 10.000 voor de differentiële medium agarplaten bereid volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur. GBS kolonies zal ofwel fel roze of paars van kleur verschijnen. Andere endogene flora wordt geremd, of zal verschijnen als blauw, wit of grijs kolonies.
4. Het verzamelen van vaginale wasvloeistof
- Restrain de muis zoals beschreven in stap 2.7.1. Met behulp van een 200-gl gel-lading pipetpunt Pipetteer 20 ul PBS in de vaginale lumen. Voorzichtig pipet het volledige volume omhoog en omlaag 4 keer in het lumen, en vervolgens het gehele volume in dezelfde pipet tip in te trekken. OPMERKING: Als de spoelvloeistof is dik met slijm, een standaard 200 ul pipetpuntkan worden gebruikt om de uiteindelijke spoelvloeistof verzamelen.
- Als het opslaan van lavage vloeistof voor cytokine analyse of CFU kwantificering, afzien in een 0,7 ml microcentrifugebuis. Indien het bepalen van het stadium van estrus afzien tenminste 5 ul lavage vloeistof op een glasplaatje en observeer de cellen onder 100x vergroting op een lichtmicroscoop. LET OP: Voor voorbeelden van estrous etappes, zie figuur 1.
5. Tissue Dissection en homogenisering
- Voor elke muis bereiden drie 2-ml schroefdopbuisjes (één voor elk weefsel: vagina, baarmoederhals en baarmoeder). Vul elke buis met voldoende (0,4-0,5 g) 1,0 mm zirkoniumoxide kralen om de kegelvormige bodem van de buis te dekken.
- Autoclaaf de bereide buisjes voorafgaand aan het verzamelen van weefsel voor 30 min bij 121 ° C, vooral als kwantificeren bacteriële verontreiniging. Voeg 500 pl steriel PBS aan elke buis. Weeg elke buis na een autoclaaf en record voor toekomstig gebruik te vorderen weefsel gewicht te berekenen.
- Steriliseer de schaar met 70% EtOH, schoon te vegen indien nodig, en snijd beide baarmoederhoorns mid-lengte tussen de baarmoeder lichaam en eierstokken. Met een schaar en een tang, aparte visceraal vet, membranen, en de urineblaas weg van de voortplantingsorganen, bewegende caudaal.
- Steriliseren schaar zoals beschreven in stap 5.4. Dwars doorgesneden de vagina zo dicht mogelijk bij de vulva mogelijk het voortplantingskanaal te scheiden van het lichaam. Til en verwijder de intacte voortplantingsorganen en plaats deze in een steriele petrischaal.
- Met een nieuw scheermesje, scheiden de baarmoeder van de cervix in een dwarse snede. Steriliseer de scheermesje met 70%EtOH en vervolgens scheiden van de baarmoederhals van de vagina in een dwarse snede. NB: Er zal een minimale hoeveelheid van de baarmoeder weefsel nog aan de baarmoederhals worden. Er is een minimale hoeveelheid vaginaal weefsel nog aan de cervix is.
- Met steriele tang, overdracht elk van de weefsels in hun respectievelijke 2-ml buisjes met PBS en homogeniseren kralen. Reinig de tang met 70% EtOH in tussen de behandeling van elk weefsel.
- Weeg elk 2 ml schroefdop tube en aftrekken van het oorspronkelijke gewicht van de buis aan het weefsel gewicht te bepalen. Tissue gewichten meestal variëren tussen 20-100 mg. Goed af de schroefdopbuisjes en homogeniseer de weefsels gedurende 1 minuut bij maximale snelheid in een weefsel homogenisator.
- Om bacteriële verontreiniging te kwantificeren, serieel verdunnen 25 pi van weefsel homogenaat en plaat verdunningen 01:10 door middel van 1: 10.000 op differentiële medium agarplaten. Incubeer de platen zoals beschreven in stap 3.3. Monsters voor cytokine kwantificering opslaan, bevriezen weefsel homogenaten bij -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij de ontwikkeling van dit model zijn verschillende opmerkingen over factoren die de duur van GBS vaginale kolonisatie beïnvloeden. Om te bepalen hoe estrous stadium bij enting gevolgen GBS bacteriële persistentie werden muizen gehouden op de dag van de inenting via vaginale lavage vloeistof. Figuur 1 illustreert de vier fasen van de muis loopsheid, zoals bepaald door middel van nat-mount vaginale lavage vloeistof, een bekende methode 29. Muizen werden verdeeld in groepen op basis van deze eerste fase, en GBS persistentie werd in de tijd gevolgd via vaginale zwabberen. Muizen geïnoculeerd in de pro-oestrus fase gekoloniseerd met GBS langer dan enig ander stadium van oestrus, met name in diestrus op het moment van inoculatie (figuur 2). Op basis van deze resultaten, in het huidige model, muizen worden behandeld met β-oestradiol één dag voor GBS inoculatie synchroniseren in de proestrus fase. Andere muismodellen van voortplantingsorganen infecties zijn een verhoogd vermogen van de pathogene organismen te volharden wanneer muizen worden volgehouden in de estrus stadium door middel van exogeen estradiol behandeling 30,31 aangetoond. Om te bepalen of dit verschijnsel zich ook voorgedaan tijdens vaginale kolonisatie met GBS, was GBS persistentie gevolgd tijdens herhaalde β-estradiol behandeling. Aanhoudende estrus bevorderd GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC BAA-# 1138) persistentie in CD-1 muizen met 90% kolonisatie 2 weken na inoculatie (Figuur 3A). In een typisch experiment met één dosis β-oestradiol vóór inoculatie slechts 40-50% van de muizen werden gekoloniseerd één week na inoculatie (figuur 4). De gemiddelde CFU GBS teruggewonnen uit deze muizen bootst het percentage kolonisatie (figuur 3B). Hoewel deze resultaten werden verkregen uit onafhankelijke experimenten, deze gegevens demonenons daarom dat het handhaven continue estrus bevordert GBS vaginale persistentie in de meeste CD-1 muizen.
Terwijl het uitvoeren kolonisatie experimenten met verschillende menselijke GBS isolaten werd waargenomen dat stammen variëren in hun vermogen vast van CD-1 muizen, variërend van enkele dagen tot voorbij een maand. Van de geteste stammen, NCTC 10/84 had de kortst, A909 en COH1 bleef gedurende 1-2 weken, terwijl stam CJB111 in de meeste muizen bleef gedurende twee weken (figuur 4) en zelfs voorbij een maand (data niet getoond) . Tot op heden is er geen verband waargenomen tussen serotype en het vermogen om te volharden in de muis vaginale-darmkanaal geweest; echter aanzienlijke verschillen tussen afzonderlijke GBS stammen gerapporteerd 25. Het vermogen van GBS meerdere inteelt en outbred muislijnen koloniseren werd eveneens onderzocht. GBS-stam A909 volhardde in de vaginale-darmkanaal voor ongeveer een week in outbred CD-1inteelt muizen en FVB-muizen (figuur 5). Als alternatief, de meeste ingeteelde BALB / c en C57BL / 6 werden gekoloniseerd in een week (Figuur 5) en bleef gekoloniseerde een maand of voorbij (gegevens niet getoond).
Met dit protocol, GBS vaginale kolonisatie in vivo werd zichtbaar gemaakt door het enten muizen met een plasmide dat GFP tot expressie GBS-stam en het verzamelen van weefsel voor fluorescentiemicroscopie. GFP-GBS werd gedetecteerd zowel vast te houden aan het vaginaal epitheel (figuur 6A) en in de nabijheid van andere inheemse vaginale flora (figuur 6B) muizen. Geen GFP-signaal werd gedetecteerd in muizen die GFP-GBS op het moment van weefselverzameling succes werd behandeld (gegevens niet getoond).
Figuur 1: Het identificeren van de derde fase van Estrus van Ongekleurde Muizen vaginale lavage vloeistof. (A) Proestrus: overvloedige kernen geschubde epitheelcellen (zwarte pijlen). (B) Estrus: overvloedige verhoornde plaveiselepitheel cellen (blauwe pijlen). (C) Metestrus: mengsel van kernen en verhoornde plaveiselepitheel cellen en overwegend leukocyten (grijze pijlen). (D) Diestrus: overvloedige leukocyten. Vergroting = 100X, schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: estrous Stage Impacts Vaginale Persistence van GBS. Procent van de CD-1 muizen gekoloniseerd met 1 x 10 7 CFU GBS A909 in de tijd. De muizen werden ingedeeld (n = 7-11 / groep) op basis van oestrus stadium ten tijde van GBS inoculatie, zoals bepaald door vaginale lavage vloeistof. Een onafhankelijke experiment wordt getoond. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde werk en met toestemming overgenomen 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: voortgezette behandeling met β-estradiol Bevordert GBS Vaginale Persistence. Procent gekoloniseerd (A) of teruggewonnen CFU (B) CD-1-muizen (n = 10) geïnoculeerd met 1 x 10 7 CFU GBS A909 en onderhouden op β-estradiol behandeling. Muizen werden geïnjecteerd met β-oestradiol één dag voor GBS inoculatie en op dagen 1, 3 en 5 na inoculatie. Een onafhankelijke experiment wordt getoond. De lijn in (B) vertegenwoordigt gemiddelde herstelde CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: GBS stammen verschillen in hun vermogen om te volharden in de Vaginale Tract. Gekruiste CD-1-muizen (n = 10 / groep) werden geïnjecteerd met een enkele dosis van β-estradiol één dag voor GBS inoculatie met 1 x 10 7 CFU van de gegeven GBS stammen. Experimenten met elk stam werden afzonderlijk uitgevoerd en werden ten minste driemaal herhaald; een representatief resultaat is weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde werk en met toestemming overgenomen 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Pbelasting / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
Figuur 5: muizenstammen verschillen in hun vermogen om te worden gekoloniseerd met GBS in de vaginale Tract. Muizen uit achtergrond aangegeven stammen werden geïnjecteerd met een enkele dosis van β-estradiol één dag vóór inoculatie met 1 x 10 7 CFU GBS A909. Experimenten met elke stam werden onafhankelijk uitgevoerd en werden ten minste tweemaal herhaald; een representatief resultaat is weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fluorescent Imaging van GBS binnen de Muis Vaginale Tract. Visualisatie van GFP uiten van GBS (groen) langs de vaginale epitheel bij vergroting = 630X, schaal bar = 50 micrometer (A), en in de nabijheid van endogenous vaginale microben op vergroting = 1000x, schaal bar = 20 pm (B). Blauwe vlek = DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Compilatie van GBS stammen en Muis Lines gebruikt voor vaginale Colonization Studies. GBS achtergrond stammen, muizenlijnen en dosering van β-oestradiol aangegeven. Studies met behulp van de in dit werk beschreven model zijn grijs gemarkeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de voortgang van het begrijpen van GBS interactie met zowel de gastheer en andere microben in het kader van de gastheer te bevorderen, wordt een diermodel vereist. Dit werk beschrijft de technische aspecten van de oprichting van GBS vaginale kolonisatie in muizen. Dit protocol realiseert> 90% kolonisatie van muizen zonder het gebruik van anesthetica bacteriën enten of swabmonsters, immuun-onderdrukkende verzamelen om kolonisatie mogelijk, vaginale voorwassen of additieven voor het inoculum verdikken. Bovendien is dit model toont robuuste reproduceerbaarheid, met een bescheiden inter-experimentele variabiliteit in zowel de lengte van de GBS doorzettingsvermogen en de bacteriële last. De representatieve resultaten aangetoond in deze studie zijn het opstellen van onafhankelijke experimenten en moet een referentie voor toekomstige experimentele design; moet echter directe vergelijkingen tussen GBS stammen en de muis lijnen worden gemaakt met zorg.
Dit model bootst de menselijke colonizatiOp dat vaginale mucosale kolonisatie GBS muizen lijkt te zijn beperkt tot de voortplantingsorganen. Hoewel ascensie naar de cervix en uterus waargenomen met meerdere GBS stammen 25, hoeft muizen geen tekenen van morbiditeit en mortaliteit in, zelfs na maanden van kolonisatie. Bovendien lopen de GBS en muizenstammen bestudeerde muizen tonen consistent of transiënte vaginale kolonisatie, wat nuttig is voor het bestuderen van bacteriële factoren en gastheer immuunreacties, respectievelijk. In dit model, sommige muizen tonen intermitterende kolonisatie; Het is op dit moment niet bekend of muizen te worden gekoloniseerd op latere tijdstippen of als kolonisatie beneden de detectielimiet, meestal 50 tot 100 CFU, op bepaalde tijdstippen. Opmerkelijk is transmissie tussen muizen niet waargenomen wanneer gekoloniseerd en niet-gekoloniseerde muizen gehuisvest samen over enkele weken (gegevens niet getoond).
Deze methode maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar selectief en differentieel mediumvoor GBS de muis bacteriële lasten te kwantificeren. GBS groeit zo helder roze of paars kolonies die gemakkelijk zichtbaar na 24 uur incubatie. Dit medium is aangetoond dat hogere sensitiviteit voor GBS vergelijking met andere media, zoals agar en Granadamedium 32 hebben, en is gebruikt in combinatie met latex bolletje agglutinatietests bevestigen GBS klinische isolaten 18. In deze studie, licht roze of paars kolonies uit niet-GBS gekoloniseerde muizen zijn nooit teruggevonden. Sommige endogene flora, typisch Enterococcus species, zal groeien als de blauwe kolonies, en sommige kolonies zullen wit, grijs, of zeer lichtroze verschijnen. Belangrijk is, moet platen worden geteld na 18 tot 24 uur incubatie, als niet-GBS kolonies de roze pigment kan nemen als links in de couveuse of op de benchtop voor langere periodes. Wij hebben waargenomen, zoals eerder beschreven 32 dat enige S. pyogenes isolaten roze kolonies op CHROMagar StrepB zullen vormen, maar deze colonies zijn meestal kleiner dan GBS kolonies. S. pyogenes is niet geïsoleerd van de endogene vaginale flora van muizen in deze studies, maar deze waarneming moet in de toekomst het werk worden beschouwd.
