Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל Murine של הקבוצה B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לחקות קבוצה אנושית B Streptococcus (GBS) קולוניזציה וגינלית במודל בעכברים. שיטה זו עשויה לשמש כדי לחקור תגובות מארחות חיסוניות וגורם חיידקי תורם התמדת נרתיק GBS, כמו גם לבחון אסטרטגיות טיפוליות.

Abstract

סטרפטוקוקוס agalactiae (מהקבוצה B Streptococcus, GBS), הוא למעצמה קולוניאלית גראם חיובי, ללא תסמינים של מערכת העיכול האנושית ודרכי נרתיק של 10 - 30% ממבוגרים. אצל אנשים החיסון נפגעת, בילודים כולל, נשים בהריון, קשישים, GBS עלול לעבור פתוגן פולשנית גרימת אלח דם, דלקת פרקים, דלקת ריאות, דלקת קרום המוח. בגלל GBS הוא הפתוגן חיידקי מובילה של ילודים, מניעה הנוכחית מורכבת ההקרנה הריון מאוחר לגרורות GBS בנרתיק וטיפול אנטיביוטי שלאחר מכן peripartum של אמהות GBS חיובי. נטלו נרתיק GBS כבד הוא גורם סיכון למחלה והתנחלות בילוד. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על המארח וגורם חיידקי מקדמים או להתיר GBS קולוניזציה וגינלית. פרוטוקול זה מתאר טכניקה להקמת קולוניזציה וגינלית GBS המתמשכת באמצעות דגימה אחת β-אסטרדיול טרום טיפול יומי לקבוע לואה חיידקיםד. זה שיטות לפרטים נוספים כדי לנהל סוגי טיפולים נוספים או ריאגנטים עניין לאסוף נוזל שטיפה וגינלית ורקמות במערכת הרבייה. במודל עכבר זה יהיה עוד יותר את ההבנה של יחסי הגומלין GBS-המארח בתוך סביבת הנרתיק, אשר יוביל טיפולית מעניינת פוטנציאל לשלוט קולוניזציה הנרתיק של האם במהלך ההריון כדי למנוע העברת לגבי הילוד פגיע. זה גם יהיה עניין להגדיל את הבנתנו אינטראקציות חיידקי מארח כלליות בדרכי הנרתיק הנשיות.

Introduction

סטרפטוקוקוס agalactiae, מקבוצה B Streptococcus (GBS), הוא חיידק כמוס, גראם חיוביים אשר מבודד לעתים קרובות מהבטן בדרכי המין והשתן של מבוגרים בריאים. בשנות ה -1970, GBS התגלה בתור הסוכן המוביל לתמותה בילוד זיהומיות, עם למעלה מ -7,000 מקרים של המחלה בילוד בשנה 1. מחלה מוקדמת GBS (סוף יום) מתרחשת בשעות או בימים הראשונים של החיים, נשאלת דלקת ריאות או מצוקה נשימתית, ולעתים קרובות מתפתח אלח דם, ואילו מחלות בגיל מאוחר (לוד) מתפתח לאחר מספר חודשים ומציג עם בקטרמיה, אשר לעתים קרובות ומקדמות דלקת קרום המוח 2. החל משנת 2002, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ממליץ על בדיקה אוניברסלית עבור קולוניזציה וגינלית GBS ב הריון מאוחר וטיפול מונע אנטיביוטי במהלך הלידה (IAP) כדי GBS חיובי אמהות 1. למרות הירידה של המחלה מוקדמת בכ -1,000 מקרים בארצות הברית מדי שנה בשל IAP,GBS נשאר הגורם המוביל של אלח דם בילוד מוקדם, ו התרחשות מאוחרת נשארת 1 מעושה. בין אם ברחם, בזמן הלידה, או אפילו במקרים בגיל מאוחר, חשיפה לידתי עד GBS דורשת הישרדות, משוכל באמצעות מספר סביבות מארחות ומחסומים, התחמקות חיסונית, וכן, במקרה של דלקת קרום מוח, חציית דם הפיקוח ההדוק מוח 2. Upstream של אינטראקציות הארסיות אלה בתוך הילוד הוא קולוניזציה הראשונית של מערכת הנרתיק האימהית. אימהי שיעורי קולוניזציה וגינלית GBS נעים בין 8-18% במדינות מפותחות ומתפתחות, עם שיעור ממוצע מוערך של 12.7% 3,4. קולוניזציה GBS בדרך בנרתיק במהלך ההריון יכולה להיות קבועה, לסירוגין, או בעלת אופי ארעי בקרב נשים בודדות 5. נקודה מעניינת הוא אימהית גיל> 36 שנים קשורות קולוניזציה המתמשכת 6. גורמי סיכון ביולוגי סוציו אקונומי רבים להתיישבות הנרתיק GBSזוהה. גורמים ביולוגיים כוללים קולוניזציה GBS העיכול והיעדר לקטובצילוס בתוך הבטן. עם זאת, מוצא אתני, השמנת יתר, היגיינה, פעילות מינית גם קושרו עם מרכבת 7 נרתיק GBS.

למרות לשמצה בגרימת זיהומים בילוד, GBS גורם גם מגוון של זיהומים אימהיים הוא peripartum ולאחר לידה. מרכבת GBS היא גדלה אצל נשים עם הצגת דלקת נרתיק 8 ו, במקרים מסוימים, יכולה להיות אפילו את ישות מחל 9. בנוסף, התרוממות GBS באיברי הרבייה במהלך ההריון עלולה לגרום זיהום תוך-שפיר או chorioamnionitis 10. יתר על כן, ב עד 3.5% מכלל ההריונות, GBS מפיצה לשלפוחית השתן לגרום לזיהום בדרכי השתן או בקטרוריה אסימפטומטית 11. בקטרוריה GBS במהלך ההריון קשורה לסיכון מוגבר של קדחת לידתית, chorioamnionitis, לידה מוקדמת, ואת prematurקרע הדואר של ממברנות 12. יחדיו, בנוכחות GBS בתוך מערכת הנרתיק קשורה לזיהומים של רקמות מארחים מרובים, ואת היכולת לבטל GBS מן הנישה הזו הוא הכרחי עבור שניהם בריאות האם בילוד.

עד לאחרונה, רוב העבודה בחינת אינטראקציות GBS עם מערכת הצרויקו הוגבל מודלים תא במבחנה 13-15. ניסויים במבחנה אלה חשפו גורמי חיידקיים שחשובים לדבקות, כוללים חלבוני משטח כזה חוזר פילים ו סרין עשיר 17,18, כמו גם מערכות רגולטוריות דו רכיבים 15,19 ותגובת התעתיק העולמית של האפיתל נרתיקית GBS 19. עם זאת, על מנת להבהיר את מארח חיידק האינטראקציות באופן מלא בתוך מערכת הנרתיק, במודל חיה חזק הכרחי. עבודה מוקדמת הראתה כי GBS ניתן להשבה מתוך בדרכי הנרתיק של עכברים מחוסנים 20,21 וחולדות <sup> 22 בשני תנאים בהריון שאינן בהריון. בשנת 2005, קולוניזציה וגינלית GBS לטווח קצר הייתה דגם בעכברים כדי לבחון את היעילות של אנזים ממס הפאג לטיפול GBS בנרתיק פני תקופה של 24 שעות 23. מספר שנים לאחר מכן, במודל של עכברי קולוניזציה וגינלית לטווח ארוך GBS פותח ללמוד גורמים המארח חיידקי מסדירי התמדת GBS. מודל זה זיהה מספר גורמים GBS תורם קולוניזציה, כולל הנספחים משטח 17,18 ומערכות דו רכיבי GBS 19,24. מודל זה תרם לזיהוי מנגנוני התגובה מארח 19,25 ו שימש כדי לבדוק אסטרטגיות טיפוליות שונות, כולל פפטידים אימונו-26 ו פרוביוטיקה 27. פרוטוקול זה נותן את ההדרכה הדרושה כדי לחסן GBS לדרכי עכבר הנרתיק ולאחר מכן לעקוב קולוניזציה ולאסוף דגימות עבור ניתוחים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי משרד טיפול בבעלי חי מעבדה בסן דייגו סטייט ועורך תחת סטנדרטי וטרינרים קבלו. עכברים נקבה, גיל 8 - 16 שבועות, שימשו לפיתוח שיטה זו.

