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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un modèle murin du Groupe B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Le but de ce protocole est d'imiter groupe humain B Streptococcus (GBS) colonisation vaginale dans un modèle murin. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les réponses immunitaires de l'hôte et des facteurs bactériens qui contribuent à la persistance GBS vaginale, ainsi que pour tester des stratégies thérapeutiques.

Abstract

Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B, GBS), est une colonisatrice asymptomatique Gram-positif du tractus gastro - intestinal humain et tractus vaginal de 10 - 30% des adultes. Chez les individus immunodéprimés, y compris les nouveau-nés, les femmes enceintes et les personnes âgées, GBS peut passer à un pathogène invasif causant la septicémie, l'arthrite, la pneumonie et la méningite. Parce que GBS est un pathogène bactérien leader des nouveau-nés, la prophylaxie actuelle est composée de dépistage de fin de gestation pour GBS colonisation vaginale et un traitement antibiotique peripartum subséquente des mères GBS-positives. Lourd fardeau GBS vaginal est un facteur de risque pour les maladies néonatales et de la colonisation. Malheureusement, on sait peu sur l'hôte et facteurs bactériens qui favorisent ou permettent GBS colonisation vaginale. Ce protocole décrit une technique pour établir persistante GBS colonisation vaginale à l'aide d'un seul prétraitement de β-oestradiol et l'échantillonnage par jour pour déterminer loa bactérienneré. Il détaille en outre des méthodes pour administrer des thérapies ou des réactifs d'intérêt supplémentaires et pour recueillir les sécrétions vaginales de lavage et les tissus de l'appareil reproducteur. Ce modèle de souris favorisera la compréhension de l'interaction GBS-hôte dans le milieu vaginal, ce qui conduira à des cibles thérapeutiques potentielles pour contrôler la colonisation vaginale de la mère pendant la grossesse et pour prévenir la transmission au nouveau-né vulnérable. Il sera également intéressant d'augmenter notre compréhension des interactions générales bactérienne-hôte dans le tractus vaginal féminin.

Introduction

Streptococcus agalactiae, Streptococcus du groupe B (GBS), est une encapsulé, d'une bactérie à Gram-positif qui est fréquemment isolé à partir de l'intestin et du tractus génito - urinaire chez des adultes sains. Dans les années 1970, l' ABG a émergé comme le principal agent de la mortalité infectieuse néonatale, avec plus de 7.000 cas de maladie néonatale par an 1. L'apparition précoce de la maladie GBS (NEM) se produit dans les premières heures ou les jours de la vie, se pose comme une pneumonie ou une détresse respiratoire, et souvent se développe en septicémie, alors que la maladie d'apparition tardive (LOD) s'ensuit après plusieurs mois et présente une bactériémie, qui souvent avances à la méningite 2. En 2002, les Centers for Disease Control and Prevention recommande le dépistage universel de GBS colonisation vaginale à la fin de la gestation et la prophylaxie antibiotique intrapartum (IAP) aux mères GBS-positives 1. Malgré la réduction des maladies d'apparition précoce d'environ 1000 cas aux États-Unis chaque année en raison de l'IAP,GBS reste la principale cause de septicémie néonatale apparition précoce, et l' apparition d'apparition tardive reste inchangée 1. Que ce soit in utero, pendant le travail, ou même dans les cas d'apparition tardive, l'exposition néonatale à l'ABG exige la survie, transversale à travers un certain nombre d'environnements et les obstacles hôtes, l'évasion immunitaire et, dans le cas de la méningite, traversée de la encéphalique très réglementé encéphalique 2. En amont de ces interactions virulentes au sein du nouveau-né est la colonisation initiale de la voie vaginale maternelle. Maternelle GBS taux de colonisation vaginale vont 8-18% dans les pays développés et en développement, avec un taux moyen estimé de 12,7% 3,4. GBS colonisation du tractus vaginal pendant la grossesse peut être constante, intermittente, ou de nature transitoire chez les femmes individuelles 5. Fait intéressant, la mère âge> 36 ans est associée à la colonisation persistante 6. De nombreux facteurs de risque biologiques et socio-économiques de GBS colonisation vaginalea été identifié. Les facteurs biologiques incluent gastro colonisation GBS et l' absence de Lactobacillus dans l'intestin. Cependant, l' origine ethnique, l' obésité, l' hygiène et l' activité sexuelle ont également été associés au SGB portage vaginal 7.

Bien connu pour causer des infections néonatales, GBS provoque également une variété d'infections maternelles les deux peripartum et post-partum. SGB est augmentée chez les femmes présentant une vaginite 8 et, dans certains cas, ils peuvent même être à l'entité pathologique 9. En outre, l' ABG ascension de l'appareil reproducteur pendant la grossesse peut entraîner une infection intra-amniotique ou chorioamnionitis 10. En outre, dans un maximum de 3,5% des grossesses, GBS dissémine à la vessie pour provoquer une infection des voies urinaires ou bactériurie asymptomatique 11. bactériurie à GBS pendant la grossesse est associée à un risque accru de fièvre intrapartum, chorioamniotite, accouchement prématuré, et premature rupture des membranes 12. Pris ensemble, la présence de GBS dans le tractus vaginal est liée à des infections des tissus hôtes multiples, et la capacité d'éliminer l'ABG de ce créneau est impératif pour la santé maternelle et néonatale.

Jusqu'à récemment, la majorité des travaux d' examen des interactions GBS avec le tractus cervicovaginal a été limitée à des modèles cellulaires in vitro 13-15. Ces expériences in vitro ont mis en évidence les facteurs bactériens qui sont importants pour l' adhérence, comprenant des protéines de surface comme une serine pili et riche en répétitions 17,18, ainsi que des systèmes de régulation à deux composants 15,19 et de la réponse transcriptionnelle globale de l'épithélium vaginal GBS 19. Toutefois, afin d'élucider totalement les interactions hôte-microbe dans le tractus vaginal d'un modèle animal robuste est nécessaire. Les premiers travaux ont démontré que l' ABG peut être récupéré à partir du tractus vaginal de souris inoculées 20,21 et rats <sup> 22 dans les deux conditions enceintes et non enceintes. En 2005, à court terme GBS colonisation vaginale a été modélisée chez la souris pour examiner l'efficacité d'une enzyme phage lytique pour traiter GBS vaginal sur une période de 24 h 23. Quelques années plus tard, un long-terme GBS modèle de souris de la colonisation vaginale a été développé pour étudier l'hôte et bactériennes facteurs régissant l'ABG persistance. Ce modèle a identifié de nombreux facteurs GBS contribuant à la colonisation, y compris les appendices de surface 17,18 et GBS systèmes à deux composants 19,24. Ce modèle a contribué à l'identification des mécanismes de réponse d'accueil 19,25 et a été utilisé pour tester plusieurs stratégies thérapeutiques, y compris les peptides immunomodulateurs 26 et probiotiques 27. Ce protocole donne les indications nécessaires pour inoculer GBS dans le tractus vaginal de la souris et de suivre ensuite la colonisation et de prélever des échantillons pour des analyses ultérieures.

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Protocol

Tous les travaux des animaux a été approuvé par le Bureau du Lab Animal Care à l'Université d'État de San Diego et mené en vertu des normes vétérinaires acceptées. Des souris femelles, âge 8 - 16 semaines, ont été utilisés pour le développement de cette méthode.