De meeste resultaten werden verkregen uit de gekruiste CD-1 muizen lijn, waar betrouwbare aangeboren immuunrespons blijkt in de eerste dagen na inoculatie, gevolgd bacteriële verwijdering in de meeste muizen 19. Anderen hebben ook getest extra GBS stammen en langere persistentie keer 33,34 hebben waargenomen. Sinds de ontwikkeling van dit model hebben andere groepen begonnen soortgelijke muismodellen van GBS vaginale kolonisatie ontwikkelen om het effect van gastheer immuunreacties 33,35 preventieve therapieën 36,37 en transmissie naar de foetus in utero 34,38 onderzocht. Deze verschillen kunnen worden verklaard door verschillende factoren, waaronder genetische determinanten die immuunresponsen en t beïnvloedenhij samenstelling van inheemse vaginale flora. We hebben een lijst van de GBS stammen en de respectieve muis lijnen die zijn onderzocht tot op heden in GBS vaginale kolonisatie studies (tabel 1) samengesteld. Het aantal recente studies met diermodellen blijkt het belang en de noodzaak van deze typen modellen binnen het gebied van GBS pathogenese onderzoek.
Binnen de vaginale kanaal wordt mucosale immuniteit strak gereguleerd door steroïde hormonen 44, en zelfs een dosis β-oestradiol, zoals in dit model, verstoort de immuunrespons van de gastheer. Toch zijn er sterke aangeboren immuunrespons in de eerste paar dagen van GBS kolonisatie 19,25, wat suggereert dat betrokken immuunreacties grotendeels intact. Modellen die gepaard herhaalde β-estradiol injecties verlengt GBS vaginale persistentie, zoals aangetoond in deze studie (figuur 3) en 33 anderen. Echter, het immuunsysteem en de voortplantingsorganen physiology mogelijk meer beschaamd worden, waardoor de resultaten moeilijk te interpreteren. Belangrijk is dat de beschreven in de verschillende GBS verschillen isoleert en muis stammen in dit onderzoek kan in de loop modellen van aanhoudende oestrus worden gewijzigd en moeten worden onderzocht in de toekomstige werkzaamheden. Van de nota, noch estrus stadium noch GBS serotype beïnvloed vaginale kolonisatie in een rat-model 22. Bovendien, de humane zure vaginale pH van 3,6-4,5 45 verschilt aanzienlijk van de meer neutrale murine vaginale pH 6,5 46, die van invloed GBS genexpressie gevolgd factoren die kolonisatie. Ten slotte, inheemse vaginale flora is verschillend tussen mensen en muizen model tegenhangers, en de toekomstige werkzaamheden moeten GBS kolonisatie in gnotobiotische muizen die de menselijke vaginale flora te onderzoeken.
Samengevat hebben deze studies getracht gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale kolonisatie regelen onderzoeken. In de eerste plaats, de robuuste innovatieve diermodel van GBS vaginale colonization die in dit werk worden gebruikt om complexe gastheer-microbe interacties in een in vivo vaginale omgeving beschrijven. De resultaten van dit model informatie al sterk gegroeid in de kennis van gastheer immune componenten en specifieke genen die GBS GBS vaginale doorzettingsvermogen te controleren. Bovendien hebben deze resultaten aanvullende vragen gesteld en nuttig zal zijn voor de verdere ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de maternale GBS vaginale kolonisatie en de daaropvolgende blootstelling van de pasgeborene te beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sesame oil | Sigma Aldrich | S3547-250ML | |
| β-Estradiol | Sigma Aldrich | E8875-1G | CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. |
| 200 μl gel loading pipette tips | USA Scientific | 1252-0610 | |
| Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs | Puritan | 25-801 A 50 | |
| CHROMagar StrepB | DRG International | SB282 | |
| Todd Hewitt Broth | Hardy Diagnostics | 7161C | |
| 18 G, 1.5 inch needles | BD | 305199 | |
| 26 G, 0.5 inch needles | BD | 305111 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 1 ml syringes | BD | 309659 | |
| 0.45 μm PVDF syringe filters | Whatman | 6900-2504 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | 21-031-CV |
References
- Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
- Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
- Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
- Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
- Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
- Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
- Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
- Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
- Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
- Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
- Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
- Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
- Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
- Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
- Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
- Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
- Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
- Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
- Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
- Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
- Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
- Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
- Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
- Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
- Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
- Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
- Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
- Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
- Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
- Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
- Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
- Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
- Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
- Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
- Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
- Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
- Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
- Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
- Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
- Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).
