Summary
이 프로토콜의 목적은 쥐 모델에서 인간의 B 군 연쇄상 구균 (GBS) 질 식민지를 모방하는 것입니다. 이 방법은 숙주의 면역 반응 및 GBS 질 지속성에 기여 박테리아 인자를 조사 할뿐 아니라 치료 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다.
Abstract
성인의 30 % - 연쇄상 구균 agalactiae (그룹 B 연쇄상 구균, GBS)는 인간의 위장관 10의 질 기관의 그람 양성, 증상이 식민지 개척자이다. 면역 손상 개인을 포함한 신생아, 임산부, 노인에서는 GBS 패혈증, 관절염, 폐렴과 뇌막염을 일으키는 원인이 침입 병원체로 전환 할 수 있습니다. GBS가 신생아의 선도적 인 세균성 병원체이기 때문에, 현재의 예방은 GBS 질 식민지와 GBS 양성 어머니의 후속 산기 항생제 치료를 위해 임신 후기 검사로 구성되어 있습니다. 무거운 GBS 질 부담은 신생아 질환과 식민지 모두의 위험 요인이다. 불행하게도, 거의 호스트 및 홍보 또는 질 식민지 GBS을 허용 박테리아 요인에 대한 알려져있다. 이 프로토콜은 세균 LOA를 결정하는 하나의 β-에스트라 전처리 매일 샘플링을 이용한 영구 GBS 질 집락을 설정하기위한 기술을 설명디. 그것은 더 자세한 방법은 추가 치료 또는 관심의 시약을 관리하고 질 세척 유체 및 생식 기관의 조직을 수집 할 수 있습니다. 이 마우스 모델 임신 중 모체의 질 집락을 제어하고 취약한 신생아로의 전송을 방지하기 위해 잠재적 인 치료 표적으로 이어질 질 환경 내 GBS 호스트 상호 작용의 이해를 촉진한다. 또한 여성의 질 기관에서 일반 세균 - 호스트 상호 작용에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 관심이 될 것입니다.
Introduction
연쇄상 구균 agalactiae, B 군 연쇄상 구균 (GBS)는 자주 장과 건강한 성인의 비뇨 기관에서 분리 된 캡슐, 그람 양성 세균이다. 1970 년대에, GBS는 매년 신생아 질환의 7,000의 경우 1, 감염성 신생아 사망의 주요 에이전트로 나타났다. 조기 발병 GBS 질환 (EOD)는 폐렴이나 호흡 곤란으로 발생하는 첫 번째 시간, 삶의 일에 발생하고, 종종 후기 발병 질환 (LOD) 반면, 패혈증으로 발전 몇 달 후에 계속된다 자주 균혈증과 선물 2 뇌막염으로 진행한다. 2002 년 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 GBS 양성 산모 1 늦은 임신과 분만 예방 적 항생제 (IAP)에서 GBS 질 식민지에 대한 보편적 인 검사를 권장합니다. 매년 IAP로 인해 미국에서 약 1,000가지 경우에 조기 발병 질환의 감소에도 불구하고,GBS는 조기 발병 신생아 패혈증의 주요 원인 남아 있고, 후기 발병 발생 1 영향을받지 남아있다. 자궁의 여부, 노동 동안, 또는 후기 발병의 경우, GBS에 신생아 노출 수막염, 높은 규제 혈액 -의 교차의 경우, 호스트 환경과 장벽, 면역 회피의 숫자를 통해 생존, 횡단이 필요하며, 뇌 장벽이. 신생아 내에서 이러한 악성 상호 작용의 상류는 산모의 질 기관의 초기 식민지입니다. GBS 질 식민지 비율이 12.7 %, 4의 추정 평균 속도, 선진국과 개발 도상국에서 8-18% 범위 임산부. 임신 중 질 기관의 GBS의 식민지 개별 여성 5 중 자연, 상수 간헐적 또는 일시적 일 수있다. 흥미롭게도, 모성 연령> 삼십육년은 지속적 식민지 (6)와 연결되어 있습니다. GBS 질 식민지에 대한 다양한 생물학적 및 사회 경제적 위험 요인확인되었습니다. 생물학적 요인 위장 GBS의 식민지와 장 내 유산균의 부재를 포함한다. 그러나, 인종, 비만, 위생, 성적 활동은 GBS 질 캐리지 (7)과 관련되어있다.
신생아 감염을 일으키는 악명이 있지만, GBS는 산모의 감염 모두 주 산기 및 산후의 다양한됩니다. GBS 캐리지도 질병 엔티티 9 일 수 있고, 어떤 경우에는 질염 8 제시 여성에서 증가된다. 또한, 임신 중 생식 기관의 GBS 적경은 내 양수 감염이나 융 모양 막염 (10)가 발생할 수 있습니다. 또한, 임신의 3.5 %까지로, GBS는 요로 감염이나 무증상 세균 (11)을 유발하는 방광에 배포한다. 임신 중 GBS의 세균이 분만 발열, 융 모양 막염, 조산 및 prematur의 위험 증가와 관련이막 (12)의 전자 파열. 함께 찍은, 질 기관 내에서 GBS의 존재는 여러 호스트 조직의 감염에 연결하고,이 틈새 시장에서 GBS를 제거 할 수있는 기능을 모두 산모와 신생아의 건강을 위해 필수적이다.
최근까지 자궁 경부 기관과 상호 작용 GBS 검사 작업의 대부분은 체외 세포 모델 13-15로 한정 하였다. 이러한 시험 관내 실험은 표면 단백질을 포함한 부착에 중요한 요인 세균을 밝혀냈다 같은 필리 세린 풍부 반복 (17, 18),뿐만 아니라 이성 조절 시스템 (15, 19)과의 질 상피 글로벌 전사 반응 GBS 19. 그러나, 완전히 질 관 내의 호스트 미생물 작용을 해명하기 위해 강력한 동물 모델이 필요하다. 초기 작품은 GBS가 접종 된 마우스 (20, 21)와 쥐의 질 기관에서 복구 할 수 있다는 것을 보여 <SUP> 모두 임신과 비 임신 상태에서 22. 2005 년 단기 GBS 질 집락은 24 시간 기간에 걸쳐 23 질 GBS 치료에 파지 용균 효소의 효능을 조사 생쥐에서 만들어졌다. 몇 년 후, 장기 GBS 질 식민지 마우스 모델은 GBS 지속성을 관리하는 호스트와 세균 요인을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 표면 부속 (17, 18)과 GBS 두 구성 요소 시스템 19,24 포함 정착에 기여 수많은 GBS 요인을 확인했다. 이 모델은 호스트 응답 메커니즘 19,25의 식별에 기여하고 면역 펩티드 26, 프로바이오틱스 (27) 등 여러 가지 치료 전략을 시험하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 마우스 질 관 GBS로 접종하고이어서 정착을 추적하고 추가적인 분석을 위해 샘플을 수집하기 위해 필요한 지침을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물의 작업은 샌디에고 주립 대학의 실험실 동물 관리 사무소의 승인을 받아 수의학 기준에 따라 실시 하였다. 암컷 마우스 연령 8-16주이 방법의 개발에 사용 하였다.
β-에스트라 디올의 1. 준비 및 복강 내 주사
- 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 종이의 무게에 β-에스트라 디올 (0.5 밀리그램 / 마우스)를 밖으로 측정한다. 주의 :-β 에스트라 디올은 피부 및 점막 표면을 통해 흡수 될 수있다.
- 모든 덩어리를 제거하고, β-에스트라 디올이 미세 분말 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브와 소용돌이에 β-에스트라 디올을 전송합니다. 10 ML의 주사기에 참기름 (100 μL / 마우스)를 그립니다. 0.45 μm의 필터를 사용하여 β-에스트라 디올을 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 주사기 필터 참기름. β-에스트라 디올은 참기름에 균일 한 현탁액이 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브를 소용돌이.
- β-ES를 그리기새로운 10 ML의 주사기에 tradiol 서스펜션. 18 G, 1 인으로. 바늘, 나누어지는 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기로 현탁액을 100 ㎕. 각 마우스에 대해 하나의 주사기를 준비합니다. 새로운 멸균 26 G, ½ 인을 배치합니다. 각 투베르쿨린 주사기 바늘.
- 이전 세균 접종에 각 마우스 24 시간에 참기름 (5 ㎎ / ㎖) 100 ㎕에 현탁 β-에스트라 디올의 0.5 밀리그램을 관리 할 수 있습니다. 바로 오른쪽에 하복부 사분면에서는 복강 내의 각 마우스를 주입하거나 이전 28 바와 같이, 중간 선 왼쪽.
주 : 주사 부위의 어떠한 청소 또는 클리핑이 필요하지 않습니다.
GBS 2. 질 접종
- 어느 날 이전에 접종을, 37 ° C에서 토드 휴이트 국물 (THB)에서, 같은 A909 (혈청 형 IA)와 같은 관심의 GBS 균주의 5 ml의 하룻밤 액체 문화를 성장.
- 신선한 THB로 1:10 볼륨에서 GBS 하룻밤 문화를 배양하고 37 ° C에서 품어. 성장미드 로그 상에 박테리아 (= 0.4-0.5 OD 600). 참고 : - GBS의 변형에 따라, 3 시간이 보통이 소요됩니다.
- 5 분 동안 3,000 × g에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 펠렛 박테리아에 하위 문화를 전송합니다. 뜨는을 대기음. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL의 세균 펠렛을 재현 탁.
- 새로운 5 ㎖의 배양 관에서 PBS 5 ㎖ (10 마우스 당 1 mL) 중 정확히 OD 600 = 0.4 - 재현 탁 된 펠릿을 이용하여, 3을 가져온다. 이것은 ~ 1 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ml의 농도 될 것입니다. 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송 5 분 동안 3,000 × g에서 박테리아를 재 - 펠렛. 뜨는을 대기음.
- 1/10 원래 볼륨에서 PBS의 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, OD = 0.4 (600)의 3 ml의 펠릿 되었다면, PBS 300 μL 그것을 재현 탁. 주 :이 동물 접종에 사용되는 최종 세균 현탁액 (~ 1 × 109 CFU / ㎖)이다.
- 아르 자형직렬 희석 현탁액의 50 μl를 eserve과 THB 한천에 도금하는 것은 정확한 접종을 결정합니다.
- 그 1 × 107 CFU 각 마우스에 투여되도록 최종 세균 현탁액의 10 μl를 각 마우스를 접종한다.
- , 이전에 접종 28 바와 같이, 핸들러의 엄지와 검지 후 꼬리를 고정화 사이 목 목덜미에서 느슨한 피부를 보호하여 수동으로 마우스를 억제.
- 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁으로 단계 2.6에서 제조 된 GBS의 10 μL를 그립니다. 팁을 질 루멘에 5 ~ 10 mm를 삽입하고 접종의 10 μl를 분배.
주 : 겔 로딩 팁 특히 어린이나 작은 마우스에서 장기 외상 또는 손상의 위험을 최소화하기 위해 표준 200 μL 팁 위에 바람직하다. - 즉시 접종을 다음과 같은 꼬리와 w로 마우스를 올려, 목의 목덜미를 해제하고 마우스의 뒷다리 끝을 상승~ 1 분 동안 딱딱한 표면에 전면 발 alking.
- 시각 접종의 역류에 대한 질 입구를 검사합니다. 역류가 관찰되는 경우, 새로운 피펫 팁은 루멘 내로 역류의 흡수를 용이하게 조작하거나 질구를 확대하기 위해 사용될 수있다. 또한, 역류는 피펫을 통해 흡입 될 수 있으며, 재 접종.
참고 : 국소 에이전트, 프로 바이오 틱 미생물, 또는 관심의 단백질을 투여하는 경우에는 생리적 버퍼 20 μl의 최대 볼륨은 질 기관에 제공 될 수있다.
3. GBS 부하를 정량화하기 위해 질 루멘을 보라고
- PBS 100 ㎕를 첨가하여, 마우스 당 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브를 준비한다. 그냥 보라고하기 전에, PBS에서 면봉을 사전에 젖은.
- 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제하고 질 루멘에 면봉을 10mm를 삽입합니다. 부드럽게 4 배를 시계 방향으로 면봉을 회전하고 4 시간은 질 벽에 약간의 압력을 적용, 시계 방향으로 대응.
- PBS 100 ㎕로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 면봉을 전송합니다. 도금에 앞서, 소용돌이 면봉에서 박테리아를 해제하기 15 초 ~에 대한 microcentrifuge 관. 직렬 1시 10분 1을 통해 각 PBS에서 샘플 판 희석 20 μl를 희석 : 10,000 제조업체의 지침에 따라 준비 차동 매체 아가 플레이트에. 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. GBS 식민지 색상에 밝은 분홍색 또는 자주색를 나타납니다. 다른 내생 식물을 억제 할 것, 또는 파란색, 흰색, 회색 식민지로 표시됩니다.
4. 수집 질 세척 유체
- 단계 2.7.1에서 설명한대로 마우스를 억제. 200 ㎕를 겔로드 피펫 팁, 피펫 질 루멘에 PBS의 20 μl를 사용. 부드럽게 루멘 내에서 전체 볼륨 위아래로 4 회 피펫, 다음 같은 피펫 팁의 전체 볼륨을 철회. 주 : 세척액이 점액 두꺼운 경우 표준 200 μL 피펫 팁최종 세정액을 수집하는데 사용될 수있다.
- 사이토킨 분석 CFU 또는 정량 용 세정액을 저장하는 경우에 0.7 ml의 마이크로 원심 관에 분주. 발정기의 단계를 결정하는 경우, 유리 슬라이드 상에 세정액의 적어도 5 μL를 분배하고 광학 현미경에서 100 배의 배율 하에서 세포를 관찰한다. 참고 : 발정 단계의 예를 들어, 그림 1을 참조하십시오.
5. 조직의 해부 및 균질화
- 각 마우스의 경우, 세 개의 2-ML 스크류 캡 튜브 (: 질, 자궁 경부, 자궁 각 조직에 대해 하나)을 준비합니다. 튜브의 원뿔 모양의 바닥을 커버 - (0.5 g 0.4) 1.0 mm 지르코니아 비드 충분한 각 튜브를 입력합니다.
- 세균 부하를 정량화 특히 121 ° C에서 30 분 동안 조직을 수집하기 전에 준비된 튜브 압력솥. 각 튜브에 멸균 PBS 500 μl를 추가합니다. 복구 조직의 무게를 계산하기 위해 나중에 참조 할 수 있도록 고압 증기 멸균 기록 후 각 튜브의 무게.
- 70 % EtOH로 가위를 소독 필요한 경우 깨끗이 닦아, 두 자궁 뿔 자궁 몸과 난소 사이의 중간 길이를 잘라. 가위와 집게, 별도의 내장 지방, 멤브레인, 멀리 생식 기관에서 방광을 사용하여, 꼬리 쪽 이동.
- 단계 5.4에 설명 된대로 가위를 소독. 횡 방향으로 몸에서 생식 기관을 분리 가능한 외음부에 가깝게 질을 잘라. 들어 올려 그대로 생식 기관을 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
- 새 면도날을 사용하여, 하나의 가로 절단에 자궁 경부에서 자궁을 분리합니다. 70 %로 면도날 소독다음의 EtOH, 그리고 하나의 가로 컷의 질에서 자궁 경부를 구분합니다. 참고 : 아직 자궁 경부에 연결된 자궁 조직의 최소한있을 것이다. 아직 자궁 경부에 부착 된 질 조직의 최소한있을 것이다.
- 무균 핀셋을 사용하여, 각각의 2 ㎖의 튜브를 함유하는 PBS와 구슬 균질화로 각 조직 옮긴다. 각 조직을 처리하는 사이에 70 % EtOH로 집게를 청소합니다.
- 각각 2 ㎖의 스크류 캡 튜브의 무게를 측정하고, 조직의 무게를 결정하기 위해 관의 원래 중량을 뺀다. 100 mg의 - 조직의 무게는 일반적으로 20 사이를 다릅니다. 단단히 스크류 캡 튜브를 밀봉하고 조직 균질 기에서 최대 속도에서 1 분 동안 조직을 균질화.
- 10,000 차동 매체 아가 플레이트에 : 세균 부하를 정량화하기 위해 직렬로 조직 균질 및 플레이트 희석 1시 10분 1을 통해 25 μl를 희석. 단계 3.3에 설명 된대로 번호판을 품어. 에서 조직 균질 동결, 사이토 카인의 정량 샘플을 저장하려면 -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 모델의 개발 과정에서 여러 관찰 GBS 질 정착 기간에 영향을주는 요인에 관한 하였다. 접종에 미치는 영향 GBS 세균의 지속성에 얼마나 발정 단계를 결정하려면, 마우스는 질 세척 유체를 통해 접종의 날에 개최되었다. 도 1에 의해 결정된대로 마우스 발정주기의 네 단계를 도시 습식 마운트 질 세정액, 잘 확립 된 방법 (29). 마우스는 초기 단계에 기초하여 그룹으로 분할하고, GBS 지속성 질 보라고 통해 시간 동안 모니터링 하였다. 발정 단계에서 접종 한 마우스는 발정의 다른 단계, 접종 시간 (그림 2)에서 diestrus에서 특히보다 더 GBS와 식민지가되었다. 이러한 결과에 기초하여, 현재의 모델에서, 마우스는 발정 단계로 동기화하기 전날 GBS로 접종-β 에스트라 디올로 처리된다. 생식 요로 감염의 다른 쥐 모델은 마우스가 외생 에스트라 디올 처리 (30, 31)를 통해 발정 단계에서 유지 될 때 지속 할 수있는 병원성 미생물의 증가 능력을 증명하고있다. 이 현상은 또한 GBS와 질 식민지 동안 발생하는지 확인하려면, GBS 지속성을 반복 β-에스트라 디올 치료 중 모니터링 하였다. 지속 발정은 90 % 식민지 후 접종 (그림 3A) 이주로, CD-1 마우스에서 GBS A909 (미국 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC # 1 BAA-1138) 지속성을 촉진. 접종 이전에 β-에스트라 디올의 일 투여 량 전형적인 실험에서, 쥐의 40~50%는 일주일 후 접종 (그림 4) 식민지가되었다. GBS CFU이 쥐에서 발견 평균은 식민지의 비율 (그림 3B)를 모방. 이러한 결과는 독립적 인 실험, 이러한 데이터는 악마로부터 얻은되었지만연속 발정기를 유지하는 CD-1 마우스의 대다수 GBS 질 지속성을 촉진한다는 대한 실례.
GBS 균주 다른 인간을 사용하여 정착 실험을 실시하지만,이 균주는 수일에서 개월 이후에 이르기까지, CD-1 마우스에서 유지하는 능력으로 변화하는 것이 관찰되었다. 균주 테스트 중, NCTC 84분의 10 최단 기간, A909를 가지고 있었고, 변형 CJB111는 (데이터가 도시하지 않음)도 한 달 이상 두 주 (그림 4)와 생쥐의 대부분에 지속 반면 COH1는 1 ~ 2 주 동안 지속 . 현재까지 혈청 형 마우스 질 기관에 지속 할 수있는 능력의 더 관찰 된 상관 관계가 없었다; 그러나, 개인 GBS 균주 사이에 유의 한 차이가 25을보고되었다. 여러 근친 및 이계 마우스 선 정착하는 GBS의 능력은 또한 조사 하였다. GBS 변형 A909은 이계 CD-1에서 약 1 주일의 질 기관에 지속마우스와 근친 FVB 마우스 (그림 5). 대안 적으로, 근친 BALB / C 및 C57BL / 6의 대부분 1 주 (도 5)에서 식민 한 달 또는 (데이터 미도시)를 넘어 식민 유지 하였다.
이 프로토콜을 이용하여 생체 내에서 GBS 질 집락은 플라스미드 GFP 발현 GBS 균주로 접종 마우스 형광 현미경 조직을 수집하여 시각화 하였다. GFP-GBS는 모두 질 상피 (그림 6A)와 다른 나라의 질 식물 (그림 6B)에 근접을 뮤린에 부착 검출되었다. 어떠한 GFP 신호는 조직 수집시 GFP-GBS를 클리어 한 마우스에서는 검출되지 않았다 (데이터는 보이지 않음).
그림 1 : 흠 쥐 질 세척 유체에서 발정의 스테이지를 확인. (A) 발정 전기 : 풍부한 핵 편평 상피 세포 (검은 색 화살표). (B) 발정 : 풍부한 각질화 된 편평 상피 세포 (파란색 화살표). (C) Metestrus : 핵 및 각질화 된 편평 상피 세포의 혼합물 주로 백혈구 (회색 화살표). (D) Diestrus : 풍부한 백혈구. 배율 = 100X, 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : GBS의 발정 단계에 미치는 영향 질 지속성. CD-1 마우스의 비율은 시간이 지남에 1 × 10 7 CFU GBS의 A909과 식민지. 질 세척에 의해 결정되는 GBS 접종시 발정 단계에 기초하여 - (11 / 그룹, N = 7) 마우스는 그룹화 된 유동체. 하나의 독립적 인 실험이 표시됩니다. 이 그림은 이전에 게시 된 작업에서 수정 된 허가 19 재 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : β-에스트라 디올과 계속 치료는 GBS 질 지속성을 촉진. 식민 비율 (A) 또는 CFU 1 × 107 CFU A909 GBS로 접종하고-β 에스트라 디올 처리에 유지 CD-1 마우스 (N = 10)의 (B)을 회수. 마우스는 일일 사전 GBS 접종과 일 1, 3 β-에스트라 디올을 주사하고, 5 후 접종 하였다. 하나의 독립적 인 실험이 표시됩니다. (B)의 라인은 CFU 복구 의미 나타냅니다. 708fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : GBS 균주가 질 요로에 지속하는 능력에 차이가 있습니다. 이계 CD-1 마우스 (N = 10 / 그룹) 지정된 GBS 균주의 1 × 10 7 CFU로 일일 사전 GBS 접종에 β-에스트라 디올의 단일 용량으로 주입 하였다. 각 균주 실험은 독립적으로 수행하고, 적어도 3 회 반복 하였다; 하나의 대표적인 결과가 표시됩니다. 이 그림은 이전에 게시 된 작업에서 수정 된 허가 25 재 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PLOAD / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
그림 5 : 마우스 균주는 그들의 능력에 차이가 질 요로에 GBS 집락합니다. 표시된 배경 균주에서 마우스는 1 × 10 7 CFU GBS의 A909과 일일 전에 접종에 β-에스트라 디올의 단일 용량으로 주입 하였다. 각 균주 실험은 독립적으로 수행하고, 두 번 이상 반복 하였다; 하나의 대표적인 결과가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 마우스 질 요로 내에서 GBS의 형광 이미징. 배율 질 상피 따라 GBS (녹색)를 표현 GFP-의 시각화 = 630X, 스케일 바는 50 μm의 (A) 및 근접 endogenou하기 =배율의 질 미생물 = 1000 배 = 20 μm의 (B) 규모의 바. 블루 얼룩 = DAPI. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 질 식민 연구를 위해 활용 GBS 균주와 마우스 라인의 편집. GBS 배경 균주, 마우스 선, β-에스트라 디올의 용량이 표시됩니다. 이 작품에 설명 된 모델을 이용하여 연구는 회색으로 강조 표시됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
호스트의 컨텍스트 내의 호스트 및 다른 미생물 모두 GBS 상호 작용의 이해의 발전을 촉진하기 위해 동물 모델이 요구된다. 이 작품은 생쥐에서 GBS 질 식민지를 확립의 기술적 측면에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 박테리아를 접종하거나 접종을 두껍게, 질 미리 세척, 또는 첨가제 식민지 수 있도록 면봉 샘플, 면역 억제제를 수집하기 위해 마취제를 사용하지 않고 마우스의> 90 % 식민지를 달성한다. 또한,이 모델은 GBS 지속성의 길이와 세균 부담이 모두 겸손 간 실험적인 변화와 강력한 재현성을 보여줍니다. 이 연구에서 입증 대표 결과는 독립적 인 실험의 컴파일하고 미래의 실험 설계에 대한 참조해야한다; 그러나 GBS 균주 및 마우스 선에 걸쳐 직접 비교주의해야한다.
이 모델은 인간의 colonizati을 모방쥐의 점막 질 GBS의 식민지에서의 생식 기관에 제한 될 것으로 보인다. 자궁 경부와 자궁에 승천 여러 GBS 25 균주 관찰되었지만, 마우스도 식민지의 달 후에, 이환율이나 사망률의 흔적을 표시하지 않습니다. 또한, GBS에 따라 마우스 변종 공부, 마우스는 세균 요인을 공부하고 각각 면역 반응을 호스팅하는 데 유용 일치 또는 과도 질 식민지를 표시합니다. 이 모델에서, 일부 마우스는 간헐적으로 식민지를 표시; 생쥐 이후 시점에서 recolonized되고 있는지, 현재 알려지지 않은 또는 정착 특정 시점에서 통상적으로 50 내지 100 CFU로 검출 한계, 아래로 떨어지면. 식민 비 식민 마우스 함께 몇 주 동안 보관시 참고로 마우스 간의 전송이 관찰되지 않았다 (데이터는 보이지 않음).
이 방법은 시판 선택 및 차등 매체를 사용하여GBS는 마우스 세균 부담을 정량화하기 위해. GBS는 배양 24 시간 후 쉽게 볼 수 있습니다 밝은 분홍색 또는 자주색 식민지를 성장한다. 이 매체는 혈액 한천 그라나다 매체 (32)를 포함하는 다른 매체와 비교 GBS를 검출하는 고감도를 갖도록 도시되었으며, 임상 GBS 18 분리 확인 라텍스 비드 응집 시험과 함께 사용되어왔다. 본 연구에서는 비 GBS에서 밝은 분홍색 또는 자주색 식민지 쥐가 회복 된 적이없는 식민지. 일부 내생 식물, 일반적으로 엔테로 종, 블루 식민지로 성장할 것입니다, 일부 식민지, 흰색, 회색, 또는 아주 옅은 분홍색 나타납니다. 중요한 것은, 플레이트를 인큐베이터에 이상 기간 동안 벤치 탑에 남아있는 경우가 아닌 GBS의 식민지가 분홍색 안료를 통합 할 수 있으므로, 배양 18 ~ 24 시간 후에 계산되어야한다. 우리는 이전에 32보고 된 일부 S. pyogenes의의 분리가 CHROMagar StrepB에 분홍색 식민지를 형성하는 것, 관찰,하지만 한 다음 다olonies는 GBS의 식민지보다 일반적으로 작다. S. pyogenes의 이러한 연구에서 쥐의 내생 질 식물로부터 격리되지 않았지만 이러한 관찰은 향후 연구에서 고려되어야한다.
결과의 대부분은 마우스 (19)의 대부분의 세균 후속 간극과, 제 며칠 후 접종 강력한 선천성 면역 반응을 보여 이계 CD-1 마우스 선에서 얻어졌다. 기타도 추가 GBS 균주를 테스트 한 긴 지속 시간을 33, 34을 관찰했다. 이 모델을 개발하기 때문에, 다른 그룹에서는 자궁 34,38 태아 숙주 면역 반응을 33, 35, 36, 37 예방 요법 및 송신의 영향을 검토 GBS 질 정착 유사한 쥐 모델을 개발하기 시작 하였다. 이러한 차이는 t와 면역 반응에 영향을 유전 적 결정을 포함한 다양한 요인에 의해 설명 될 수있다기본 질 식물 그는 조성물. 우리는 GBS 질 식민지 연구 (표 1)에서 현재까지 연구 된 GBS 균주 각각의 마우스 라인의 목록을 편집했습니다. 동물 모델에 대한 최근 연구의 수는 GBS 병인 연구의 시야 내에서의 모델의 이러한 종류의 관심과 필요성을 강조한다.
질 기관 내 점막 면역 단단히이 모델에서 설명한 바와 같이, 숙주 면역 반응을 교란시키고, 스테로이드 호르몬 (44), 및 β-에스트라 디올 하나도 투여에 의해 조절된다. 그럼에도 불구하고, 영향을받는 면역 반응이 크게 손상되지 것을 건의 GBS의 식민지 19,25의 처음 몇 일 내에 강력한 선천성 면역 반응이있다. 이 연구 (그림 3)과 다른 사람 (33)에 의해 입증 된 바와 같이, GBS에게 질 지속성을 연장 할 수있다 β-에스트라 디올 주사를 반복 것을 포함 모델. 그러나, 면역 반응 및 생식 기관의 풍모ology 더 해석 결과가 어렵게 혼동 될 수있다. 중요한 것은, 다른 GBS에서 설명한 차이는 분리하고이 연구에서 마우스 변종이 지속적으로 발정의 모델 중 변경 될 수 있으며, 향후 연구에서 조사되어야한다. 참고로, 발정 단계도 GBS 혈청 형 모두는 쥐 모델 (22)의 질 식민지 영향을. 또한, 3.6 45 4.5의 인간 산성 질 pH는 크게 GBS 유전자 발현 및 정착에 기여 연속적인 요인에 영향을 미칠 수있는 6.5 (46)의 더 중립적 인 쥐의 질 산도, 다르다. 마지막으로, 네이티브 질 식물은 인간의 질 식물을 들고 무균 쥐에서 GBS 집락을 조사한다 인간과 쥐 모델 대응 및 향후 연구 사이의 구별된다.
요약하면,이 연구는 GBS 질 식민지를 관리 호스트 및 세균성 요인을 조사하기 위해 노력했다. 주로, GBS 질 COL의 강력하고 혁신적인 동물 모델본 연구에서 개발 onization은 생체 내 환경에서 복잡한 질의 호스트 미생물의 상호 작용을 설명하는 데 이용 될 수있다. 이 모델로부터 얻어진 정보는 이미 크게 숙주 면역 성분 및 GBS 질 지속성을 제어 GBS 특정 유전자의 지식을 증가했다. 또한, 이러한 결과는 추가 질문을 제기하고 새로운 치료법의 발전은 산모의 GBS 질 식민지와 신생아의 후속 노출을 제한하는 데 도움이 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sesame oil | Sigma Aldrich | S3547-250ML | |
| β-Estradiol | Sigma Aldrich | E8875-1G | CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. |
| 200 μl gel loading pipette tips | USA Scientific | 1252-0610 | |
| Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs | Puritan | 25-801 A 50 | |
| CHROMagar StrepB | DRG International | SB282 | |
| Todd Hewitt Broth | Hardy Diagnostics | 7161C | |
| 18 G, 1.5 inch needles | BD | 305199 | |
| 26 G, 0.5 inch needles | BD | 305111 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 1 ml syringes | BD | 309659 | |
| 0.45 μm PVDF syringe filters | Whatman | 6900-2504 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | 21-031-CV |
References
- Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
- Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
- Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
- Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
- Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
- Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
- Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
- Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
- Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
- Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
- Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
- Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
- Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
- Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
- Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
- Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
- Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
- Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
- Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
- Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
- Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
- Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
- Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
- Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
- Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
- Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
- Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
- Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
- Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
- Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
- Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
- Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
- Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
- Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
- Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
- Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
- Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
- Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
- Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
- Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).
