Summary
Vi beskriver en modificeret fremgangsmåde til membranfraktion isoleret fra humane celler og prøveforberedelse til påvisning af SCAP N -glycosylation og totalt protein ved hjælp af Western blot. Vi yderligere indføre en metode GFP-mærkning for at overvåge SCAP menneskehandel hjælp konfokal mikroskopi. Denne protokol kan bruges i almindelige biologiske laboratorier.
Introduction
Deregulering af lipid metabolisme er et fælles kendetegn for kræft og metaboliske sygdomme 1-6. I disse processer sterol regulatorisk element-bindende proteiner (SREBPs), en familie af transkriptionsfaktorer, spiller en kritisk rolle i at kontrollere ekspressionen af gener vigtige for indførelsen og syntesen af cholesterol, fedtsyrer og phospholipider 7-10.
SREBPs, herunder SREBP-1a, SREBP-1c, og SREBP-2, syntetiseres som inaktive forstadier, der binder til det endoplasmatiske reticulum (ER) membran i kraft af to transmembrandomæner 7. N-terminalen af SREBPs indeholder et DNA-bindende domæne for transaktivering af målgener 11. Den C-terminale ende af SREBP forstadier bindes til SREBP spaltning-aktiverende protein (SCAP) 12,13, en polytopic membran protein, der spiller en central rolle i reguleringen af SREBP stabilitet og aktivering 14-16.
Den gennemførelførelsen af transkriptionel funktion kræver translokation af SCAP / SREBP kompleks fra ER til Golgi, hvor to proteaser sekventielt spalte SREBP og frigive dets N-terminalt fragment, som derefter træder ind i kernen for transaktivering af lipogene gener 7. I disse processer niveauerne af steroler i ER-membranen styre afgangen fra SCAP / SREBP kompleks fra ER 7,17. Under høje sterol betingelser, sterol binder til SCAP eller ER-resident insulin-induceret gen-protein-1 (INSIG-1) eller -2 (INSIG-2), øge associeringen af SCAP med Insigs der bevarer SCAP / SREBP kompleks i ER 18-20. Når sterol niveauet falder, SCAP dissocieres med Insigs. Dette fører til en SCAP konformationel ændring, som tillader SCAP interaktion med fælles kappeproteiner (COP) II-komplekset. Komplekset medierer inkorporeringen af SCAP / SREBP kompleks i den spirende vesikler og dirigerer sin transport fra ER til Golgi 21,22. Ved translocation til Golgi, er SREBPs sekventielt spaltes af anlægsområde 1 og site-2 proteaser, hvilket fører til frigivelse af N-terminalen 7,23-29.
SCAP protein bærer tre N-forbundet oligosaccharider på asparagin (N) positioner N263, N590, og N641 15. Vi viste for nylig, at glucose-medieret N -glycosylation af SCAP i disse steder er en forudsætning for SCAP / SREBP handel fra ER til Golgi under lave sterol betingelser 30-32. Tab af SCAP glykosylering via mutation af alle tre asparagin til glutamin (NNN til QQQ) deaktiverer handelen med det SCAP / SREBP kompleks og resulterer i ustabilitet SCAP protein og reduktion af SREBP aktivering 31. Vores seneste data viser også, at SREBP-1 er stærkt aktiveret i glioblastom og reguleret af SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Målretning SCAP / SREBP-1 signalering fremstår som en ny strategi til at behandle maligniteter og metaboliske syndromes 1,3,35-38. Derfor er det vigtigt at udvikle en effektiv metode til at analysere SCAP protein og N -glycosylation niveauer, og overvåge dens handel med humane celler og patientens væv.
Den luminale region SCAP protein (aminosyrer 540-707) i ER indeholder to N -glycosylation steder (N590 og N641), der er beskyttet mod proteolyse når intakte membraner behandles med trypsin 15. Denne luminale fragmentet har en molekylvægt på ~ 30 kDa, der er lille nok til at tillade opløsningen af individuelle glycosylerede varianter af SCAP ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) 15,31. Her giver vi en metode til at påvise N -glycosylation af SCAP og det totale protein i humane celler. Denne protokol er afledt af den beskrevet i publikationer fra Brown og Goldstein laboratorium 15 og vores nylige publikation 31-metoden. Protokollen kan bruges i than studerer af SCAP protein fra pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Påvisning af endogene SCAP protein i humane celler
- Celledyrkning og behandling
- Frø ~ 1 × 10 6 U87-celler i en 10 cm skål med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS) og inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før behandling.
- Vask cellerne én gang med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter skifte celler til frisk DMEM-medium med eller uden glucose (5 mM) i 12 timer.