1. Préparation et injection intrapéritonéale de β-estradiol

  1. Mesurer β-estradiol (0,5 mg / souris) sur papier peser tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI). ATTENTION: β-estradiol peut être absorbé par la peau et les surfaces muqueuses.
  2. Transfert β-estradiol à un tube conique de 15 ml et le vortex jusqu'à ce que tous les morceaux sont enlevés et le β-estradiol est une poudre fine. Dresser l'huile de sésame (100 ul / souris) dans une seringue de 10 ml. Seringue filtre l'huile de sésame dans le tube conique de 15 ml contenant la β-estradiol en utilisant un filtre de 0,45 um. Vortexer le tube conique de 15 ml jusqu'à ce que le β-oestradiol est une suspension homogène dans l'huile de sésame.
  3. Dressez les ß-estradiol suspension dans un nouveau 10 ml seringue. Avec un 18 G, 1-in. l'aiguille, partie aliquote de 100 ul de la suspension dans des seringues de tuberculine de 1 ml. Préparer une seringue pour chaque souris. Placez une nouvelle, stérile 26 G, ½ po. aiguille sur chaque seringue tuberculine.
  4. Administrer 0,5 mg de β-oestradiol mis en suspension dans 100 pi d'huile de sésame (5 mg / ml) à chaque souris 24 heures avant l'inoculation bactérienne. Injecter chaque souris dans la cavité péritonéale, dans les quadrants abdominaux inférieurs, juste à droite ou à gauche de la ligne médiane, comme décrit précédemment 28.
    NOTE: Pas de nettoyage ou d'écrêtage du site d'injection est nécessaire.

2. Vaginal Inoculation avec GBS

  1. Un jour avant l'inoculation, développer une culture liquide pendant la nuit 5 ml d'une souche GBS d'intérêt, tels que les A909 (sérotype Ia), dans un bouillon Todd Hewitt (THB) à 37 ° C.
  2. Repiquer la culture de la nuit GBS à un volume 01h10 en THB frais et incuber à 37 ° C. Cultivez labactéries à la phase mi-log (DO 600 = 0,4-0,5). NOTE: Cela prend généralement 2 - 3 h, en fonction de la souche de GBS.
  3. Transférer la sous-culture à une bactérie stériles tube et à granulés coniques de 15 ml à 3000 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension le culot bactérien dans 200 ul de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
  4. En utilisant le culot remis en suspension, apporter 3 - 5 ml de PBS (1 ml par souris) 10 exactement DO600 = 0,4 dans un nouveau tube de culture de 5 ml. Ce sera une concentration de 1 x 10 ~ 8 unités formant des colonies (UFC) / ml. Transfert à un nouveau tube conique de 15 ml et re-sédimenter les bactéries à 3000 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
  5. Remettre en suspension le culot dans du PBS à 1/10 du volume initial. Par exemple, si 3 ml de DO600 = 0,4 a été pastillé, puis remettre en suspension dans 300 pi de PBS. NOTE: Ceci est la suspension finale bactérienne (~ 1 × 10 9 UFC / ml) utilisée pour l' inoculation des animaux.
  6. ReServe 50 pi de cette suspension pour la dilution en série et étalement sur gélose THB pour déterminer l'inoculum exacte.
  7. Inoculer chaque souris avec 10 pi de la suspension bactérienne finale de telle sorte que 1 × 10 7 UFC est administré à chaque souris.
    1. Pour inoculer, restreindre la souris manuellement en fixant la peau lâche à la peau du cou entre le pouce du gestionnaire et l' index, puis immobilisant la queue, comme décrit précédemment 28.
    2. Dresser 10 ul du GBS préparé à l'étape 2.6 en une pointe de chargement pipette gel de 200 pi. Insérez le bout de 5 à 10 mm dans la lumière du vagin et de distribuer les 10 ul d'inoculum.
      REMARQUE: Conseils de chargement de gel sont préférés aux standards des conseils de 200 pi pour minimiser le risque de traumatisme des organes ou des blessures, en particulier chez les souris plus jeunes ou plus petites.
    3. Immédiatement après inoculation, relâcher la peau du cou, et d'élever l'extrémité arrière de la souris, en soulevant la souris par la queue et warler les pattes avant sur une surface dure pour ~ 1 min.
    4. Inspecter visuellement l'ouverture vaginale pour tout reflux d'inoculum. Si le reflux est observé, une pointe de pipette fraîche peut être utilisée pour manipuler ou agrandir l'orifice vaginal, ce qui facilite l'absorption du reflux dans la lumière. En outre, le reflux peut être aspiré par l'intermédiaire d'une pipette et ré-inoculée.
      NOTE: Si l'administration d'agents topiques, organismes probiotiques, ou des protéines d'intérêt, un volume jusqu'à 20 ul dans un tampon physiologique peut être donné dans le tractus vaginal.

3. écouvillonnage le Vaginal Lumen à Quantifier GBS charge

  1. Préparer un tube de 1,5 ml de micro-centrifugeuse par souris en ajoutant 100 pi de PBS. Juste avant pistonnage, pré-humidifier l'écouvillon dans PBS.
  2. Retiens la souris comme décrit dans l'étape 2.7.1 et insérer la tige de 10 mm dans la lumière vaginale. Tournez doucement l'écouvillon 4 fois dans le sens horaire et 4 fois dans le sens antihoraire, en appliquant une légère pression sur la paroi vaginale.
  3. Transférer le coton-tige sur le tube de microcentrifugation de 1,5 ml, avec 100 ul de PBS. Avant de placage, vortex le tube de microcentrifugeuse pendant ~ 15 sec pour libérer les bactéries de l'écouvillon. Chaque échantillon dilué en série dans du PBS et de la plaque 20 ul de dilutions 1:10 à 1: 10000 sur des plaques différentielles milieu d'agar-agar préparées selon les instructions du fabricant. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 heures. colonies de GBS apparaissent soit rose vif ou de couleur mauve. Autres flore endogène seront inhibés ou apparaissent sous forme de colonies bleu, blanc ou gris.

4. Collecter le liquide vaginal Lavage

  1. Retiens la souris comme décrit à l'étape 2.7.1. En utilisant une pointe de pipette chargement de gel de 200 pi, pipette 20 ul de PBS dans la lumière vaginale. pipeter doucement la totalité du volume de haut en bas 4 fois dans la lumière, puis retirer la totalité du volume de la même pointe de la pipette. NOTE: Si le liquide de lavage est épaisse avec les muqueuses, une pointe de pipette 200 pi normepeut être utilisé pour recueillir le liquide de lavage final.
  2. En cas d'enregistrement du liquide de lavage pour l'analyse des cytokines ou UFC quantification distribuer dans un microtube de 0,7 ml. Si la détermination du stade de l'oestrus, distribuer au moins 5 pi de liquide de lavage sur une lame de verre et d'observer les cellules sous grossissement 100X sur un microscope optique. NOTE: Pour des exemples d'étapes œstraux, voir la figure 1.

5. Dissection tissulaire et Homogénéisation

  1. Pour chaque souris, préparer trois 2 ml tubes à bouchon à vis (un pour chaque tissu: vagin, col de l'utérus, et de l'utérus). Remplir chaque tube avec de grandes (0,4 à 0,5 g) 1,0 mm perles de zircone pour couvrir le fond de forme conique du tube.
  2. Autoclaver les tubes préparés avant la collecte des tissus pendant 30 minutes à 121 ° C, en particulier si la quantification de la charge bactérienne. Ajouter 500 ul de PBS stérile à chaque tube. Peser chaque tube après autoclavage et record pour référence future pour calculer le poids des tissus récupérés.
    3. 2 asphyxie et dislocation cervicale. Vaporiser vers le bas de l'abdomen ventral avec 70% EtOH. Avec des ciseaux stériles, ouvrir la cavité abdomino-pelvien, soulever la peau du dos et les muscles abdominaux, et de déplacer les intestins afin que l'appareil reproducteur est exposé.
  3. Stériliser les ciseaux avec 70% EtOH, essuyez si nécessaire, et couper les deux cornes utérines à mi-longueur entre le corps de l'utérus et des ovaires. Avec des ciseaux et des pinces, la graisse viscérale séparée, membranes, et la vessie loin de l'appareil reproducteur, le déplacement caudale.
  4. Stériliser ciseaux comme décrit à l'étape 5.4. Transversalement couper le vagin aussi près de la vulve que possible de séparer l'appareil reproducteur du corps. Soulevez et retirez l'appareil reproducteur intact et le placer dans une boîte de Pétri stérile.
  5. En utilisant une nouvelle lame de rasoir, séparer l'utérus du col dans une coupe transversale. Stériliser la lame de rasoir avec 70%EtOH, puis séparer le col du vagin dans une coupe transversale. NOTE: Il y aura une quantité minimale de tissu utérin encore attaché au col. Il y aura une quantité minimale de tissu vaginal toujours attaché au col.
  6. En utilisant des pinces stériles, transférer chacun des tissus dans leurs tubes de 2 ml respectifs contenant du PBS et homogénéisant perles. Nettoyer la pince avec 70% EtOH entre la manipulation de chaque tissu.
  7. Peser chaque tube de bouchon à vis de 2 ml et soustraire le poids original du tube pour déterminer le poids de tissu. poids de tissus varient généralement entre 20-100 mg. sceller hermétiquement les tubes à bouchon à vis et à homogénéiser les tissus pendant 1 min à vitesse maximale dans un homogénéisateur de tissus.
  8. Pour quantifier la charge bactérienne, diluer en série 25 pi d'homogénat de tissu et des dilutions de plaque 1:10 à 1: 10.000 sur des plaques d'agar de milieu différentiel. Incuber les plaques comme décrit à l'étape 3.3. Pour stocker des échantillons pour cytokine quantification, geler homogénats de tissus à -20 ° C.

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Representative Results

Au cours du développement de ce modèle, plusieurs observations ont été faites au sujet des facteurs qui influent sur la durée de GBS colonisation vaginale. Pour déterminer le stade comment estrous les impacts d'inoculation GBS persistance bactérienne, les souris ont été organisées le jour de l'inoculation par le liquide de lavage vaginal. La figure 1 illustre les quatre étapes du cycle oestral de la souris, tel que déterminé par voie humide monter vaginal liquide de lavage, une méthode bien établie 29. Les souris ont été divisés en groupes en fonction de ce stade initial, et GBS persistance a été suivie au fil du temps par l'intermédiaire d'écouvillonnage vaginal. Les souris inoculées au stade proœstrus ont été colonisées par GBS plus longtemps que tout autre stade de l' oestrus, en particulier ceux de diestrus au moment de l' inoculation (Figure 2). Sur la base de ces résultats, dans le modèle actuel, les souris sont traitées avec des β-oestradiol un jour avant l'inoculation GBS pour les synchroniser dans l'étape de proestrus. D' autres modèles murins d'infections de l' appareil reproducteur ont démontré une capacité accrue de l'organisme pathogène à persister lorsque les souris sont maintenues dans la phase de l' oestrus par le traitement de l' estradiol exogène 30,31. Pour déterminer si ce phénomène a également eu lieu pendant la colonisation vaginale avec GBS, GBS persistance a été surveillée pendant le traitement répété de β-estradiol. Oestrus soutenue promu GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) dans la persistance souris CD-1, avec 90% de la colonisation 2 semaines après l'inoculation (figure 3A). Dans une expérience typique avec une dose de β-oestradiol avant l'inoculation, seulement 40 à 50% des souris ont été colonisés une semaine après l'inoculation (Figure 4). La moyenne GBS UFC récupéré à partir de ces souris mimant le pourcentage de colonisation (figure 3B). Bien que ces résultats ont été obtenus à partir d'expériences indépendantes, ces données démonstrate que le maintien de l'oestrus continu favorise la persistance GBS vaginale chez la majorité des souris CD-1.

Bien que la réalisation d'expériences de colonisation en utilisant humaine différente GBS isole, il a été observé que les souches varient dans leur capacité à persister dans souris CD-1, allant de quelques jours à un mois au-delà. Parmi les souches testées, NCTC 10/84 avait la plus courte durée, A909 et COH1 a persisté pendant une à deux semaines, alors que la souche CJB111 a persisté dans la majorité des souris pendant deux semaines (figure 4) et même au - delà d' un mois (données non présentées) . À ce jour, il n'y a pas de corrélation observée de sérotype et de la capacité à persister dans la voie vaginale de la souris; cependant, des différences significatives entre les souches de GBS individuelles ont été rapportés 25. La capacité de l'ABG à coloniser plusieurs lignées de souris consanguines et non consanguines a également été examinée. GBS souche A909 a persisté dans le tractus vaginal pendant environ une semaine dans consanguine CD-1des souris et des souris FVB consanguines (figure 5). En variante, la majeure partie de lignée pure Balb / c et C57BL / 6 ont été colonisés à une semaine (figure 5) et est resté colonisé pendant un mois ou au - delà (données non présentées).

En utilisant ce protocole, GBS colonisation vaginale in vivo a été visualisée par inoculer des souris avec une GFP exprimant la souche GBS plasmidique et le tissu de collecte pour la microscopie à fluorescence. GFP-GBS a été détectée à la fois adhérer à murines épithélium vaginal (figure 6A) et à proximité de la flore vaginale indigènes (Figure 6B). Aucun signal de la GFP a été détectée chez des souris qui ont éliminé la GFP-GBS au moment de la collecte de tissus (données non présentées).

Figure 1
Figure 1: Identification du Stade de Estrus de murin non marqué vaginal Lavage Fluid. (A) Proestrus: cellules épithéliales squameuses nucléées abondantes (flèches noires). (B) Estrus: cellules épithéliales squameuses cornées abondantes (flèches bleues). (C) metoestrus: mélange de cellules épithéliales squameuses nucléées et cornées et principalement les leucocytes (flèches grises). (D) Diestrus: leucocytes abondantes. Grossissement = 100X, barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: oestrus Scène Impacts Vaginal Persistance de GBS. Pour cent des souris CD-1 colonisée avec 1 × 10 7 UFC GBS A909 au fil du temps. Les souris ont été regroupées (n = 7-11 / groupe) basé sur scène estrous au moment de l'ABG inoculation, tel que déterminé par lavage vaginal fluide. Une expérience indépendante est représentée. Ce chiffre a été modifié depuis les travaux précédemment publiés et réimprimé avec la permission 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Le traitement continue avec β-estradiol Favorise GBS vaginal Persistance. Colonisé pour cent (A) ou récupéré UFC (B) de souris CD-1 (n = 10) inoculés avec 1 x 10 7 UFC GBS A909 et maintenus sur le traitement des β-oestradiol. Les souris ont été injectées avec des β-oestradiol un jour avant l'inoculation et GBS aux jours 1, 3 et 5 après l'inoculation. Une expérience indépendante est représentée. La ligne (B) représente des substances récupérées CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: ABG Souches se distinguent par leur capacité à persister dans la Vaginal Tract. Consanguine souris CD-1 (n = 10 / groupe) ont reçu une injection d'une dose unique de β-oestradiol un jour avant l'inoculation avec GBS 1 × 10 7 UFC des souches de GBS données. Des expériences avec chaque souche ont été réalisées de façon indépendante et ont été répétées au moins trois fois; un résultat représentatif est montré. Ce chiffre a été modifié depuis les travaux précédemment publiés et réimprimé avec la permission 25. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5: Souches de souris diffèrent dans leur capacité à être colonisée par le SGB dans le Vaginal Tract. Des souris des souches indiquées de fond ont été injectés avec une dose unique de β-oestradiol un jour avant l' inoculation de 1 x 10 7 UFC de GBS A909. Des expériences avec chaque souche ont été réalisées de façon indépendante et ont été répétées au moins deux fois; un résultat représentatif est montré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Imagerie Fluorescent de SGB au sein de la souris Vaginal Tract. Visualisation de GFP exprimant GBS (vert) le long de l'épithélium vaginal à un grossissement = 630X, barre d'échelle = 50 pm (A), et à proximité de endogenous microbes vaginaux au grossissement = 1,000X, barre d'échelle = 20 pm (B). Bleuissement = DAPI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Compilation de GBS Souches et Lignes de souris utilisées pour vaginaux études Colonisation. GBS souches de fond, des lignées de souris, et le dosage de la β-estradiol sont indiqués. Des études utilisant le modèle décrit dans ce travail sont mis en évidence en gris.

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Discussion

Pour favoriser l'avancement de la compréhension des interactions GBS avec le l'hôte et d'autres microbes dans le contexte de l'hôte, un modèle animal est nécessaire. Ce travail décrit les aspects techniques de l'établissement GBS colonisation vaginale chez la souris. Ce protocole permet d'obtenir> 90% colonisation de souris sans l'utilisation d'anesthésiques pour inoculer les bactéries ou pour prélever des échantillons d'écouvillons, immuno-suppresseurs pour permettre la colonisation, de pré-lavage vaginal, ou des additifs pour épaissir l'inoculum. En outre, ce modèle démontre la reproductibilité robuste, avec modeste variabilité inter-expérimentale à la fois la longueur de l'ABG persistance et la charge bactérienne. Les résultats représentatifs démontré dans cette étude sont la compilation d'expériences indépendantes et devraient être une référence pour la conception future expérimentale; Cependant, les comparaisons directes entre souches de GBS et des lignées de souris doivent être faites avec soin.

Ce modèle imite colonizati humainssur le fait que la muqueuse vaginale colonisation GBS de souris semble être limitée à l'appareil reproducteur. Bien que l' ascension dans le col et de l' utérus a été observé avec plusieurs GBS souches 25, les souris ne présentent pas de signes de morbidité ou de mortalité, même après des mois de la colonisation. En outre, en fonction du GBS et des souches de souris étudiées, les souris présentent une colonisation vaginale cohérente ou transitoire, ce qui est utile pour étudier les facteurs bactériens et héberger les réponses immunitaires, respectivement. Dans ce modèle, certaines souris affichent la colonisation intermittente; il est actuellement impossible de savoir si les souris deviennent recolonisé à des moments plus tard ou si la colonisation tombe en dessous de la limite de détection, typiquement de 50 à 100 UFC, à certains points de temps. À noter, la transmission entre les souris n'a pas été observé lorsque colonisés et les souris non-colonisés sont logés ensemble pendant plusieurs semaines (données non présentées).

Cette méthode utilise un milieu sélectif et différentiel disponible dans le commercepour GBS de quantifier la charge bactérienne de la souris. GBS pousse colonies roses ou mauves comme vives qui sont facilement visibles après 24 heures d'incubation. Ce support a été démontré qu'ils ont une plus grande sensibilité pour la détection de SGB par rapport à d' autres milieux, y compris la gélose au sang et le milieu Granada 32, et a été utilisé en combinaison avec des tests d'agglutination au latex bourrelet pour confirmer GBS 18 isolats cliniques. Dans cette étude, lumineux colonies roses ou mauves de non-GBS colonisées souris ont jamais été récupérés. Certaines flore endogène, typiquement les espèces Enterococcus, augmentera à mesure que des colonies bleues, et quelques colonies apparaissent blanc, gris, ou très rose pâle. Fait important, les plaques doivent être comptées après 18 à 24 heures d'incubation, sous forme de colonies non-ABG peuvent incorporer le pigment rose si on les laisse dans l'incubateur ou sur la paillasse pendant de longues périodes. Nous avons observé, comme cela a été indiqué précédemment 32, que certains isolats de S. pyogenes vont former des colonies roses sur CHROMagar StrepB, mais ces colonies sont généralement plus petits que les colonies de GBS. S. pyogenes n'a pas été isolé à partir de la flore vaginale endogènes de souris dans ces études, mais cette observation devraient être pris en compte dans les travaux futurs.

La majorité des résultats ont été obtenus à partir de la lignée de souris CD-1 consanguine, ce qui démontre les réponses immunitaires innées robustes dans les premiers jours après l'inoculation, avec clairance bactérienne subséquente dans la majorité des souris 19. D' autres ont également testé des souches de GBS supplémentaires et ont observé une persistance plus longue fois 33,34. Depuis le développement de ce modèle, d' autres groupes ont commencé à développer des modèles de souris similaires de GBS colonisation vaginale pour examiner l'impact de l' hôte des réponses immunitaires 33,35, les thérapies préventives 36,37, et la transmission au foetus in utero 34,38. Ces différences peuvent être expliquées par une variété de facteurs, y compris les déterminants génétiques qui influent sur les réponses immunitaires et til composition de la flore vaginale indigènes. Nous avons compilé une liste des souches de GBS et des lignées de souris respectives qui ont été étudiés à ce jour dans GBS études de colonisation vaginale (Tableau 1). Le nombre d'études récentes avec des modèles animaux met en évidence l'intérêt et la nécessité de ces types de modèles dans le domaine de la recherche sur la pathogenèse GBS.

Dans le tractus vaginal immunité muqueuse est étroitement régulée par des hormones stéroïdes 44, et même une dose de β-oestradiol, tel que décrit dans ce modèle perturbe la réponse immunitaire de l' hôte. Même ainsi, il y a des réponses immunitaires innées robustes dans les premiers jours de la colonisation GBS 19,25, ce qui suggère que les réponses immunitaires affectées sont en grande partie intact. Les modèles qui impliquent des injections répétées de ß-estradiol peut prolonger la persistance GBS vaginal, comme démontré dans cette étude (Figure 3) et par d' autres 33. Cependant, les réponses immunitaires et phy de l'appareil reproducteurlogie peut être plus confus, ce qui rend les résultats difficiles à interpréter. Fait important, les différences décrites dans différents GBS isolats et souches de souris dans cette étude peuvent être modifiés au cours des modèles de oestrus soutenue et devraient être étudiés dans les travaux futurs. Il convient de noter, ni stade oestrus , ni GBS sérotype touchés colonisation vaginale dans un modèle de rat 22. En outre, le pH vaginal acide humain de 03.06 à 04.05 45 diffère considérablement du pH vaginal murin plus neutre de 6,5 46, ce qui peut avoir un impact expression du gène GBS et les facteurs suivants ont contribué à la colonisation. Enfin, la flore vaginale native est distincte entre les humains et leurs homologues modèles murins, et les travaux futurs devraient examiner GBS colonisation chez des souris gnotobiotiques portant la flore vaginale humaines.

En résumé, ces études ont cherché à examiner l'hôte et facteurs bactériens qui régissent GBS colonisation vaginale. Principalement, le robuste, modèle animal innovant de GBS col vaginalonisation développée dans ce travail peut être utilisé pour décrire les interactions hôte-microbe complexes dans un environnement vaginal in vivo. Les informations obtenues à partir de ce modèle a déjà considérablement augmenté la connaissance des composantes immunitaires de l'hôte et des gènes GBS spécifiques qui contrôlent GBS persistance vaginale. De plus, ces résultats ont soulevé des questions supplémentaires et seront utiles pour la poursuite du développement de nouveaux produits thérapeutiques pour limiter la mère GBS colonisation vaginale et l'exposition subséquente du nouveau-né.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

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Infection numéro 117 Groupe B GBS, Le modèle de colonisation vaginale modèle murin l'interaction bactérienne-hôte
Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation
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Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

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