Summary
Vi beskriver en modifisert metode for membranfraksjon isolert fra humane celler og prøvepreparering for påvisning av SCAP N -glycosylation og totalt protein ved hjelp av western blot. Vi introduserer ytterligere en GFP-merking metode for å overvåke SCAP trafficking ved hjelp konfokalmikroskopi. Denne protokollen kan brukes i vanlige biologiske laboratorier.
Introduction
Deregulering av lipid metabolisme er et fellestrekk for kreft og metabolske sykdommer 1-6. I disse prosesser sterol regulerende element-bindende proteiner (SREBPs), en familie av transkripsjonsfaktorer, spiller en kritisk rolle i å kontrollere ekspresjonen av gener som er viktige for opptak og syntese av kolesterol, fettsyrer, fosfolipider og 7-10.
SREBPs, inkludert SREBP-1a, SREBP-1c, og SREBP-2, syntetiseres som inaktive forløpere som binder seg til det endoplasmatiske retikulum (ER) membran i kraft av to transmembranområdene 7. Den N-terminale ende av SREBPs inneholder et DNA-bindende domene for transaktivering av målgener 11. C-terminalen av SREBP forløpere binder seg til SREBP cleavage aktiverende protein (SCAP) 12,13, en polytopic membran protein som spiller en sentral rolle i reguleringen av SREBP stabilitet og aktivering 14-16.
det iverktering av transkripsjonen funksjon krever translokasjon av den SCAP / SREBP komplekset fra ER til Golgi, hvor to proteaser sekvensielt spalter SREBP og slipper sin N-terminale fragment, som deretter trer inn i kjernen for transaktivering av lipogenic gener 7. I disse prosessene, nivåene av steroler i ER membranen kontrollere avkjørselen til SCAP / SREBP kompleks fra ER 7,17. Under høye sterol forhold, binder sterol å SCAP eller ER-resident insulin-indusert gen protein-1 (Insig-1) eller 2 (Insig-2), styrke foreningen av SCAP med Insigs som beholder SCAP / SREBP kompleks i ER 18-20. Når sterol nivåer reduseres, dissosierer SCAP med Insigs. Dette fører til en SCAP konformasjonsendring som gjør det mulig SCAP interaksjon med vanlige kappeproteiner (COP) ll-komplekset. Komplekset formidler inkorporering av SCAP / SREBP komplekset i spirende vesikler og retter sin transport fra ER til Golgi 21,22. Ved translocasjon til Golgi er SREBPs sekvensielt spaltes av Site-en og Site-2 proteaser, som fører til utgivelsen av den N-terminale 7,23-29.
SCAP protein bærer tre N -bundne oligosakkarider på asparagin (N) posisjonerer N263, N590 og N641 15. Vi har nylig avdekket at glukose-mediert N -glycosylation av SCAP i disse områdene er en forutsetning for SCAP / SREBP menneskehandel fra ER til Golgi under lave sterol forhold 30-32. Tap av SCAP glykosylering via mutasjon av alle tre asparagin til glutamin (NNN til qqq) deaktiverer trafficking av SCAP / SREBP kompleks og resulterer i ustabilitet SCAP protein og reduksjon av SREBP aktivering 31. Våre nyeste dataene viser også at SREBP-en er sterkt aktivert i glioblastom og regulert av SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Målrette SCAP / SREBP-en signalfremstår som en ny strategi for å behandle ondartede sykdommer og metabolske syndromes 1,3,35-38. Derfor er det viktig å utvikle en effektiv metode for å analysere SCAP protein og N -glycosylation nivåer og overvåke handel med menneskeceller og pasient vev.
Den luminale delen av SCAP protein (aminosyrene 540-707) i ER inneholder to N -glycosylation steder (N590 og N641) som er beskyttet fra proteolyse når intakte membraner blir behandlet med trypsin 15. Denne luminal fragmentet har en molekylvekt på ~ 30 kDa som er liten nok til å tillate oppløsning av individuelle glykosylerte varianter av SCAP av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) 15,31. Her gir vi en metode for å påvise N -glycosylation av SCAP og det totale protein i humane celler. Denne protokollen er avledet fra fremgangsmåten som er beskrevet i publikasjonene fra Brown og Goldstein laboratorium 15 og vår nylig publikasjon 31. Protokollen kan brukes i tHan studerer for SCAP protein fra pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Påvisning av Endogen SCAP Protein i humane celler
- Cellekultur og behandling
- Seed ~ 1 x 10 6 U87-celler i en 10 cm skål med Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS) og inkubere cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før behandling.
- Vask cellene en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS), deretter skifte cellene til friskt DMEM-medium med eller uten glukose (5 mM) i 12 timer.
- Utarbeidelse av cellemembranen fraksjoner og Nuclear ekstrakter
- Vask cellene en gang med PBS, skrapes inn i 1 ml PBS, og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender celler i en iskald buffer inneholdende 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natriumetylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1 mM natrium-etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA), 250 mM sukrose, og en blanding av protease-inhibitorer (5 μg / ml pepstatin A, 10 ug / ml leupeptin, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT), og 25 ug / ml N-acetyl-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) i 30 min på is.
- Passere celleekstrakter gjennom en 22 G x 1 1/2 nål 30 ganger og sentrifuger ved 890 xg ved 4 ° C i 5 minutter for å isolere kjerner.
- Bruk supernatanten for separering av membranfraksjoner (trinn 1.2.7). Resuspender atom pellet i 0,1 ml buffer C (20 mM HEPES / KOH, pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v / v) glyserol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium EDTA, 1 mM natrium EGTA og en blanding av proteasehemmere (5 ug / ml pepstatin A, 10 ug / ml leupeptin, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT og 25 ug / ml ALLN)).
- Rotere suspensjonen ved 4 ° C i 60 min og sentrifuger ved 20 000 x g i en mikrosentrifuge i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blir betegnet som "nukleære ekstrakter".
- Varm atom ekstraktene ved 100 ° C i 10 minutter med 5 x ladningsbuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-merkaptoetanol og 0,05% bromfenolblått) før den utsettes for SDS-PAGE.
- Sentrifuger supernatanten fra den opprinnelige 890 xg sentrifugering ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C. For påfølgende Western blot-analyse, oppløse pelleten i 0,1 ml SDS lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM natrium EDTA, og 1 mM natrium EGTA). Dette blir betegnet "membranfraksjon".
MERK: Vi bruker 20.000 xg for 20 min til pellet membraner. 100 000 xg i 10 - 20 min har blitt brukt i avisene fra Brown og Goldstein laboratorium 15. - Inkuber membranfraksjonen ved 37 ° C i 30 minutter og bestemme proteinkonsentrasjonen ved Bradford proteinanalyse. Tilsett 1 mL 100x bromfenol blå løsning før å utsette prøvene for SDS-PAGE.
- Belastning 25 - 50 ug av totalt membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kjør gelved 80 V i 15 minutter, deretter skifte til 130 V og løpe i en annen 115 min. Overfør på 140 mA for 130 min 39.
- For Western blotting-analyse, kan du bruke anti-SCAP antistoff for å oppdage den totale SCAP protein. Bruk protein-disulfid-isomerase (PDI), en ER-resident protein 40, som en intern kontroll. Bruke anti-SREBP-1-antistoff for å detektere den N-terminale bånd av SREBP-1. Bruk Lamin A som en intern kontroll for atom ekstrakter 31.
2. Analyse av SCAP N -glycosylation i humane celler
- Cell Culture, Transfeksjon og behandling
- For membran analyse, frø ~ 1 x 10 6 HEK293T celler i en 10 cm skål med DMEM supplert med 5% FBS og inkuberes cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før transfeksjon.
- Fortynnet 4-8 mikrogram GFP-SCAP plasmid (en gave fra Dr. Peter Espenshade) 22 i 1 ml redusert serum medium og bland forsiktig.
- Legg 8-16 pl DNA transfeksjon reagens ved å pipettere direkte inn i 1 ml reduserte serum medium som inneholder plasmider og bland forsiktig.
- Inkuber transfeksjon reagens / plasmid-kompleks i 25 min ved romtemperatur.
- Legg transfeksjon kompleks til cellene med friskt medium og fortsette å kultur i 24 timer ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Vask en gang med PBS og behandle cellene i 12 timer med eller uten glukose (5 mM) i nærvær eller fravær av tunicamycin (1 pg / ml), et N -glycosylation inhibitor.
- Forbered cellemembranen pellets som beskrevet i trinn 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 og 1.2.7.
- Påvisning av SCAP N -glycosylation
- trypsin Proteolyse
- Resuspender membranpelletene fra celler som overuttrykker GFP-SCAP i 114 ul buffer inneholdende 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium EDTA, og 100 mM NaCl.
- Inkuber 5781; l aliquoter av membranproteiner i fravær eller nærvær av 1 ul trypsin (1 ug / ul), i et totalvolum på 58 ul, i 30 minutter ved 30 ° C.
- Stoppe reaksjonene ved tilsetning av 2 ul (400 enheter) av soyabønne trypsin inhibitor.
- Deglykosylering av peptid N- glykosidase F (PNGase F)
- For etterfølgende behandling med PNGase F, tilsett 10 ul oppløsning inneholdende 3,5% (vekt / volum) SDS og 7% (volum / volum) 2-merkaptoetanol til hver prøve.
- Etter oppvarming ved 100 ° C i 10 minutter, sekvensielt legg 7 pl 0,5 M natriumfosfat (pH 7,5), 7 pl 10% (v / v) Nonidet P-40 med 12 x proteasehemmere, og 2 ul (0,5 U / mikroliter) av PNGase F.
- Etter inkubering ved 37 ° C i 3 timer, stopp reaksjon ved tilsetning av 5x loading buffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-merkaptoetanol og 0,05% bromfenolblått). Oppvarme blandingen ved 100 ° C i 10 mi og utsatt for SDS-PAGE. Belastning 25-50 ug av det totale membranproteiner på en 10% SDS-PAGE-gel 39. Kjør gelen ved 80 V i 15 minutter, deretter skifte til 130 V for en annen 115 min. Overfør på 140 mA for 130 min.
- For Western blot, bruke 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) antistoff for å påvise N -glycosylation og total SCAP protein.
- trypsin Proteolyse
3. Påvisning av SCAP Trafficking fra ER til Golgi ved hjelp GFP-SCAP i humane celler
- Frø 2,5 x 10 5 U87-celler i en 60 mm skål med DMEM supplert med 5% FBS og inkuberes cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før transfeksjon.
- Fortynnet 4 mikrogram GFP-SCAP plasmid i 0,5 ml redusert serum medium og bland.
- Tilsett 8 pl DNA transfeksjon reagens ved å pipettere direkte inn 0,5 ml redusert serum medium som inneholder plasmider og bland forsiktig.
- Inkuber transfeksjon reagens / plasmid-kompleks i 25 min ved værelsestemperatur.
- Legg transfeksjon kompleks til cellene med friskt medium og fortsette å kultur i 24 timer ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Reseed 5 - 10 x 10 4 celler i en 6-brønns plate som inneholder et glass dekkglass (22 mm x 22 mm) og fortsetter til kultur ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Vask en gang med PBS og behandle cellene i 12 timer med eller uten glukose (5 mM) i nærvær eller fravær av tunicamycin (1 pg / ml).
- Vask cellene en gang med PBS og feste i 4% formaldehyd i 10 min.
- Vask cellene tre ganger med PBS, invertere Dekk, montere på lysbilder sammen med antifade reagent, og forsegle Dekk bruker neglelakk.
- Sjekk GFP-SCAP trafficking ved hjelp av en 63X oljeneddyppingsobjektivet i en laserskanning konfokalmikroskop 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser påvisningen av endogent SCAP protein og SREBP-en kjerneform i human glioblastoma U87-celler i respons til glukose stimulering ved hjelp av western blot. Den membranprotein SCAP detekteres i "membranfraksjonen". Kjernen form (N-terminal) av SREBP-en er oppdaget i "kjerneekstrakter". Nivået av SCAP protein (PDI tjener som en intern kontroll av ER membranproteiner) og SREBP-en kjerneform markert forbedret med glukose stimulering. Disse resultater viser at protokollen er i stand til å gjenkjenne den endogene SCAP protein i humane celler.
Figur 2 viser en analyse av SCAP N -glycosylation og totale GFP-scap proteinnivåer i respons overfor glukose stimulering og tunicamycin behandling i HEK293T celler som uttrykker GFP-merket hamster SCAP Fig.
Figur 3 viser at GFP-SCAP trafikk fra ER til Golgi i respons overfor glukose stimulering ble undertrykket ved tunicamycin behandling i U87-celler. Som vist i figur 3A, Konfokalmikroskopi bildene viser at GFP-SCAP protein befinner seg i ER i fravær av glukose, som vist ved dets ko-lokalisering med PDI, en ER-resident protein (rød). I motsetning til dette, i nærvær av glukose, beveger GFP-SCAP til Golgi, vist ved ko-lokalisering med Golgi-proteinet markør Giantin (rød) (figur 3B). Videre Tunicamycinbehandling trykkes glukose-indusert smugling av GFP-SCAP fra ER til Golgi (figur 3A og B).
Figur 1. Påvisning av Endogene SCAP Protein og SREBP-1 Nuclear Form i U87-Cells. Western blot analyse av membran og kjernefysiske ekstrakter fra humane primære glioblastom U87 celler dyrket i serumfritt medium med eller uten glukose (5 mm) i 12 timer. Anti-SCAP antistoff mot humant SCAP aa 450-500 ble brukt til å oppdage den endogene SCAP i humane celler. Den aktive formen (N-terminale) av SREBP-1 er påvist i de "nukleære ekstrakter" ved bruk av antistoff mot aa 301-407 fragment av humant SREBP-1. Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra 31. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.
Figur 2. Western Blot analyse av SCAP N -glycosylation og GFP-scap protein nivåer. A) Skjematisk diagram som viser SCAP struktur spenner krysse ER membranen. Det er tre asparagin (N) rester i SCAP, alle som oppholder seg i ER lumen og er modifisert ved N-bundne oligosakkarider. Fragmentet av scap holdige aminosyrer 540-707 er motstandsdyktig overfor trypsin fordøyelse. Den inneholder to N-bundet oligosakkarid modifikasjons severdigheter, N590 og N641, som kan oppdages av IgG-9D5 antistoff mot aa 540-707 av hamster SCAP av western blot B) Western blot analyse av SCAP N -glycosylation (øvre. Med trypsin behandling) eller GFP-scap proteinnivå (lavere: ingen trypsin behandling) fra HEK293T celler transiently transfektert med GFP-SCAP i 24 timer og deretter dyrket i serumfritt media med eller uten glukose (5 mM) i nærvær eller fravær av tunicamycin (1 pg / ml), en N -glycosylation inhibitor, i 12 timer. Tallene på venstre side av blot angir antall N -glycosylation steder på SCAP protein (N590 og N641 nettsteder) (øvre, oppdaget av IgG-9D5 antistoff). Nedre panel for GFP-SCAP ble påvist ved et antistoff mot GFP protein. Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra 31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Påvisning av SCAP Trafficking fra ER til Golgi. A, B) konfokalmikroskopi bilder viser at GFP-SCAP ligger på akuttmottaket eller flytter til than Golgi i fravær eller nærvær av glukose (5 mM) med / uten tunicamycin (1 pg / ml) behandling i U87-celler i 12 timer. PDI viser ER farging (rød) (A). Giantin, Golgi markør (red) (B). DAPI (blå) flekker cellekjernen. De skala barer representerer 10 mikrometer. Figur 3A er nye data, og har ikke vært publisert før. 3B har blitt modifisert med tillatelse fra 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien, beskriver vi en protokoll for isolering av membranfraksjoner i humane celler og for fremstilling av prøver for påvisning av SCAP N -glycosylation og totalt protein ved hjelp av western blot. Vi gir videre en metode for å overvåke SCAP trafficking ved hjelp av GFP-merking og konfokalmikroskopi. Metoden er spesielt brukt til å analysere membran protein og er et viktig verktøy for å undersøke SCAP N -glycosylation og trafficking.
Sammenlignet med metoden ved hjelp av ulike lektiner å gjenkjenne ulike N -glycan kjeder og identifisere N -glycosylated proteiner 42, vår metode beskrevet her bruker PNGase F for å fjerne proteinbundet N -glycan og oppdager migrasjon skift for å identifisere glykosylering av SCAP proteinfragment aa 540-707. Begrensningen av det lektin-metoden er avhengig av identifikasjon av den aktuelle type lektin til å gjenkjenne den spesifikke
I denne studien er plasmidet av GFP-merket SCAP brukt for analyse av N -glycosylation og handel med menneskelige celler hamster-opprinnelse. SCAP-antistoff (IgG-9D5) som er dannet mot aminosyrene 540-707 fragment av SCAP protein kan bare påvise proteinet og N -glycosylation av hamster SCAP, slik som i den kinesiske hamster ovarie (CHO) cellelinje 15. Antistoffet mot aminosyrene 450-500 av human SCAP er i stand til å gjenkjenne den endogene SCAP protein i humane celler, som vist i figur 1. For å påvise SCAP N -glyco.sylation i humane celler eller vev, trenger vi å utvikle et spesifikt antistoff mot aminosyrer 540-707 fragment av menneskelig SCAP. I tillegg til identifisering av en spesifikk lektin gjenkjenne SCAP-bundet N -glycan er en alternativ måte å analysere menneskelig SCAP N -glycosylation 42. Videre definerer sammensetning og struktur av hver N -glycan kjeden bindende i SCAP (N263, N590 og N641) vil lette vår forståelse av den underliggende mekanismen for SCAP menneskehandel fra ER til Golgi.
Videre, for å oppnå de beste resultatene for påvisning av SCAP N -glycosylation, vi justert noen reaksjonsparametre i henhold til våre eksperimentelle forhold, som er modifisert fra metodene som er beskrevet i publikasjoner fra Brown og Goldstein Laboratory 15. For å kunne oppdage SCAP protein og dens N -glycosylation, kvaliteten på membranfraksjoner og atom ekstrakter er veldig viktig. Vi direkte bestemmes proteinkonsentrasjonen etter at membranfraksjoner inkubert ved 37 ° C, uten å belaste prøven tilbake på is. Metoden er beskrevet her kan bli mye brukt til ulike forskningsfelt, blant annet kreft, hjerte- og karsykdommer, diabetes og fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