1. הזרקת הכנה Intraperitoneal של β-אסטרדיול

  1. מדוד את β-אסטרדיול (0.5 מ"ג / עכבר) על לשקול נייר כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). זהירות: β-אסטרדיול יכול להיספג דרך העור ומשטחים ריריים.
  2. העבר β-אסטרדיול לצינור מערבולת חרוטי 15 מ"ל עד שכל הגושים יוסרו β-אסטרדיול הוא אבקה דקה. צייר את שמן שומשום (100 μl / עכבר) לתוך מזרק 10 מ"ל. מזרק-מסנן שמן שומשום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל את-אסטרדיול β באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר. וורטקס צינור חרוטי 15 מ"ל עד-אסטרדיול β הוא תרחיף הומוגני בשמן שומשום.
  3. צייר את β-esההשעיה tradiol לתוך מזרק 10 מ"ל חדש. עם 18 G, 1-ב. מחט, aliquot 100 μl של ההשעיה לתוך מזרקים טוברקולין 1 מ"ל. הכן מזרק אחד עבור כל עכבר. מניח 26 חדש, הסטרילי G, ½-ב. מחט על מזרק אחד טוברקולין.
  4. נהל 0.5 מ"ג של β-אסטרדיול המרחפים 100 μl של שמן שומשום (5 מ"ג / מ"ל) לכל עכבר 24 שעות לפני חיסון חיידקי. להזריק כל עכבר בתוך החלל הצפק, ב רביעי הבטן התחתונים, רק בצד ימין או שמאל של קו האמצע, כפי שתואר לעיל 28.
    הערה: אין ניקוי או הגזיזה של הזריקה הוא הכרחי.

2. נרתיקי הרכבה עם GBS

  1. יום אחד לפני חיסון, לגדל תרבית נוזל לילה 5 מ"ל של זן של עניין GBS, כגון A909 (סרוטיפ Ia), במרק טוד יואיט (THB) על 37 מעלות צלזיוס.
  2. תת תרבות GBS הלילה בווליום 01:10 לתוך THB הטרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס. לגדל אתחיידקים לשלב יומן אמצע (OD 600 = 0.4-0.5). הערה: זה בדרך כלל ייקח 2 - 3 שעות, בהתאם לזן של GBS.
  3. מעביר את תת-התרבות על חיידקי צינור גלול חרוטי 15 מיליליטר סטרילי ב 3000 g × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה חיידקי 200 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS).
  4. באמצעות הגלולה המושעית, להביא 3 - 5 מיליליטר של PBS (1 מיליליטר לכל 10 עכברים) בדיוק OD 600 = 0.4 בתוך שפופרת תרבות של 5 מיליליטר חדשה. זה יהיה ריכוז של ~ 1 × 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / מ"ל. מעבירים צינור חרוטי 15 מ"ל חדש מחדש גלולה החיידקים 3,000 גרם × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
  5. Resuspend גלולה ב PBS ב 1/10 נפח המקורי. לדוגמה, אם 3 מ"ל של OD 600 = 0.4 היה pelleted, ואז resuspend אותו 300 μl של PBS. הערה: זהו השעית החיידקים הסופית (~ 1 × 10 9 CFU / ml) המשמשת חיסון בעלי חיים.
  6. Reserve 50 μl של השעיה זו דילול סדרתי ציפוי על אגר THB לקבוע את הבידוד מדויק.
  7. לחסן כל עכבר עם 10 μl של השעית החיידקים הסופית כך 1 × 10 7 CFU ניתנת כל עכבר.
    1. כדי לחסן, לרסן את העכבר באופן ידני על ידי הבטחת העור הרפוי על בעורפו בין של האגודל ואצבע מורה המטפלים ולאחר מכן לשתק את הזנב, כפי שתואר לעיל 28.
    2. צייר את 10 μl של GBS מוכן בשלב 2.6 לתוך קצה פיפטה טעינת ג'ל 200 μl. הכנס את קצה 5 עד 10 מ"מ לתוך לומן בנרתיק לוותר על 10 μl של הבידוד.
      הערה: טיפי טעינת ג'ל עדיפים על טיפי 200 μl סטנדרטיים כדי למזער את הסיכון של טראומה או פציעת איברים, במיוחד עכברים צעירים יותר או קטנים יותר.
    3. מייד לאחר חיסון, לשחרר את בעורף ולרומם את הקצה האחורי של העכבר, הרמת העכבר בזנבו walking את רגליו הקדמיות על משטח קשה עבור ~ 1 דק '.
    4. ראייה לבדוק את פתח הנרתיק לכל backflow של בידוד. אם backflow הוא ציין, קצה פיפטה טרי ניתן להשתמש כדי לתפעל או להגדיל את פתח הנרתיק, דבר המקל על ספיגה של הזרימה חוזר לתוך לומן. בנוסף, backflow ניתן aspirated דרך פיפטה מחדש מחוסן.
      הערה: אם מתן סוכנים אקטואליים, אורגניזמים פרוביוטיים, או חלבונים בעלי עניין, בהיקף של עד 20 μl חיץ פיסיולוגי יכול להינתן בדרכי נרתיקית.

3. שטיפת לומן בנרתיק לכמת טען GBS

  1. הכן אחד צינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מ"ל לכל עכבר על ידי הוספת 100 μl של PBS. זמן קצר לפני בניקוי, טרום להרטיב את הספוגית ב PBS.
  2. לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1 והכנס את ספוגית 10 מ"מ לתוך לומן הנרתיק. בעדינות לסובב את ספוגית 4 פעמים עם כיוון השעון ו -4 פעמים נגד כיוון השעון, הפעלת לחץ קל על קיר הנרתיק.
  3. מעבירים את ספוגית אל הצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם 100 μl של PBS. לפני הציפוי, מערבולת צינור microcentrifuge עבור ~ 15 שניות כדי לשחרר את חיידקי מהמקלון. סדרתי לדלל מדגם ב PBS צלחת 20 μl של דילולים 1:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש מוכן לפי הוראות היצרן. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מושבות GBS יופיעו גם ורוד או סגול בהיר בצבע. פלורה אנדוגני אחרת תהיה עכבות, או תופיע מושבות כחולות, לבנות או אפורות.

4. איסוף נוזלים בנרתיק שטיפה

  1. לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1. בעזרת קצה פיפטה טעינת ג'ל 200-μl, pipet 20 μl של PBS לתוך לומן הנרתיק. בעדינות pipet את הווליום כולו ולמטה 4 פעמים בתוך לומן, ולאחר מכן למשוך את כל נפח באותו קצה פיפטה. הערה: אם נוזל השטיפה הוא עבה עם רירי, קצה פיפטה תקן 200 μlניתן להשתמש כדי לאסוף את נוזל השטיפה הסופי.
  2. אם חיסכון נוזל שטיפה לניתוח ציטוקינים או כימות CFU, לוותר לתוך צינור microcentrifuge 0.7 מ"ל. אם קביעת השלב של ייחום, לוותר לפחות 5 μl של נוזל שטיפה לשקופית זכוכית ולבחון את התאים בהגדלה 100X על מיקרוסקופ אור. הערה: לקבלת דוגמאות של שלבי הייחום, ראה איור 1.

Dissection רקמות 5. המגון

  1. עבור כל עכבר, להכין שלושה צינורות מתברגים 2 מיליליטר (אחד לכל רקמות: נרתיק, צוואר רחם, ורחם). ממלא כל צינור עם מספיק (0.4 - 0.5 גרם) 1.0 מ"מ חרוזי zirconia כדי לכסות את תחתית החרוטים בצורה של הצינור.
  2. חיטוי הצינורות המוכנים לפני איסוף רקמות במשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, במיוחד אם לכימותי עומס חיידקים. הוסף 500 μl של PBS סטרילי כדי צינור אחד. לשקול כל צינור לאחר מעוקר ולהקליט לשימוש עתידי כדי לחשב משקל רקמה התאושש.
    3. 2 ו נקע בצוואר הרחם. תרסיס לאורך הבטן הגחון עם 70% EtOH. במספריים סטריליות, לפתוח את חלל abdominopelvic, להרים את העור שרירי הגב ועל הבטן, ואת מקומו המעיים כך במערכת הרבייה חשופה.
  3. לעקר את המספריים עם 70% EtOH, לנגב לנקות במידת הצורך, והעביר את שני קרני הרחם באורך אמצע בין הגוף הרחם והשחלות. בעזרת מספרי מלקחיים, שומן קרבי נפרד, ממברנות, ואת שלפוחית ​​השתן מן במערכת הרבייה, נע caudally.
  4. לעקר מספריים כמתואר בשלב 5.4. רוחבי לחתוך את הנרתיק קרוב הפות ככל האפשר כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. הרם והוצא את מערכת הרבייה השלמה ולמקם אותו בצלחת פטרי סטרילית.
  5. באמצעות סכין גילוח חדש, להפריד את הרחם מצוואר הרחם ב קיצוץ רוחבי אחד. לעקר את סכין הגילוח עם 70%EtOH, ולאחר מכן להפריד את צוואר הרחם מהנרתיק ב קיצוץ רוחבי אחד. הערה: לא תהיה כמות מינימלית של רקמת הרחם עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. תהיה כמות מינימאלית של רקמת נרתיק עדיין מחוברת אל צוואר הרחם.
  6. בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את כל הרקמות לתוך צינורות 2 מ"ל של כל אחד מהם המכיל PBS ו שמאחד חרוזים. נקה את המלקחיים עם 70% EtOH בין טיפול בכל רקמה.
  7. לשקול כל צינור כובע בורג 2 מ"ל ולחסר את המשקל המקורי של צינור כדי לקבוע את משקל רקמות. משקולות רקמות בדרך כלל להשתנות בין 20 - 100 מ"ג. בחוזקה לאטום את צינורות כובע בורג homogenize הרקמות עבור 1 דקות במהירות המרבית ב homogenizer רקמות.
  8. כדי לכמת עומס חיידקי, סדרתי לדלל 25 μl של homogenate רקמות דילולים צלחת 01:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש. דגירה צלחות כמתואר בשלב 3.3. כדי לאחסן דגימות כימות ציטוקינים, להקפיא homogenates רקמה על -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך הפיתוח של המודל הזה, תצפיות מרובות נעשו לגבי הגורמים המשפיעים על משך קולוניזציה וגינלית GBS. כדי לקבוע כיצד לשלב הייחום בבית משפיע חיסון התמדה חיידקי GBS, עכברים בוימו ביום של חיסון באמצעות נוזל שטיפה וגינלית. איור 1 מדגים את ארבעת השלבים של מחזור הייחום העכבר, כפי שנקבע על ידי רטוב הר נוזל שטיפה וגינלית, שיטה מבוססת היטב 29. עכברים חולקו לקבוצות על פי בשלב ראשוני זה, והתמדה GBS היה פיקוח לאורך זמן באמצעות בניקוי הנרתיק. העכברים המחוסנים בשלב proestrus היו יישבו עם GBS יותר מכל שלב אחר של ייחום, בעיקר אלו המופיעות diestrus בעת החיסון (איור 2). בהתבסס על תוצאות אלו, במודל הנוכחי, עכברים מטופלים עם β-אסטרדיול יום אחד לפני חיסון GBS לסנכרן אותם לשלב proestrus. מודלים בעכברים אחרים של זיהומים בדרכי הרבייה הוכיחו יכולת מוגברת של האורגניזם פתוגניים להתמיד כאשר העכברים ניזונים בשלב ייחום דרך הטיפול אסטרדיול אקסוגניים 30,31. כדי לקבוע אם תופעה זו התרחשה גם במהלך הקולוניזציה הנרתיק עם GBS, התמדה GBS היה פיקוח במהלך הטיפול β-אסטרדיול חזר. ייחום מתמשך קדם A909 GBS (אוסף תרבות האמריקאי סוג, BAA-1138 # ATCC) התמדה בעכברי CD-1, עם 90% קולוניזציה 2 שבועות לאחר חיסון (איור 3 א). בניסוי טיפוסי עם מנה אחת של β-אסטרדיול לפני החיסון, רק 40-50% של עכברים היו יישבו שבוע לאחר חיסון (איור 4). הממוצע GBS CFU התאושש מעכברים אלה מחק את אחוז קולוניזציה (איור 3 ב). למרות התוצאות הללו התקבלו ניסויים בלתי תלויים, שדי נתונים אלהtrate כי שמירת ייחום מתמשך מקדמת התמדת נרתיק GBS ברוב המכריע של עכברי CD-1.

במהלך ביצוע ניסויים קולוניזציה באמצעות אנושיים שונים GBS מבודד, זה היה נראה כי זנים מגוונים ביכולתם להתמיד CD-1 עכברים, שנעו בין כמה ימים כדי מעבר לחודש. של הזנים שנבדקו, NCTC 10/84 היה המשך, A909 הקצר COH1 שנמשכה שבוע עד שבועות, בעוד זן CJB111 התמיד רוב העכברים במשך שבועות (איור 4) ואף מעבר לחודש (מידע לא מוצג) . עד כה, לא היה שום קשר נצפה של סרוטיפ ואת היכולת להתמיד בדרכי עכבר הנרתיק; עם זאת, הבדלים משמעותיים בין זני GBS פרט דווחו 25. היכולת של GBS ליישב מספר שורות עכבר מולדת ו outbred גם נבדק. A909 זן GBS תמיד בדרכי הנרתיק כשבוע ב -1 CD outbredעכברים עכברים FVB טהורים (איור 5). לחלופין, רוב BALB / ג טהור ו C57BL / 6 היו נשבו בשבוע אחד (איור 5) ונשאר יישבו במשך חודש או מעבר (מידע לא מוצג).

שימוש בפרוטוקול זה, קולוניזציה וגינלית GBS in vivo היה דמיינו ידי יחסנו עכברים עם זן GBS להביע GFP פלסמיד ואיסוף רקמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. GFP-GBS זוהה הוא דבק Murine אפיתל נרתיק (איור 6 א) ו בסמיכות הפלורה בנרתיק יליד אחר (איור 6). אין אות GFP זוהתה בעכברים כי פינו את GFP-GBS בעת איסוף רקמות (מידע לא מוצג).

איור 1
איור 1: זיהוי שלב של ייחום מנוזל בלא כתם Murine בנרתיק שטיפה. (א) Proestrus: תאי אפיתל קשקשיים בעלי הגרעין בשפע (חיצים שחורים). (ב) ייחום: תאי אפיתל קשקשיים cornified בשפע (חיצים כחולים). (C) Metestrus: תערובת של תאי אפיתל קשקשיים בעלי הגרעין ואת cornified בעיקרן לויקוציטים (חצים אפורים). (ד) Diestrus: לויקוציטים בשפע. הגדלה = 100X, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ייחום שלב השפעות בנרתיק התמדה של GBS. אחוז עכברי CD-1 יישב עם 1 × 10 7 CFU GBS A909 לאורך זמן. עכברי קובציו (n = 7 - 11 / קבוצה) מבוססים על במת ייחום בעת חיסון GBS, כפי שנקבע על ידי שטיפה וגינלית נוֹזֵל. ניסוי עצמאי אחד מוצג. נתון זה יש הבדל בין עבודה בעבר בהוצאה והודפס מחדש באישור 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: המשך טיפול עם β-אסטרדיול מקדם GBS בנרתיק התמדה. אחוז יישבו (א) או התאושש CFU (B) של עכברים CD-1 (n = 10) מחוסן עם 1 × 10 7 CFU GBS A909 ומתוחזק על טיפול β-אסטרדיול. עכברים הוזרקו β-אסטרדיול יום אחד לפני חיסון GBS וב -1 ימים, 3, ו -5 חיסון פוסט. ניסוי עצמאי אחד מוצג. השורה (ב ') מייצגת מתכוון התאוששה CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: GBS זנים נבדלים ביכולתם להתמיד בדרכי נרתיקית. CD-1 outbred עכברים (n = 10 / קבוצה) הוזרקו מנה בודדת של β-אסטרדיול יום אחד לפני חיסון GBS עם 1 × 10 7 CFU של זני GBS הנתונים. ניסויים עם כל זן בוצעו באופן עצמאי והיו חוזרים לפחות שלוש פעמים; תוצאה אחת נציג מוצגת. נתון זה יש הבדל בין עבודה בעבר בהוצאה והודפס מחדש באישור 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

pload / 54,708 / 54708fig5.jpg "/>
איור 5: עכבר זנים נבדלים ביכולת שלהן שאפשר לכבוש עם GBS בדרך נרתיקית. עכברי זני רקע מצוינים הוזרקו מנה בודדת של β-אסטרדיול יום אחד לפני החיסון עם 1 × 10 7 CFU של GBS A909. ניסויים עם כל זן בוצעו באופן עצמאי והיו חוזרים לפחות פעמיים; תוצאה אחת נציג מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: הדמיה פלורסנט של GBS בתוך בדרך נרתיקית העכבר. ויזואליזציה של GFP- להביע GBS (ירוק) לאורך אפיתל הנרתיק בהגדלה = 630X, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (א), בסמיכות endogenouים חיידקים בנרתיק בהגדלה = 1,000X, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (B). כתם כחול = DAPI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: אוספים של GBS זנים וקווים עכבר מעגל לחקר ההתיישבות בנרתיק. זני רקע GBS, קווי עכבר, ומינון של אסטרדיול β מסומנים. מחקרים שעשו שימוש במודל המתואר בעבודה זו מודגשים באפור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לקדם את קידום ההבנה של אינטראקציות GBS עם שני מארח חיידקים אחרים בהקשר של המארח, במודל חיה נדרש. עבודה זו מתארת ​​את ההיבטים הטכניים של הקמת קולוניזציה וגינלית GBS בעכברים. פרוטוקול זה משיג> 90% קולוניזציה של עכברים ללא שימוש בהרדמה לחסן חיידקים או לאסוף דגימות ספוגיות, דיכוי מערכות חיסון כדי לאפשר קולוניזציה, שטיפה-מראש נרתיק, או תוספות כדי לעבות את הבידוד. יתר על כן, מודל זה מדגים שחזור חזק, עם השתנות צנועה הבין-ניסיוני בשני אורך התמדת GBS והינטל החיידקים. תוצאות הנציגים הפגינו במחקר זה הן האוסף של ניסויים בלתי תלויים וצריכות להיות התייחסות עיצוב ניסיוני בעתיד; עם זאת, השוואה ישירה על פני זני GBS וקווי עכבר צריכה להיעשות בזהירות.

מודל זה מחק colonizati אדםעל באותה קולוניזציה GBS בנרתיק הרירית של עכברים מופיע להיות מוגבלת במערכת הרבייה. למרות התרוממות לתוך צוואר הרחם והרחם נצפתה עם מספר GBS זנים 25, עכברים אינם מציגים סימנים של תחלואה או תמותה, גם לאחר חודשים של קולוניזציה. יתר על כן, תלוי GBS זני עכבר למדו, עכברים להציג קולוניזציה וגינלית בקנה אחד או החולפת, אשר היא שימושי לחקר גורם חיידקים לארח תגובה חיסונית, בהתאמה. במודל זה, עכברים כמה להציג קולוניזציה לסירוגין; זה כרגע לא ידוע אם עכברים להיות recolonized בנקודות מאוחר יותר זמן או אם קולוניזציה נופל מתחת לגבול של זיהוי, בדרך כלל 50 עד 100 CFU, בנקודות זמן מסוימות. מן הראוי לציין כי התמסורת בין עכברים לא נצפתה כאשר יישבו ועכברים הלא יישבו הם שוכנו יחד במשך כמה שבועות (מידע לא מוצג).

שיטה זו משתמשת במדיום סלקטיבית ההפרש, זמין מסחריתעבור GBS לכמת ניטל עכבר חיידקים. GBS גדלה ככל מושבות ורודות או סגולות בהירות שנראות לעין בקלות לאחר 24 שעות של דגירה. מדיה זה הוכחה יש רגישות גבוהה לגילוי GBS בהשוואה למדיה אחרים, כולל אגר דם ובינוניים גרנדה 32, ויש בו נעשתה שימוש בשילוב עם בדיקות התלכדות חרוז לטקס כדי לאשר GBS הקליני מבודד 18. במחקר זה, מושבות ורודות או סגולות בהירות מן הלא-GBS יישבו עכברים מעולם כבר התאוששו. חלק צומח אנדוגני, בדרך כלל מיני אנטרוקוקוס, יגדל כקולוניות כחולות, וכמה מושבות תופענה לבן, אפור או ורודות חיוורת מאוד. חשוב לציין, יש לספור צלחות לאחר 18 עד 24 שעות של דגירה, כקולוניות הלא GBS עשויות לשלב הפיגמנט הוורוד אם נותרו בחממה או על benchtop לפרקי זמן ארוכים יותר. ראינו, כפי דווח 32 בעבר, כי חלק מבודד pyogenes ס תהווה מושבות ורודות על CHROMagar StrepB, אבל ג אלהolonies הם בדרך כלל קטנים יותר מאשר מושבות GBS. ס pyogenes לא בודד מן הפלורה בנרתיק אנדוגני של עכברים במחקרים אלה, אך התבוננות זו צריכה להיחשב בעבודה בעתיד.

רוב התוצאות התקבלו משורת העכבר CD-1 outbred אשר מביאה לידי ביטוי בתגובות חיסון מולדים חזקות בתוך בימים הראשונים חיסון פוסט, עם אישור בקטריאלי לאחר ברוב המכריע של עכברים 19. אחרים גם צריכים לבדוק זנים נוספים GBS ו הבחינו התמדה כבר פעמים 33,34. מאז הפיתוח של מודל זה, קבוצות אחרות החלו לפתח מודלים של עכברים דומים של קולוניזציה וגינלית GBS לבחון את ההשפעה של תגובות מארחות חיסוניות 33,35, טיפולים מונעים 36,37, והעברתי לעובר ברחם 34,38. הבדלים אלה יכולים להיות מוסברים על ידי מגוון גורמים, כולל גורמים גנטיים המשפיעים תגובות חיסוניות tהוא הרכב של צמחייה מקומית בנרתיק. ערכנו רשימה של זנים GBS וקווי העכבר בהתאמה כי נחקרו עד כה במחקרים קולוניזציה וגינלית GBS (טבלה 1). מספר מחקרים שנעשו לאחרונה עם במודלים של בעלי חיים מדגיש את עניין וחיוניותו של סוגים אלה של מודלים בתחום של מחקר בפתוגנזה GBS.

בתוך מערכת הנרתיק, חסינות רירית מוסדרת בחוזקה על ידי הורמוני סטרואידי 44, ואפילו מנה אחת של β-אסטרדיול, כמתואר במודל זה, מדאיג את התגובה החיסונית המארחת. אף על פי כן, יש תגובות חיסון מולדות חזקות בימים הראשונים של קולוניזציה GBS 19,25, דבר המצביעות על כך תגובות חיסוניות מושפעות הם לא הוכתמו. מודלים כרוכים חזרו זריקות β-אסטרדיול עשוי להאריך GBS התמדת נרתיק, כפי שמודגם במחקר זה (איור 3) ועל ידי אחרים 33. עם זאת, תגובות חיסוניות physi במערכת הרבייהology ניתן מבולבל יותר, מה שהופך את תוצאות קשות לפרש. חשוב לציין כי ההבדלים המתוארים ברחבי שונה GBS מבודדים זני עכבר במחקר זה עשויים להשתנות במהלך מודלים של ייחום מתמשך יש לחקור בעבודה בעתיד. ראוי לציין, לא בשלב ייחום ולא סרוטיפ GBS השפיע קולוניזציה וגינלית במודל חולדה 22. בנוסף, החומציות בנרתיק האדם חומצי של 3.6 עד 4.5 45 שינתה באופן דרסטי את החומציות בנרתיק murine הניטראלית יותר של 6.5 46, אשר עלול להשפיע על ביטוי גני GBS וגורם הבאים תורמים קולוניזציה. לבסוף, הפלורה בנרתיק היא יליד ברור בין בני האדם לבין עמיתיהם מודל Murine, ולעבוד בעתיד יש לבחון קולוניזציה GBS בעכברי gnotobiotic נושאת הפלורה בנרתיק אדם.

לסיכום, מחקרים אלה ביקשו לבחון גורמים המארח חיידקי השולטים קולוניזציה וגינלית GBS. בראש ובראשונה, המודל החייתי החזק, החדשני של col נרתיק GBSonization שפותח בעבודה זו יכול להיות מנוצל כדי לתאר אינטראקציות בין מאכסן חיידק מורכבת בסביבת נרתיק in vivo. המידע מתקבל המודל הזה כבר גדל מאוד את הידע של רכיבי חיסון של פונדקאי וגני GBS ספציפיים ששולטים התמדת נרתיק GBS. יתר על כן, תוצאות אלו העלו שאלות נוספות ותהיה שימושי עבור פיתוח נוסף של הרפוי רומן להגביל אימהית קולוניזציה GBS בנרתיק והחשיפה הבאה של היילוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

זיהום גיליון 117 בית ב ' GBS, מודל קולוניזציה וגינלית מודל Murine חיידקים-מארח אינטראקציה
מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter