Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ניתוח של SCAP Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54709

Summary

אנו מתארים שיטה שונה לבידוד שבריר קרום מתאי אדם הכנת מדגם לצורך זיהוי של -glycosylation SCAP N ו- חלבון הכולל באמצעות כתם מערבי. בנוסף, אנו מציגים שיטה GFP תיוג לפקח סחר SCAP באמצעות מיקרוסקופ confocal. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדות ביולוגיה קבועות.

Introduction

דה-רגולציה של מטבוליזם שומנים הוא מאפיין נפוץ של מחלות הסרטן ומטבוליות 1-6. בתהליכים אלו, חלבונים קושרי אלמנט מווסת sterol (SREBPs), משפחה של גורמי שעתוק, לשחק תפקיד קריטי שליטה על הביטוי של גנים חשובים עבור ספיגת וסינתזה של כולסטרול, חומצות שומן, פוספוליפידים 7-10.

SREBPs, כולל-1a SREBP, SREBP-1c, ו SREBP-2, מסונתזים כמו מבשרי פעיל אשר נקלטות על ידי reticulum endoplasmic (ER) קרום מכוח שני תחומים הטרנסממברני 7. N-הסופי של SREBPs מכיל תחום ה- DNA מחייבת עבור transactivation של גני המטרה 11. C- הסופית של מבשרי SREBP נקשר חלבון הפעלת מחשוף SREBP (SCAP) 12,13, חלבון הממברנה polytopic זה ממלא תפקיד חיוני בהסדרת יציבות SREBP והפעלה 14-16.

implemenשינוע של פונקציה תעתיק דורש טרנסלוקציה של המתחם SCAP / SREBP מ ER אל Golgi, שבו שני פרוטאזות ברצף לבקע SREBP ולשחרר שבר N- מסוף שלה, אשר לאחר מכן נכנס לתוך הגרעין עבור transactivation של גנים lipogenic 7. בתהליכים אלו, רמות של סטרולים בממברנה ER לשלוט היציאה של המתחם SCAP / SREBP מ ER 7,17. בתנאים sterol גבוהה, sterol נקשר SCAP או ER-תושב-induced אינסולין הגן חלבון-1 (Insig-1) או -2 (Insig-2), שיפור איגוד SCAP עם Insigs כי לשמר את מורכבות SCAP / SREBP ב ER 18-20. כאשר רמות sterol להקטין, SCAP מנתק עם Insigs. זה מוביל לשינוי קונפורמציה SCAP, המאפשר אינטראקציה SCAP עם חלבונים המעיל משותף (COP) מורכב השנייה. המתחם מתווכת שילוב של המתחם SCAP / SREBP לתוך שלפוחית ניצני ומפנה והובלתו מ ER אל Golgi 21,22. עם translocation אל Golgi, SREBPs הם ביקע ברצף ידי אתר-1 ו אתר-2 פרוטאזות, שמוביל את שחרורו של N הסופית- 7,23-29.

חלבון SCAP נושאת שלוש N -linked אוליגוסכרידים ב asparagine (N) ממקם N263, N590, N641 ו 15. אנו חשפנו לאחרונה כי בתיווך גלוקוז N -glycosylation של SCAP באתרים אלה הוא תנאי מוקדם לסחר SCAP / SREBP מ ER אל Golgi בתנאי sterol נמוכים 30-32. הפסד של glycosylation SCAP באמצעות מוטציה של כל שלושת asparagine כדי גלוטמין (NNN ל QQQ) משבית את הסחר של המתחם SCAP / SREBP ותוצאות חוסר היציבות של החלבון SCAP והפחתת SREBP הפעלה 31. הנתונים האחרונים שלנו הוכיחו SREBP-1 מופעלת מאוד גליובלסטומה והוא מווסת על ידי SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. מיקוד איתות SCAP / SREBP-1 מתגלה כאסטרטגיה חדשה לטיפול בממאירויות ו- s מטבוליתyndromes 1,3,35-38. לכן, חשוב לפתח שיטה יעילה לנתח את חלבון SCAP ו- N -glycosylation הרמות ולפקח הסחר שלה בתאים אנושיים ורקמות חולות.

האזור luminal של חלבון SCAP (חומצות אמינו 540-707) בחדר המיון מכיל שני אתרים -glycosylation N (N590 ו- N641) כי מוגנים מפני proteolysis כאשר קרומים שלמים מטופלים עם טריפסין 15. יש שבר לומינל זה משקל מולקולרי של ~ 30 kDa כי הוא קטן מספיק כדי לאפשר את הרזולוציה של וריאנטים glycosylated הפרט של SCAP ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) 15,31. כאן, אנו מספקים שיטה לגילוי N -glycosylation של SCAP ואת החלבון הכולל בתאים אנושיים. פרוטוקול זה נגזר השיטה המתוארת בפרסומים ממעבדת בראון וגולדשטיין 15 והפרסום האחרון שלנו 31. הפרוטוקול ניתן להשתמש tהוא ללמוד חלבון SCAP מתאי יונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איתור של אנדוגני SCAP חלבון בתאים אנושיים

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. זרע ~ 1 × 10 6 תאים U87 בצלחת 10 ס"מ עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 5% נסיוב עוברי שור (FBS) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות לפני הטיפול.
    2. שטפו תאי פעם עם פוספט שנאגר מלוח (PBS), ולאחר מכן לעבור לתאי DMEM בינוני טרי עם או בלי סוכר (5 מ"מ) במשך 12 שעות.
  2. הכנת שברי קרום תא גרעיני תמציות
    1. שטפו תאים פעם עם PBS, לגרד לתוך 1 מ"ל PBS, צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
    2. Resuspend תאים חיץ קר כקרח המכיל 10 מ"מ HEPES-KOH (pH 7.6), 10 KCl מ"מ, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic נתרן (EDTA), 1 מ"מ חומצה נתרן אתילן גליקול tetraacetic (EGTA), 250 מ"מ סוכרוז, ותערובת של מעכבי פרוטאז (5 μg / ml pepstatin A, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​leupeptin, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 0.5 מ"מ (PMSF), 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), ו -25 מיקרוגרם / מ"ל ​​N- אצטיל-Leu-Leu-Norleu-אל (ALLN)) למשך 30 דקות על קרח.
    3. לעבור תמציות התא דרך x 22 G 1 1/2 30 פעמים צנטריפוגות המחט 890 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לבודד גרעינים.
    4. השתמש supernatant להפרדת שברי קרום (שלב 1.2.7). Resuspend גלולה גרעיני 0.1 מ"ל של חיץ C (20 HEPES מ"מ / KOH pH 7.6, 0.42 M NaCl, 2.5% (v / v) גליצרול, 1.5 מ"מ MgCl 2, EDTA נתרן 1 מ"מ, EGTA נתרן 1 מ"מ ו תערובת של מעכבי פרוטאז (5 מיקרוגרם / מ"ל ​​pepstatin A, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​leupeptin, 0.5 מ"מ PMSF, 1 מ"מ DTT, ו -25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ALLN)).
    5. סובב את ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ו צנטריפוגות ב 20,000 XG ב microcentrifuge למשך 20 דקות ב 4 ° C. Supernatant הוא יועד "תמציות גרעיניות".
    6. מחמם את התמציות הגרעיניות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם חיץ טעינת 5x (312.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 50% גליצרול, 12.5% ​​β-mercaptoethanol, ו 0.05% bromophenol כחול) לפני העמדת כדי SDS-PAGE.
    7. צנטריפוגה supernatant מן ספין 890 XG המקורי ב -20,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. לניתוח כתם המערבי לאחר מכן, לפזר את גלולה ב 0.1 מ"ל של חיץ תמוגה SDS (10 mM Tris-HCl pH 6.8, 100 מ"מ NaCl, 1% (v / v) סולפט dodecyl נתרן (SDS), EDTA נתרן 1 מ"מ, ו 1 מ"מ נתרן EGTA). זה מיועד "שבריר קרום".
      הערה: אנו משתמשים 20,000 XG במשך 20 דקות עד גלולת ממברנות. XG 100,000 למשך 10 - 20 דקות נוצל בעבר בעיתונים מהמעבדה בראון וגולדשטיין 15.
    8. דגירת שבר הקרום על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולקבוע את ריכוז החלבון על ידי השיטה ברדפורד. הוסף 1 פתרון כחול μl 100x bromophenol לפני העמדת את דגימות SDS-PAGE.
    9. טען 25 - 50 מיקרוגרם של חלבונים בממברנה הכולל על ג'ל 10% SDS-PAGE 39. הרץ את הג'לב 80 V במשך 15 דקות, ולאחר מכן השנה ל -130 V ולרוץ 115 דקות אחרות. העבר ב 140 מילי-אמפר עבור 130 דקות 39.
      1. לניתוח המערבי סופג, השתמש נוגדן אנטי SCAP כדי לזהות את החלבון SCAP הכולל. השתמש איזומראז דיסולפיד חלבון (PDI), חלבון ER-תושב 40, בקרה פנימית. השתמש נוגדן אנטי SREBP-1 כדי לאתר את הלהקה N-terminal של SREBP-1. השתמש Lamin כמשוואה בקרה פנימית על תמציות גרעיני 31.

2. ניתוח של SCAP N -glycosylation בתאים אנושיים

  1. תרבית תאים, Transfection, וטיפול
    1. לניתוח קרום, זרעי ~ 1 × 10 6 תאים HEK293T בצלחת 10 ס"מ עם DMEM בתוספת FBS 5% ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות לפני transfection.
    2. לדלל 4 - 8 מיקרוגרם פלסמיד GFP-SCAP (מתנה ד"ר פיטר Espenshade) 22 מ"ל 1 מופחת בינוני סרום ומערבבים בעדינות.
    3. הוסף 8 - 16 μl מגיב transfection DNA על ידי pipetting ישירות לתוך 1 מ"ל מופחת בינוני סרום המכיל פלסמידים ומערבבים בעדינות.
    4. דגירה מורכב מגיב transfection / פלסמיד במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. להוסיף מורכבות transfection אל התאים עם מדיום חדש ולהמשיך תרבות עבור 24 שעות ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
    6. שטפי פעם עם PBS ולטפל התאים במשך 12 שעות עם או בלי סוכר (5 מ"מ) בנוכחות או בהעדר tunicamycin (1 מיקרוגרם / מ"ל), מעכב -glycosylation N.
  2. כן כדורי קרום תא כמתואר בשלבים 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, ו 1.2.7.
  3. איתור של SCAP N -glycosylation
    1. טריפסין Proteolysis
      1. Resuspend את כדורי קרום מתאי overexpressing GFP-SCAP ב 114 μl של חיץ המכיל 10 HEPES מ"מ · KOH (pH 7.4), 10 מ"מ KCl, 1.5 2 מ"מ MgCl, 1 mM EDTA נתרן, ו -100 מ"מ NaCl.
      2. דגירה 57aliquots l של חלבונים בממברנה בהעדר או בנוכחות 1 μl של טריפסין (1 מיקרוגרם / μl), בהיקף כולל של 58 μl, למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס; 81.
      3. עצור תגובות על ידי תוספת של 2 μl (400 יחידות) של מעכבי טריפסין סויה.
    2. Deglycosylation ידי Peptide- N- glycosidase F (PNGase F)
      1. לקבלת טיפול עוקב עם PNGase F, להוסיף 10 μl של תמיסה המכילה 3.5% (wt / כרך) SDS ו -7% (כרך / כרך) 2-mercaptoethanol מדגם זה.
      2. לאחר חימום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ברצף להוסיף 7 μl של 0.5 M פוספט נתרן (pH 7.5), 7 μl של 10% (v / v) Nonidet P-40 עם 12 × מעכבי פרוטאזות, ו -2 μl (0.5 U / μl) של PNGase פ
      3. לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, להפסיק התגובות על ידי תוספת של חיץ טעינת 5x (312.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 50% גליצרול, 12.5% ​​β-mercaptoethanol, ו 0.05% bromophenol כחול). מחמם את התערובות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 מ 'ב ובכפוף SDS-PAGE. מיקרוגרם טען 25-50 של חלבונים בממברנה הכולל על ג'ל 10% SDS-PAGE 39. הפעל את הג'ל על 80 V במשך 15 דקות, ולאחר מכן שנה ל -130 V עבור 115 דקות אחרות. העבר ב 140 מילי-אמפר עבור 130 דקות.
      4. עבור כתם המערבי, השתמש 10 מיקרוגרם / מ"ל אנטי SCAP (9D5) נוגדן לזהות N -glycosylation וחלבון SCAP הכולל.

3. איתור של סחר SCAP מ ER אל Golgi ידי שימוש GFP-SCAP בתאים אנושיים

  1. זרע 2.5 × 10 5 תאים U87 בצלחת 60 מ"מ עם DMEM בתוספת 5 FBS% ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות לפני transfection.
  2. לדלל 4 מיקרוגרם פלסמיד GFP-SCAP ב 0.5 מ"ל בינוני סרום מופחת ומערבבים.
  3. הוסף מגיב transfection DNA 8 μl ידי pipetting ישירות לתוך 0.5 מ"ל בינוני סרום מופחת המכילים פלסמידים ומערבבים בעדינות.
  4. דגירה מורכבת / פלסמיד מגיב transfection במשך 25 דקות ב חדרטֶמפֶּרָטוּרָה.
  5. להוסיף מורכבות transfection אל התאים עם מדיום חדש ולהמשיך תרבות עבור 24 שעות ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
  6. Reseed 5 - 10 × 10 4 תאים לתוך צלחת 6-היטב המכיל תלוש כיסוי זכוכית (22 מ"מ × 22 מ"מ) ולהמשיך תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  7. שטפי פעם עם PBS ולטפל התאים במשך 12 שעות עם או בלי סוכר (5 מ"מ) בנוכחות או בהעדר tunicamycin (1 מיקרוגרם / מ"ל).
  8. שטפו תאים פעם עם PBS ולתקן בפורמלין 4% למשך 10 דקות.
  9. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS, להפוך את coverslips, הר בשקופיות יחד עם antifade מגיב, ולאטום את coverslips באמצעות לק.
  10. בדוק את סחר GFP-SCAP באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 63X מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


איור 1 מציג את זיהוי של חלבון SCAP אנדוגני SREBP-1 טופס גרעין בתאי U87 גליובלסטומה אדם בתגובה לגלוקוזה גירוי באמצעות כתם מערבי. SCAP חלבון הממברנה מזוהה "שבריר קרום". צורת הגרעין (N-terminal) של SREBP-1 מזוהית "תמציות גרעיניות". רמת חלבון SCAP (PDI משמש בקרה פנימית של חלבונים בממברנה ER) ו SREBP-1 טופס גרעיני משופרות במידה ניכרת על ידי גירוי גלוקוז. תוצאות אלו מראות כי הפרוטוקול הוא מסוגל לזהות את חלבון SCAP אנדוגני בתאים אנושיים.


איור 2 מציג את ניתוח -glycosylation SCAP N ורמות חלבון ה- GFP-SCAP הכולל בתגובה לגלוקוזה גירוי וטיפול tunicamycin בתאים HEK293T להביע SCAP אוגר GFP שכותרתו. איור N -glycosylation. שבר של SCAP המכיל aa 540 - 707, הממוקם בתוך לולאה 6 th לומינל בחדר המיון, הוא טריפסין עמידים 15 והוא משמש לניתוח של N -glycosylation באתרים N590 ו- N641. כפי שניתן לראות בתרשים 2B (הפאנל העליון), לאחר טריפסין טיפול, להקות משקל גבוה יותר (המכיל aa 540 - 707) מצביעים חלבון SCAP המכיל אחד או שניים N -linked אוליגוסכרידים (N590 ו- N641) בנוכחות גלוקוז בהעדר PNGase או tunicamycin (זוהה על ידי נוגדן IgG-9D5). בנוכחות PNGase F, אוליגוסכרידים N-linked הוסרו מן החלבון SCAP, גרימת שבר (aa 540 - 707) לנוע מהר יותר SDS-PAGE. באופן עקבי, חוסם את התהליך ייזום N -glycosylation ידי tunicamycin ביטל לחלוטין -glycosylation SCAP N, מצוין על ידי הופעתו של התחתוןהלהקה של שבר SCAP (תרשים 2B, הפאנל העליון). יתר על כן, חלבון ה- GFP-SCAP הכולל (זוהה על ידי נוגדן כנגד GFP) הופחת בהעדר גלוקוז או באמצעות טיפול tunicamycin (תרשים 2B, הפאנל התחתון). תוצאות אלו מראות כי הפרוטוקול הוא מתאים לניתוח של -glycosylation SCAP N.


איור 3 מראה כי ה- GFP-SCAP סחר מ ER אל Golgi בתגובה לגלוקוזה גירוי דוכא על ידי טיפול tunicamycin בתאים U87. כפי שניתן לראות באיור 3 א, תמונות מיקרוסקופיה confocal מראים כי חלבון ה- GFP-SCAP מתגורר בחדר המיון בהעדר גלוקוז, כפי שמוצג על ידי שיתוף לוקליזציה שלה עם PDI, חלבון ER-תושב (אדום). לעומת זאת, בנוכחות גלוקוז, GFP-SCAP עוברת Golgi, שמוצג על ידי שיתוף לוקליזציה עם סמן חלבון Golgi Giantin (אדום) (איור 3 ב). יתר על כן, tunicamycinטיפול מורחק סחר-induced גלוקוז של GFP-SCAP מ ER אל Golgi (איור 3 א 'וב').

איור 1
באיור 1. איתור של אנדוגני SCAP חלבון SREBP-1 גרעיני טופס בתאי U87. ניתוח כתם המערבי של קרום ותמציות גרעיניות מתאי U87 גליובלסטומה אדם מן המעלה הראשונה בתרבית סרום ללא מדיה עם או בלי סוכר (5 מ"מ) במשך 12 שעות. Anti-SCAP נוגדנים נגד aa SCAP האדם 450 - 500 שימש כדי לזהות את SCAP אנדוגני בתאים אנושיים. הצורה הפעילה (N-terminal) של SREBP-1 מזוהה "תמציות גרעיני" באמצעות נוגדן נגד aa 301 - 407 שבר של SREBP-1 אדם. דמות זו שונתה באישור 31. אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדולעל של נתון זה.

איור 2
איור 2. ניתוח המערבי כתם של SCAP N -glycosylation ו- GFP-SCAP רמות החלבון. א) תרשים סכמטי המציג את פורש מבנה SCAP לחצות את קרום ER. ישנם שלוש asparagine (N) שאריות SCAP, שכולן מתגוררות לומן ER והם שונים על ידי אוליגוסכרידים צמודים N. שהבר של חומצות אמינו המכיל SCAP 540-707 הוא עמיד בפני עיכול טריפסין. הוא מכיל שני הדירים שינוי oligosaccharide N-linked, N590 ו N641, אשר יכול להיות מזוהים על ידי נוגדן IgG-9D5 נגד aa 540 - 707 של אוגר SCAP ידי כתם המערבי ב) ניתוח כתם המערבי של SCAP N -glycosylation (העליון:. עם הטיפול טריפסין) או רמות חלבון ה- GFP-SCAP (נמוך: ללא טיפול טריפסין) מתאי HEK293T טרנסiently transfected עם GFP-SCAP למשך 24 שעות ולאחר מכן בתרבית סרום ללא מדיה עם או בלי סוכר (5 מ"מ) בנוכחות או בהעדר tunicamycin (1 מיקרוגרם / מ"ל), מעכב N -glycosylation, במשך 12 שעות. המספרים בצד השמאל של הכתם לציין את מספר אתרי -glycosylation N על חלבון SCAP (אתרי N590 ו- N641) (עליון, זוהה על ידי נוגדן IgG-9D5). הפאנל התחתון של ה- GFP-SCAP זוהה על ידי נוגדן נגד חלבון ה- GFP. דמות זו שונתה באישור 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתור של סחר SCAP מ ER אל Golgi. A, B) תמונות מיקרוסקופיה Confocal מראים כי GFP-SCAP מתגורר בחדר המיון או מעביר ל- tהוא Golgi בהעדר או נוכחות של גלוקוז (5 מ"מ) עם / בלי tunicamycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) טיפול בתאי U87 במשך 12 שעות. PDI תערוכות ER מכתים (אדום) (א). Giantin, סמן Golgi (אדום) (B). DAPI (כחול) מכתים את גרעין התא. ברי הסולם מייצגים 10 מיקרומטר. איור 3 א נתונים חדשים ולא פורסם מעולם. איור 3B שונה באישור 31. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור הבידוד של שברי קרום בתאים אנושיים וכן הם אחראים לעריכה של הדגימות לצורך זיהוי של -glycosylation SCAP N ו- חלבון הכולל באמצעות כתם מערבי. בנוסף, אנו מספקים שיטה לפקח סחר SCAP באמצעות GFP-תיוג מיקרוסקופיה confocal. השיטה משמשת במיוחד כדי לנתח את חלבון קרום והוא מהווה כלי חשוב לחקור SCAP N -glycosylation וסחר.

בהשוואה לשיטה באמצעות לקטינים שונים להכיר שרשרות N -glycan שונות ולזהות N חלבוני -glycosylated 42, בשיטה שלנו המתואר כאן משתמשת PNGase F להסיר צמודי חלבון N -glycan ומזהה משמרת ההגירה לזהות את glycosylation של מקטעי חלבון SCAP aa 540-707. המגבלה של השיטה לקטינים תלויה בזיהוי הסוג של לקטינים הראוי להכיר הפרט N -glycosylation. יתר על כן, השיטה יכולה להיות מיושמת גם לנתח SCAP N -glycosylation ורמת חלבון בחולים אנושיים או ברקמות בעלי חיים לאחר המגון 2. המחקר שלנו מספק כלי חדש כדי לנתח את החתימה של מטבוליזם השומנים במחלות סרטן מטבולית.

במחקר זה, פלסמיד SCAP GFP שכותרתו המשמש ניתוח של N -glycosylation וסחר בתאים אנושיים-מוצא אוגר. SCAP נוגדנים (IgG-9D5) שתועלה נגד חומצות אמינו 540-707 שבר של חלבון SCAP יכול רק לזהות את החלבון N -glycosylation של אוגר SCAP, כגון בתוך השחלות אוגר סיני (CHO) תא קו 15. הנוגדן נגד חומצות אמינו 450 - 500 SCAP האדם הוא מסוגל לזהות את החלבון SCAP אנדוגני בתאים אנושיים, כפי שמוצג באיור 1 כדי לזהות SCAP N -glyco.sylation בתאים או ברקמות אנושיות, אנחנו צריכים לפתח נוגדנים ספציפיים נגד חומצות אמינו 540 - 707 שבר SCAP האדם. בנוסף, זיהוי של לקטינים ספציפיים להכיר נכנס SCAP N -glycan הוא דרך חלופית כדי לנתח SCAP אדם N -glycosylation 42. יתר על כן, הגדרת הרכב ומבנה של כל שרשרת N -glycan מחייב SCAP (N263, N590 ו N641) יקל הבנתנו את המנגנון הבסיסי של סחר SCAP מ ER אל Golgi.

יתר על כן, כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור זיהוי של -glycosylation SCAP N, כווננו כמה פרמטרי תגובה על פי תנאי הניסוי שלנו, אשר שונים מן השיטות שתוארו בפרסומים מן בראון וגולדשטיין מעבדת 15. כדי לזהות SCAP חלבון בהצלחה שלה N -glycosylation, איכות שברי הקרום והתמציות גרעיניות חשובה מאוד. אנחנו ישירות קבענו את ריכוז החלבון לאחר שברי הקרום וטופחו על 37 מעלות צלזיוס, הימנעות לשים את הדוגמת לראש על קרח. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת באופן נרחב בתחומים שונים של מחקר, כוללים סרטן, מחלות לב וכלי דם, סוכרת, והשמנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
  2. Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
  3. Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
  4. Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
  5. Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
  6. Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
  7. Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
  8. Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
  9. Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
  10. Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
  11. Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
  12. Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
  13. Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
  14. Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
  15. Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
  16. Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
  17. Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
  18. Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
  19. Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
  20. Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
  21. Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
  22. Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
  23. Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
  24. Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
  25. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
  26. Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
  27. Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
  28. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
  29. Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
  30. Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
  31. Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
  32. Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
  33. Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
  34. Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
  35. Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
  36. Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
  37. Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
  38. Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
  39. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  40. Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
  41. Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
  42. Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 117 SCAP, SREBPs reticulum endoplasmic חלבון הממברנה סינתזת שומנים
ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, More

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter