Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analys av SCAP doi: 10.3791/54709 Published: November 8, 2016

Summary

Vi beskriver en modifierad metod för membranfraktion isolering från humana celler och provberedningen för detektion av SCAP N -glycosylation och totalt protein genom användning av western blöt. Vi introducerar ytterligare en GFP-märkningsmetod för att övervaka SCAP handel med hjälp av konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan användas i vanliga biologiska laboratorier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Avreglering av lipidmetabolismen är en gemensam egenskap av cancer och ämnesomsättningssjukdomar 1-6. I dessa processer, sterol reglerande element bindande proteiner (SREBPs), en familj av transkriptionsfaktorer, spelar en avgörande roll i att kontrollera uttrycket av gener som är viktiga för upptag och syntes av kolesterol, fettsyror och fosfolipider 7-10.

SREBPs, inklusive SREBP-1a, SREBP-1c, och SREBP-2, syntetiseras som inaktiva prekursorer som binder till det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet i kraft av två transmembrandomäner 7. N-terminalen av SREBPs innehåller en DNA-bindande domän för transaktiveringen av målgener 11. C-terminalen av SREBP prekursorer binder till SREBP klyvning-aktiverande protein (SCAP) 12,13, en polytopic membranprotein som spelar en central roll i regleringen av SREBP stabilitet och aktivering 14-16.

den genomföranförandet av transkriptions funktion kräver translokationen av POFK / SREBP komplexet från ER till Golgi, där två proteaser sekventiellt klyva SREBP och släppa sin N-terminal fragment, som sedan går in i kärnan för transaktiveringen av lipogen gener 7. I dessa processer, nivåerna av steroler i ER-membranet styra utloppet från POFK / SREBP komplexet från ER 7,17. Under höga sterol förhållanden binder sterol till SCAP eller ER-bosatt insulin-inducerad gen protein-1 (Insig-1) eller -2 (Insig-2), öka associationen av SCAP med Insigs som bibehåller POFK / SREBP komplex i ER 18-20. När sterol-nivån, SCAP dissocierar med Insigs. Detta leder till en POFK konformationsförändring, vilket gör att SCAP interaktion med vanliga höljeproteiner (COP) Il-komplexet. Komplexet förmedlar införlivandet av POFK / SREBP komplex i spirande blåsor och riktar sin transport från ER till Golgi 21,22. upon translocation till Golgi, är SREBPs sekventiellt klyvs av Site-1 och Site-2-proteaser, vilket leder till frisättning av N-terminalen 7,23-29.

SCAP protein bär tre N-kopplade oligosackarider vid asparagin (N) positioner N263, N590 och N641 15. Vi visade nyligen att glukos-medierad N -glycosylation av SCAP i dessa platser är en förutsättning för SCAP / SREBP trafficking från ER till Golgi vid låga sterol förhållanden 30-32. Förlust av SCAP glykosylering via mutation av alla tre asparagin till glutamin (NNN att qqq) inaktiverar handel av POFK / SREBP komplex och resulterar i instabilitet SCAP protein och minskning av SREBP aktivering 31. Våra senaste uppgifterna visar också att SREBP-1 är mycket aktivt i glioblastom och regleras av SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Inriktning SCAP / SREBP-1-signalering framstår som en ny strategi för att behandla maligniteter och metaboliska syndromes 1,3,35-38. Därför är det viktigt att utveckla en effektiv metod för att analysera SCAP protein och N -glycosylation nivåer och övervaka handel med mänskliga celler och patientvävnader.

Den luminala regionen SCAP protein (aminosyror 540-707) i ER innehåller två N -glycosylation platser (N590 och N641) som är skyddade från proteolys när intakta membran behandlas med trypsin 15. Denna luminal fragmentet har en molekylvikt av ~ 30 kDa som är tillräckligt liten för att medge upplösning av individuella glykosylerade varianter av SCAP genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) 15,31. Här ger vi en metod för att detektera N -glycosylation av SCAP och totalt protein i humana celler. Detta protokoll kommer från den metod som beskrivs i publikationer från Brown och Goldstein laboratorium 15 och vår senaste publikation 31. Protokollet kan användas i than studie av SCAP protein från däggdjursceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Detektion av endogen SCAP protein i humana celler

  1. Cell Culture och behandling
    1. Utsäde ~ 1 × 10 6 U87-celler i en 10 cm skål med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS) och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 h före behandling.
    2. Tvätta cellerna en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), sedan växla cellerna till färskt DMEM-medium med eller utan glukos (5 mM) under 12 h.
  2. Framställning av cellmembranfraktioner och kärnextrakt
    1. Tvätta cellerna en gång med PBS, skrapa in i en ml PBS och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
    2. Resuspendera cellerna i en iskall buffert innehållande 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1 mM natrium etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), 250 mM sackaros, och en blandning av proteasinhibitorer (5 μg / ml pepstatin A, 10 ^ g / ml leupeptin, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT), och 25 | ig / ml N-acetyl-Leu-Leu-norLeu-al (AllN)) under 30 min på is.
    3. Passera cellextrakt genom en 22 G x 1 1/2 nål 30 gånger och centrifugera vid 890 xg vid 4 ° C under 5 minuter för att isolera kärnor.
    4. Använd supernatanten för separation av membranfraktioner (steg 1.2.7). Resuspendera den nukleära pelleten i 0,1 ml buffert C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (volym / volym) glycerol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, 1 mM natrium EGTA och en blandning av proteashämmare (5 | j, g / ml pepstatin A, 10 ^ g / ml leupeptin, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT och 25 ^ g / ml AllN)).
    5. Rotera suspensionen vid 4 ° C under 60 minuter och centrifugera vid 20000 xg i en mikrocentrifug under 20 minuter vid 4 ° C. Supernatanten betecknas som "nukleära extrakt".
    6. Värm de nukleära extrakten vid 100 ° C under 10 min med 5x laddningsbuffert (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-merkaptoetanol och 0,05% bromfenolblått) innan de utsätts för SDS-PAGE.
    7. Centrifugera supernatanten från den ursprungliga 890 xg centrifugering vid 20.000 xg under 20 min vid 4 ° C. För efterföljande western blot-analys, lös pelleten i 0,1 ml SDS-lys-buffert (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (volym / volym) natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM natrium-EDTA, och ett mM natrium EGTA). Detta betecknas "membranfraktion".
      OBS: Vi använder 20.000 xg under 20 minuter för att pelletera membran. 100.000 xg under 10 - 20 min har använts i tidningarna från Brown och Goldstein laboratorium 15.
    8. Inkubera membranfraktionen vid 37 ° C under 30 min och bestämma proteinkoncentrationen genom Bradford-proteinanalys. Lägg ett pl 100x bromofenolblått lösning innan man utsätter proven för SDS-PAGE.
    9. Belastning 25-50 pg av totala membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kör gelenvid 80 V under 15 minuter, sedan ändras till 130 V och köra för en annan 115 min. Transfer vid 140 mA under 130 min 39.
      1. För Western blotting analys, använda anti-SCAP antikropp för att detektera den totala SCAP proteinet. Använd proteindisulfidisomeras (PDI), en ER-bosatt protein 40, som en intern kontroll. Använda anti-SREBP-1 antikropp för att detektera den N-terminala band av SREBP-1. Använd Lamin A som en intern kontroll för kärnextrakt 31.