- Fremstilling af Cell membranfraktioner og kerneekstrakter
- Vask cellerne én gang med PBS, skrabe i 1 ml PBS, og der centrifugeres ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender celler i et is-kold buffer indeholdende 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1 mM natrium-ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 250 mM sucrose, og en blanding af proteaseinhibitorer (5 μg / ml pepstatin A, 10 ug / ml leupeptin, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT), og 25 ug / ml N-acetyl-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) i 30 minutter på is.
- Passere celleekstrakter gennem en 22 G x 1 1/2 nål 30 gange, og centrifuger ved 890 xg ved 4 ° C i 5 minutter for at isolere kerner.
- Brug supernatanten til separation af membranfraktioner (trin 1.2.7). Resuspender nukleare pellet i 0,1 ml puffer C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (vol / vol) glycerol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, 1 mM natrium EGTA og en blanding af proteasehæmmere (5 ug / ml pepstatin A, 10 ug / ml leupeptin, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT og 25 pg / ml ALLN)).
- Drej suspensionen ved 4 ° C i 60 minutter og centrifugeres ved 20.000 xg i en mikrocentrifuge i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten betegnes som "kerneekstrakter".
- Varm kerneekstrakterne ved 100 ° C i 10 minutter med 5 x påsætningsbuffer (312,5 mM Tris-HCI pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol og 0,05% bromphenolblåt) før den udsættes for SDS-PAGE.
- Centrifugeres supernatanten fra den oprindelige 890 xg centrifugering ved 20.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Til efterfølgende Western blot-analyse, pellet opløses i 0,1 ml SDS lysis buffer (10 mM Tris-HCI pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM natrium-EDTA, og 1 mM natrium EGTA). Dette betegnes "membranfraktion".
BEMÆRK: Vi bruger 20.000 xg i 20 min til pelletering membraner. 100.000 xg i 10 - 20 min har været anvendt i aviserne fra Brown og Goldstein laboratorium 15. - Inkuber membranfraktionen ved 37 ° C i 30 minutter og bestemme den proteinkoncentration ved Bradford-proteinassay. Tilsæt 1 pi 100x bromphenolblåt opløsning før den udsættes prøverne for SDS-PAGE.
- Load 25 - 50 ug af total membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kør gelenved 80 V i 15 min, derefter skifte til 130 V og køre i yderligere 115 min. Transfer ved 140 mA for 130 min 39.
- Til Western blotting-analyse, bruge anti-SCAP antistof til påvisning af det samlede SCAP protein. Brug protein (PDI), en ER-resident protein 40, som en intern kontrol. Bruge anti-SREBP-1-antistof til påvisning af N-terminale bånd af SREBP-1. Brug Lamin A som en intern kontrol for kerneekstrakter 31.
2. Analyse af SCAP N -glycosylation i humane celler
- Cell Culture, transfektion, og behandling
- For membran analyse, frø ~ 1 × 10 6 HEK293T celler i en 10 cm skål med DMEM suppleret med 5% FBS og inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før transfektion.
- Fortynd 4-8 ug GFP-SCAP plasmid (en gave fra Dr. Peter Espenshade) 22 i 1 ml reduceret serum medium og bland forsigtigt.
- Tilføj 8-16 pi DNA transfektionsreagens ved pipettering direkte ind i 1 ml reduceret serum medium, der indeholder plasmider og bland forsigtigt.
- Inkubér transfektionsreagens / plasmid-kompleks i 25 min ved stuetemperatur.
- Tilføj transfektion kompleks til cellerne med frisk medium og fortsætte til kultur i 24 timer ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Der vaskes én gang med PBS og behandle cellerne i 12 timer med eller uden glucose (5 mM) i nærvær eller fravær af tunicamycin (1 ug / ml), en N -glycosylation inhibitor.
- Forbered cellemembran pellets som beskrevet i trin 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, og 1.2.7.
- Påvisning af SCAP N -glycosylation
- Trypsin Proteolyse
- Resuspendere membranpellets fra celler, der overudtrykker GFP-SCAP i 114 pi puffer indeholdende 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, og 100 mM NaCl.
- inkuber 5781; l portioner af membranproteiner i fravær eller nærvær af 1 pi trypsin (1 pg / pl) i et samlet volumen på 58 pi, i 30 minutter ved 30 ° C.
- Stop reaktionerne ved tilsætning af 2 pi (400 enheder) af sojabønnetrypsininhibitor.
- Deglycosylering af peptid- N- glycosidase F (PNGase F)
- Henblik på efterfølgende behandling med PNGase F, tilsættes 10 pi opløsning indeholdende 3,5% (vægt / volumen) SDS og 7% (vol / vol) 2-mercaptoethanol til hver prøve.
- Efter opvarmning ved 100 ° C i 10 min, sekventielt tilsættes 7 pi 0,5 M natriumphosphat (pH 7,5), 7 pi 10% (v / v) Nonidet P-40 med 12 × proteasehæmmere, og 2 pi (0,5 U / pl) af PNGase F.
- Efter inkubation ved 37 ° C i 3 timer, stop reaktioner ved tilsætning af 5x loading buffer (312,5 mM Tris-HCI pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol og 0,05% bromphenolblåt). Varm blandingerne ved 100 ° C i 10 mi og med forbehold af SDS-PAGE. Belastning 25-50 ug totalt membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kør gelen ved 80 V i 15 min, derefter skifte til 130 V i yderligere 115 min. Transfer ved 140 mA for 130 min.
- For Western blot bruge 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) antistof til at detektere N -glycosylation og total SCAP protein.
- Trypsin Proteolyse
3. Påvisning af SCAP Trafficking fra ER til Golgi ved hjælp GFP-SCAP i humane celler
- Seed 2,5 x 10 5 U87 celler i en 60 mm skål med DMEM suppleret med 5% FBS og inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før transfektion.
- Fortynd 4 pg GFP-SCAP plasmid i 0,5 ml reduceret serum medium og blandes.
- Tilføj 8 pi DNA transfektionsreagens ved pipettering direkte ind i 0,5 ml reduceret serum medium, der indeholder plasmider og bland forsigtigt.
- Inkubér transfektionsreagens / plasmid-kompleks i 25 min ved stuetemperatur.
- Tilføj transfektion kompleks til cellerne med frisk medium og fortsætte til kultur i 24 timer ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Reseed 5 - 10 x 10 4 celler i en 6-brønds plade indeholdende et dækglas (22 mm x 22 mm) og fortsæt til kultur ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Der vaskes én gang med PBS og behandle cellerne i 12 timer med eller uden glucose (5 mM) i nærvær eller fravær af tunicamycin (1 ug / ml).
- Vask cellerne gang med PBS og fix i 4% formaldehyd i 10 min.
- Vask cellerne tre gange med PBS, vendes dækglas, montere på slides sammen med antifade reagens, og forsegle dækglas hjælp neglelak.
- Kontroller GFP-SCAP menneskehandel ved hjælp af en 63X nedsænkning olie mål i en laser konfokalt 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser påvisningen af endogent SCAP protein og SREBP-1 nuklear udgave i humane glioblastom U87 celler som respons på glucose stimulation ved anvendelse af Western-blot. Membranproteinet SCAP detekteres i "membranfraktionen". Kernen formular (N-terminal) af SREBP-1 detekteres i "kerneekstrakter". Niveauet af SCAP protein (PDI tjener som en intern kontrol af ER membranproteiner) og SREBP-1 nuklear formular er markant forbedret ved glucose stimulation. Disse resultater viser, at protokollen er i stand til at detektere endogen SCAP protein i humane celler.
Figur 2 viser analysen af SCAP N -glycosylation og totale GFP-SCAP proteinniveauer i reaktion på glucose stimulation og tunicamycin behandling i HEK293T celler, der udtrykker GFP-mærket hamster SCAP. Figur
Figur 3 viser, at GFP-SCAP handel fra ER til Golgi i reaktion på glucose-stimulering blev undertrykt af tunicamycin behandling i U87-celler. Som vist i figur 3A, konfokal mikroskopi billeder viser, at GFP-SCAP protein bor i ER i fravær af glucose, hvilket fremgår af dets co-lokalisering med PDI, en ER-resident protein (rød). I modsætning hertil i nærvær af glucose, GFP-SCAP flytter til Golgi, vist ved co-lokalisering med Golgi-protein markør Giantin (rød) (figur 3B). Desuden tunicamycinbehandling undertrykt glucose-induceret handel med GFP-SCAP fra ER til Golgi (figur 3A og B).
Figur 1. Påvisning af endogene SCAP Protein og SREBP-1 Nuclear Form i U87-celler. Western blot-analyse af membran og nukleare ekstrakter fra humane primære glioblastom U87 celler dyrket i serumfrit medium med eller uden glucose (5 mM) i 12 timer. Anti-SCAP antistof mod humant SCAP aa 450 - 500 blev anvendt til at detektere endogen SCAP i humane celler. Den aktive form (N-terminal) af SREBP-1 detekteres i "kerneekstrakter" under anvendelse af antistof mod aa 301-407 fragmentet af human SREBP-1. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra 31. Klik her for at se et større versipå denne figur.
Figur 2. Western blot analyse af SCAP N -glycosylation og GFP-SCAP proteinniveauer. A) Skematisk diagram, som viser SCAP struktur spænder krydser ER-membranen. Der er tre asparagin (N) rester i SCAP, som alle bor i ER lumen og som ændres af N-bundne oligosaccharider. Fragmentet af SCAP indeholdende aminosyrer 540-707 er modstandsdygtig over for trypsin fordøjelse. Det indeholder to N-bundet oligosaccharid modifikation stalde, N590 og N641, som kan påvises ved IgG-9D5 antistof mod aa 540 - 707 hamster SCAP ved western blot B) Western blot-analyse af SCAP N -glycosylation (øverste:. Med trypsinbehandling) eller GFP-SCAP proteinniveauer (lavere: ingen trypsinbehandling) fra HEK293T celler transiently transficeret med GFP-SCAP i 24 timer og derefter dyrket i serumfrit medium med eller uden glucose (5 mM) i nærvær eller fravær af tunicamycin (1 ug / ml), en N -glycosylation inhibitor, i 12 timer. Tallene på venstre side af blottet angiver antallet af N -glycosylation sites på SCAP protein (N590 og N641 sites) (øverste, opdaget af IgG-9D5-antistof). Lavere panel til GFP-SCAP blev opdaget af et antistof mod GFP protein. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra 31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Påvisning af SCAP Handel fra ER til Golgi. A, B) Konfokal mikroskopi billeder viser, at GFP-SCAP bor i ER eller flytter til than Golgi i fravær eller nærvær af glucose (5 mM) med / uden tunicamycin (1 ug / ml) behandling i U87-celler i 12 timer. PDI viser ER-farvning (rød) (A). Giantin, Golgi markør (rød) (B). DAPI (blå) pletter cellekernen. Skalaen søjler repræsenterer 10 um. Figur 3A er nye data og er ikke blevet offentliggjort før. Figur 3B er blevet modificeret med tilladelse fra 31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskriver vi en protokol til isolering af membran fraktioner i humane celler og til udarbejdelse af prøverne til påvisning af SCAP N -glycosylation og total protein ved hjælp af Western blot. Vi tilbyder endvidere en metode til at overvåge SCAP handel ved hjælp af GFP-mærkning og konfokal mikroskopi. Den metode anvendes til at analysere membranprotein og er et vigtigt redskab til at undersøge SCAP N -glycosylation og menneskehandel.
Sammenlignet med den fremgangsmåde, der anvender forskellige lektiner genkende forskellige N -glycan kæder og identificere N -glycosylated proteiner 42, vores her beskrevne fremgangsmåde anvender PNGase F for at fjerne protein-koblet N -glycan og detekterer migration skift at identificere glycosylering af SCAP proteinfragment aa 540-707. Begrænsningen af lectin-metoden er afhængig af identifikationen af den relevante type lectin at anerkende den særlige
I denne undersøgelse, plasmidet af GFP-mærkede SCAP anvendes til analyse af N -glycosylation og handel med humane celler er hamster-oprindelse. SCAP antistof (IgG-9D5), som er rejst mod aminosyrerne 540-707 fragmentet af SCAP protein kan kun detektere proteinet og N -glycosylation af hamster SCAP, såsom i kinesisk hamster ovarie (CHO) cellelinie 15. Antistoffet mod aminosyrerne 450 - 500 af humant SCAP kan registrere det endogene SCAP protein i humane celler, som vist i figur 1 Til påvisning SCAP N -glyco.sylation i humane celler eller væv, er vi nødt til at udvikle et specifikt antistof mod aminosyrerne 540-707 fragment af humant SCAP. Hertil kommer, at identifikation af en specifik lektin genkende SCAP bundet N -glycan er en alternativ måde at analysere menneskets SCAP N -glycosylation 42. Desuden om sammensætningen og strukturen af hver N -glycan kæde bindende i SCAP (N263, N590 og N641) vil lette vores forståelse af den underliggende mekanisme af SCAP menneskehandel fra ER til Golgi.
Desuden at opnå de bedste resultater til påvisning af SCAP N -glycosylation, vi justeret nogle reaktionsparametre i henhold til vores eksperimentelle betingelser, som er modificeret fra de metoder, der er beskrevet i publikationerne fra Brown og Goldstein Laboratory 15. For med held at detektere SCAP protein og dets N -glycosylation, kvaliteten af membranfraktioner og kerneekstrakter er meget vigtige. Vi direkte bestemmes proteinkoncentrationen efter membranfraktioner inkuberes ved 37 ° C, så man undgår at sætte prøven tilbage på is. Den her beskrevne metode kan i vid udstrækning anvendes på forskellige forskningsområder, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme, diabetes og fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