2. Analys av SCAP N -glycosylation i humana celler

  1. Cell Culture, transfektion och behandling
    1. För membrananalys, frö ~ 1 × 10 6 HEK293T celler i en 10 cm skålen med DMEM kompletterat med 5% FBS och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 h före transfektion.
    2. Späd 4-8 ug GFP-SCAP plasmid (en gåva från Dr. Peter Espenshade) 22 i 1 ml minskade serummedium och blanda försiktigt.
    3. Lägg 8-16 pl DNA-transfektion reagens genom att pipettera direkt i 1 ml reducerade serummedium innehållande plasmider och blanda försiktigt.
    4. Inkubera transfektionsreagens / plasmid-komplexet i 25 minuter vid rumstemperatur.
    5. Lägg transfektion komplexet till cellerna med färskt medium och fortsätta att odling under 24 h vid 5% CO2 och 37 ° C.
    6. Tvätta en gång med PBS och behandla cellerna under 12 h med eller utan glukos (5 mM) i närvaro eller frånvaro av tunikamycin (1 | ig / ml), en N -glycosylation inhibitor.
  2. Förbered cellmembranpellets som beskrivs i steg 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 och 1.2.7.
  3. Detektering av SCAP N -glycosylation
    1. trypsin Proteolys
      1. Resuspendera membranpellets från celler som överuttrycker GFP-SCAP i 114 | il buffert innehållande 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, och 100 mM NaCl.
      2. Inkubera 5781; l alikvoter av membranproteiner i frånvaro eller närvaro av 1 | il trypsin (1 | ig / | il), i en total volym av 58 | j, l, under 30 minuter vid 30 ° C.
      3. Stoppa reaktionerna genom tillsättning av 2 pl (400 enheter) av trypsininhibitor från sojaböna.
    2. Deglykosylering av peptid- N- glykosidas F (PNGas F)
      1. För efterföljande behandling med PNGase F, tillsätt 10 | il lösning innehållande 3,5% (vikt / volym) SDS och 7% (vol / vol) 2-merkaptoetanol till varje prov.
      2. Efter upphettning vid 100 ° C under 10 min, sekventiellt lägga 7 pl av 0,5 M natriumfosfat (pH 7,5), 7 | il av 10% (volym / volym) Nonidet P-40 med 12 × proteashämmare och 2 pl (0,5 U / l) av PNGas F.
      3. Efter inkubation vid 37 ° C under 3 h, stopp reaktioner genom tillsats av 5x laddningsbuffert (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-merkaptoetanol och 0,05% bromfenolblått). Värma blandningarna vid 100 ° C under 10 mi och omfattas SDS-PAGE. Belastning 25-50 pg av totala membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kör gelen vid 80 V under 15 minuter, sedan ändras till 130 V för ytterligare 115 min. Transfer vid 140 mA under 130 minuter.
      4. För Western blöt, använda 10 mikrogram / ml anti-SCAP (9D5) antikropp för att detektera N -glycosylation och total SCAP protein.

3. Detektion av SCAP Trafficking från ER till Golgi med hjälp GFP-SCAP i humana celler

  1. Seed 2,5 x 10 5 U87-celler i en 60 mm skål med DMEM kompletterat med 5% FBS och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 h före transfektion.
  2. Späd 4 ug GFP-SCAP plasmid i 0,5 ml reducerad serummedium och blanda.
  3. Tillsätt 8 l DNA transfektion reagens genom att pipettera direkt i 0,5 ml reducerad serummedium innehållande plasmider och blanda försiktigt.
  4. Inkubera transfektionsreagens / plasmid-komplexet under 25 minuter vid rumstemperatur.
  5. Lägg transfektion komplexet till cellerna med färskt medium och fortsätta att odling under 24 h vid 5% CO2 och 37 ° C.
  6. Reseed 5-10 x 10 4-celler i en 6-brunnsplatta innehållande en glastäckglas (22 mm x 22 mm) och fortsätta att odling vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar.
  7. Tvätta en gång med PBS och behandla cellerna under 12 h med eller utan glukos (5 mM) i närvaro eller frånvaro av tunikamycin (1 | j, g / ml).
  8. Tvätta cellerna en gång med PBS och fixa i 4% formaldehyd under 10 min.
  9. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, invertera täck, montera på diabilder tillsammans med antifade reagens, och försegla täck använder nagellack.
  10. Kontrollera GFP-SCAP handel med hjälp av en 63x oljeimmersion mål i en laserskanning konfokalmikroskop 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here


Figur 1 visar detektion av endogena SCAP protein och SREBP-1 kärn form i humana glioblastom U87-celler som svar på glukos stimulering med hjälp av western blöt. Membranproteinet SCAP detekteras i "membranfraktionen". Kärnan formen (N-terminal) av SREBP-1 detekteras i "kärnextrakt". Nivån på SCAP protein (PDI fungerar som en intern kontroll av ER membranproteiner) och SREBP-1 kärnform markant förbättras genom glukosstimulering. Dessa resultat visar att protokollet kan upptäcka den endogena SCAP protein i mänskliga celler.


Figur 2 visar en analys av SCAP N -glycosylation och total GFP-SCAP proteinnivåer som svar på glukos stimulans och tunikamycin behandling i HEK293T-celler som uttrycker GFP-märkta hamster POFK. Figur N -glycosylation platser. Fragmentet av SCAP innehållande aa 540-707, som ligger i 6: e luminala slinga i ER är trypsin beständigt 15 och används för analys av N -glycosylation på platserna N590 och N641. Såsom visas i figur 2B (övre panel), efter trypsinbehandling, de högre viktsgrupper (innehållande aa 540-707) indikerar SCAP protein innehållande en eller två N-kopplade oligosackarider (N590 och N641) i närvaro av glukos och frånvaro av PNGas eller tunikamycin (detekteras av IgG-9D5-antikropp). I närvaro av PNGas F, N-länkade oligosackarider avlägsnas från SCAP proteinet, vilket gör att fragmentet (aa 540-707) för att gå snabbare i SDS-PAGE. Konsekvent blockerar -glycosylation initieringsprocessen N genom tunikamycin helt avskaffade SCAP N -glycosylation, vilket indikeras av uppkomsten av en lägreband av SCAP fragment (figur 2B, övre panelen). Dessutom var total GFP-SCAP protein (detekteras av en antikropp mot GFP) reduceras i frånvaro av glukos eller via tunikamycin-behandling (Figur 2B, lägre panelen). Dessa resultat visar att protokollet är lämplig för analys av SCAP N -glycosylation.


Figur 3 visar att GFP-SCAP trafficking från ER till Golgi som svar på glukos stimulering undertrycktes genom tunikamycin behandling i U87-celler. Som visas i figur 3A, konfokalmikroskopi bilder visar att GFP-SCAP protein finns i ER i frånvaro av glukos, vilket framgår av dess samlokalisering med PDI, en ER-bosatt protein (röd). Däremot i närvaro av glukos, GFP-SCAP flyttas till Golgi, som visas med samlokaliseringen med Golgi proteinmarkör Giantin (röd) (figur 3B). Dessutom tunikamycinbehandling tryckas glukosinducerad trafficking av GFP-SCAP från ER till Golgi (Figur 3A och B).

Figur 1
Figur 1. Detektion av Endogenous SCAP Protein och SREBP-1 Nuclear Form i U87-celler. Western blot-analys av membranet och nukleära extrakt från humana primära glioblastom U87-celler odlade i serumfria medier med eller utan glukos (5 mM) under 12 h. Anti-SCAP antikropp mot humant SCAP aa 450-500 användes för att detektera den endogena SCAP i humana celler. Den aktiva formen (N-terminal) av SREBP-1 detekteras i "kärnextrakt" med antikropp mot aa 301-407 fragment av humant SREBP-1. Denna siffra har modifierats med tillstånd från 31. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.

figur 2
Figur 2. Western blot-analys av SCAP N -glycosylation och GFP-SCAP proteinnivåer. A) Schematiskt diagram som visar SCAP strukturen spänner korsa ER-membranet. Det finns tre asparagin (N) rester i SCAP, som alla bor i ER lumen och modifieras av N-länkade oligosackarider. Fragmentet av SCAP innehållande aminosyror 540-707 är resistent mot trypsin digestion. Den innehåller två N-länkad oligosackarid modifieringssvinstian, N590 och N641, som kan detekteras av IgG-9D5 antikropp mot aa 540-707 av hamster POFK genom western blot-B) Western blot-analys av SCAP N -glycosylation (övre:. Med trypsin behandling) eller GFP-SCAP proteinnivåer (lägre: ingen trypsin behandling) från HEK293T celler transiently transfekterade med GFP-SCAP under 24 timmar och odlades sedan i serumfritt medium med eller utan glukos (5 mM) i närvaro eller frånvaro av tunikamycin (1 | ig / ml), en N -glycosylation inhibitor, under 12 h. Siffrorna på vänster sida av blot anger antalet N -glycosylation platser på SCAP protein (N590 och N641 platser) (övre, detekteras av IgG-9D5-antikropp). Undre panelen för GFP-SCAP upptäcktes av en antikropp mot GFP-proteinet. Denna siffra har modifierats med tillstånd från 31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Detektering av SCAP Trafficking från ER till Golgi. A, B) konfokalmikroskopi bilder visar att GFP-SCAP bosatt i ER eller flyttar till than Golgi i frånvaro eller närvaro av glukos (5 mM) med / utan tunikamycin (1 | j, g / ml) behandling i U87-celler under 12 h. PDI visar ER-färgning (röd) (A). Giantin, Golgi markör (röd) (B). DAPI (blå) färgar cellkärnan. Skal staplarna representerar 10 um. Figur 3A är nya data och har inte publicerats tidigare. Figur 3B har modifierats med tillstånd från 31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denna studie beskriver vi ett protokoll för isolering av membranfraktioner i mänskliga celler och för beredning av prover för detektion av SCAP N -glycosylation och totalt protein genom Western blöt. Vi tillhandahåller ytterligare en metod för att övervaka SCAP handel med GFP-märkning och konfokalmikroskopi. Metoden används särskilt för att analysera membranprotein och är ett viktigt verktyg för att undersöka SCAP N -glycosylation och trafficking.

Jämfört med metoden med olika lektiner att känna igen olika N-glykan kedjor och identifiera N -glycosylated proteiner 42, vår metod som beskrivs här använder PNGas F för att ta bort proteinbunden N-glykan och detekterar migration skift för att identifiera glykosyleringen av SCAP proteinfragment aa 540-707. Begränsningen av den lektin-metoden är beroende av identifieringen av lämplig typ av lektin för att känna igen den specifika N -glycosylation. Vidare kan metoden även tillämpas för att analysera SCAP N -glycosylation och proteinnivå i humana patienter eller djurvävnader efter homogenisering 2. Vår studie ger ett nytt verktyg för att analysera undertecknandet av lipidmetabolismen i cancer och ämnesomsättningssjukdomar.

I denna studie, är plasmiden av GFP-märkt SCAP används för analys av N -glycosylation och människoceller hamster-ursprung. SCAP antikropp (IgG-9D5) som höjs mot aminosyrorna 540-707 fragment av SCAP protein kan bara detektera proteinet och N -glycosylation av hamster SCAP, såsom i kinesisk hamster äggstocks (CHO) cellinje 15. Antikroppen mot aminosyrorna 450-500 av humant SCAP är i stånd att detektera endogent SCAP protein i humana celler, såsom visas i figur 1 För att detektera SCAP N -glyco.sylation i mänskliga celler eller vävnader, måste vi utveckla en specifik antikropp mot aminosyrorna 540-707 fragment av humant POFK. Dessutom att identifiera en specifik lektin erkänna SCAP bundna N-glykan är ett alternativt sätt att analysera människors SCAP N -glycosylation 42. Dessutom definierar sammansättning och struktur av varje N-glykan kedja bindande SCAP (N263, N590 och N641) kommer att underlätta vår förståelse av den underliggande mekanismen för SCAP trafficking från ER till Golgi.

För att erhålla de bästa resultaten för detektion av SCAP N -glycosylation, vi justerat vissa reaktionsparametrar enligt våra experimentella betingelser, som är modifierade från de metoder som beskrivs i publikationer från Brown och Goldstein Laboratory 15. Framgångsrikt skall kunna upptäcka SCAP protein och dess N -glycosylation, kvaliteten på membranfraktioner och nukleära extrakt är mycket viktiga. Vi bestäms direkt proteinkoncentrationen efter membranfraktioner inkuberades vid 37 ° C, utan att belasta provet tillbaka på is. Den metod som beskrivs här kan i stor utsträckning för olika forskningsområden, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar, diabetes och fetma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
  2. Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
  3. Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
  4. Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 12932-12937 (2009).
  5. Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
  6. Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
  7. Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
  8. Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
  9. Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
  10. Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
  11. Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
  12. Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
  13. Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
  14. Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
  15. Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
  16. Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
  17. Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
  18. Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
  19. Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
  20. Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
  21. Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
  22. Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
  23. Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
  24. Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
  25. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
  26. Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
  27. Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
  28. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
  29. Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
  30. Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
  31. Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
  32. Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
  33. Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
  34. Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
  35. Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
  36. Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
  37. Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. (2016).
  38. Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. (2016).
  39. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). (2012).
  40. Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
  41. Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
  42. Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
Analys av SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Och handel med mänskliga celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).More

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter