Summary
Nous décrivons un procédé modifié pour l' isolement de la fraction membranaire à partir de cellules humaines et la préparation des échantillons pour la détection de SCAP N -glycosylation et la protéine totale en utilisant Western Blot. Nous présentons en outre un procédé GFP-étiquetage pour surveiller le trafic SCAP utilisant la microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé dans les laboratoires de biologie réguliers.
Introduction
La dérégulation du métabolisme des lipides est une caractéristique commune des maladies cancéreuses et métaboliques 1-6. Dans ces procédés, les protéines de régulation du stérol élément de liaison (SREBPs), une famille de facteurs de transcription, jouent un rôle crucial dans le contrôle de l'expression des gènes importants pour l'absorption et la synthèse du cholestérol, des acides gras et des phospholipides 7-10.
SREBPs, y compris SREBP-1a, SREBP-1c, et SREBP-2, sont synthétisés sous forme de précurseurs inactifs qui se lient à la membrane du réticulum endoplasmique (RE) en vertu de deux domaines transmembranaires 7. L' extrémité N-terminale de SREBPs contient un domaine de liaison d'ADN pour la transactivation des gènes cibles 11. L'extrémité C-terminale des précurseurs de SREBP se lie à SREBP clivage protéine d' activation (SCAP) 12,13, une protéine membranaire polytopic qui joue un rôle central dans la régulation de la stabilité et de l' activation 14-16 SREBP.
La mise enla mise en fonction de la transcription nécessite la translocation du complexe SCAP / SREBP du RE à l'appareil de Golgi, où deux proteases clivent séquentiellement SREBP et la libération de son fragment N-terminal, qui pénètre alors dans le noyau pour la transactivation des gènes lipogenèse 7. Dans ces procédés, les niveaux de stérols dans la membrane du RE contrôlent la sortie du complexe SCAP / SREBP du RE 7,17. Dans des conditions de stérol élevées stérol se lie à SCAP ou ER-résident insuline induite par la protéine du gène-1 (Insig-1) ou 2 (Insig-2), l'amélioration de l'association des SCAP avec Insigs qui maintiennent le complexe SCAP / SREBP dans le ER 18-20. Lorsque les niveaux de stérols diminuent, SCAP dissocie avec Insigs. Cela conduit à un changement conformationnel SCAP, ce qui permet une interaction avec SCAP protéines d'enveloppe communes complexe (COP) II. Le complexe médie l'incorporation du complexe SCAP / SREBP dans les vésicules en herbe et dirige son transport de l'ER au Golgi 21,22. Sur TransLocation du Golgi, SREBPs sont séquentiellement clivés par Site-1 et Site-2 protéases, conduisant à la libération de l'extrémité N-terminale 7,23-29.
Protéines SCAP porte trois N oligosaccharides liés en au asparagine (N) positionne N263, N590, N641 et 15. Nous avons récemment révélé que le glucose médiée N -glycosylation de SCAP dans ces sites est une condition préalable à SCAP / SREBP traite de l'ER au Golgi dans des conditions de stérol bas 30-32. Perte de SCAP glycosylation par mutation de tous les trois asparagine en glutamine (NNN à QQQ) désactive le trafic de / complexe et les résultats de SREBP SCAP dans l'instabilité de la protéine et de la réduction de l' activation de SREBP 31 SCAP. Nos données récentes démontrent également que SREBP-1 est fortement activée dans le glioblastome et réglementé par SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Ciblage SCAP / SREBP-1 signalisation est en train de devenir une nouvelle stratégie pour traiter les tumeurs malignes et métaboliques syndromes 1,3,35-38. Par conséquent, il est important de développer une méthode efficace pour analyser les niveaux de protéines SCAP et N -glycosylation et de surveiller son trafic de cellules et de tissus humains de patients.
La région luminale des protéines SCAP (acides aminés 540-707) dans le ER contient deux sites de -glycosylation N (N590 et N641) qui sont protégés de la protéolyse lorsque les membranes sont intactes sont traitées avec de la trypsine 15. Ce fragment a luminale a une masse moléculaire de ~ 30 kDa qui est suffisamment petite pour permettre la résolution des variants glycosylés individuels de SCAP par dodécylsulfate de sodium gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) 15,31. Ici, nous fournissons une méthode permettant de détecter la N -glycosylation de PAP et la protéine totale dans les cellules humaines. Ce protocole est dérivé du procédé décrit dans les publications du laboratoire Brown et Goldstein 15 et notre publication récente 31. Le protocole peut être utilisé en til étudie des protéines SCAP à partir de cellules de mammifères.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Détection de Endogène SCAP protéine dans les cellules humaines
- Culture cellulaire et traitement
- Cellules de graine ~ 1 × 10 6 U87 dans une boîte de 10 cm avec du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS) et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures avant le traitement.
- Laver les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis passer les cellules dans un milieu de DMEM frais avec ou sans glucose (5 mM) pendant 12 heures.
- Préparation de la membrane cellulaire Fractions et nucléaires Extraits
- Laver les cellules une fois avec du PBS, grattent dans 1 ml de PBS, et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspendre les cellules dans un tampon glacé contenant 10 mM de HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, l' acide éthylènediaminetétracétique de sodium 1 mM (EDTA), 1 mM d' acide éthylène de sodium glycol tétraacétique (EGTA), 250 mM le saccharose et un mélange d'inhibiteurs de protéase (5 μg / ml de pepstatine A, 10 ug / ml de leupeptine mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,5 (PMSF), 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 25 pg / ml de N-acétyl-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) pendant 30 min sur la glace.
- Passer les extraits cellulaires à travers un 22 G x 1 1/2 aiguille 30 fois et centrifuger à 890 x g à 4 ° C pendant 5 minutes pour isoler les noyaux.
- Utiliser le surnageant pour la séparation des fractions de membrane (étape 1.2.7). Remettre en suspension le culot nucléaire dans 0,1 ml de tampon C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M de NaCl, 2,5% (v / v) de glycerol, 1,5 mM de MgCl2, EDTA de sodium et 1 mM, EGTA de sodium à 1 mM , et un mélange de les inhibiteurs de la protéase (5 ug / ml de pepstatine A, 10 ug / ml de leupeptine, 0,5 mM de PMSF, 1 mM de DTT et 25 pg / ml ALLN)).
- Tourner la suspension à 4 ° C pendant 60 min et centrifuger à 20 000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 20 min à 4 ° C. Le surnageant est désigné comme «extraits nucléaires».
- Chauffer les extraits nucléaires à 100 ° C pendant 10 min avec un tampon 5x de chargement (312,5 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glycerol, 12,5% de β-mercaptoéthanol et 0,05% de bleu de bromophénol) avant de le soumettre à une SDS-PAGE.
- Centrifuger le surnageant de la rotation initiale de 890 g à 20 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Pour l'analyse Western Blot subséquente, on dissout le culot dans 0,1 ml de tampon SDS de lyse (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, 100 mM de NaCl, 1% (v / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS), de l'EDTA de sodium 1 mM, et 1 mM EGTA de sodium). Ceci est appelé «fraction membranaire».
NOTE: Nous utilisons 20 000 xg pendant 20 minutes pour sédimenter les membranes. 100 000 g pendant 10 - 20 min a été utilisé dans les études de laboratoire Brown et Goldstein 15. - Incuber la fraction membranaire à 37 ° C pendant 30 minutes et on détermine la concentration en protéine par dosage de protéine de Bradford. Ajouter une solution de bleu de bromophénol 100x 1 pi avant de soumettre les échantillons à SDS-PAGE.
- Charge 25 - 50 pg de protéines membranaires totales sur un gel SDS-PAGE à 10% 39. Exécutez le gelà 80 V pendant 15 min, puis changer à 130 V et courir pour un autre 115 min. Transfert à 140 mA pour 130 min 39.
- Pour l'analyse Western blot, utiliser un anticorps anti-SCAP pour détecter la protéine SCAP totale. Utiliser une protéine disulfure isomérase (PDI), une protéine ER-résidente 40, en tant que contrôle interne. Utiliser l'anti-SREBP-1 pour détecter des anticorps du groupe N-terminal de SREBP-1. Utilisez Lamin A comme contrôle interne pour les extraits nucléaires 31.
2. Analyse des SCAP N -glycosylation dans les cellules humaines
- Culture cellulaire, Transfection et traitement
- Pour l' analyse de la membrane, les cellules des semences ~ 1 × 10 6 HEK293T dans un plat de 10 cm avec du DMEM supplémenté avec 5% de SBF et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures avant la transfection.
- Diluer 4-8 pg GFP-SCAP plasmide (un don du Dr. Peter Espenshade) 22 dans 1 ml réduits milieu sérique et mélanger doucement.
- Ajouter 8-16 ul réactif ADN de transfection par pipetage directement dans les 1 ml réduction moyenne de sérum contenant des plasmides et mélanger doucement.
- Incuber le complexe réactif / plasmide de transfection pendant 25 minutes à température ambiante.
- Ajouter complexe de transfection des cellules avec un milieu frais et continuer à la culture pendant 24 heures à 5% de CO 2 et 37 ° C.
- Laver une fois avec du PBS et traiter les cellules pendant 12 heures avec ou sans glucose (5 mM) en présence ou en l' absence de tunicamycine (1 pg / ml), un inhibiteur de N -glycosylation.
- Préparer des pastilles de la membrane cellulaire, comme décrit dans les étapes 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, et 1.2.7.
- Détection de SCAP N -glycosylation
- trypsine protéolyse
- Remettre en suspension les culots de membranes à partir de cellules surexprimant GFP-SCAP dans 114 ul d' un tampon contenant du HEPES 10 mM de KOH (pH 7,4), KCl 10 mM , MgCl2, EDTA de sodium et 1,5 à 1 mM et NaCl 100 mM.
- Incuber 5781; l des aliquotes de protéines de la membrane en l'absence ou en présence de 1 pi de trypsine (1 ug / ul) dans un volume total de 58 ul, pendant 30 min à 30 ° C.
- Arrêter les réactions par l'addition de 2 ul (400 unités) d'inhibiteur de trypsine de soja.
- La déglycosylation de la N- glycosidase F de peptides (PNGase F)
- Pour un traitement ultérieur avec de la PNGase F, ajouter 10 pl de solution contenant 3,5% (poids / volume) de SDS et 7% (vol / vol), 2-mercaptoéthanol à chaque échantillon.
- Après chauffage à 100 ° C pendant 10 min, ajouter séquentiellement 7 ul de phosphate de sodium 0,5 M (pH 7,5), 7 ul de 10% (v / v) Nonidet P-40 avec des inhibiteurs de 12 x de la protéase, et 2 ul (0,5 U / ul) de PNGase F.
- Après incubation à 37 ° C pendant 3 h, stopper les réactions par l'addition d'un tampon 5x de chargement (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glycerol, 12,5% de β-mercaptoéthanol et 0,05% de bleu de bromophénol). Chauffer le mélange à 100 ° C pendant 10 met soumis à une SDS-PAGE. Charge de 25 à 50 pg de protéines membranaires totales sur un gel SDS-PAGE à 10% 39. Exécutez le gel à 80 V pendant 15 min, puis changer à 130 V pour une autre 115 min. Transfert à 140 mA pour 130 min.
- Pour le transfert de Western, en utilisant 10 pg / ml d' anticorps anti-PAP (9D5) afin de détecter la protéine N et -glycosylation SCAP totale.
- trypsine protéolyse
3. Détection de SCAP traite de ER à l'Golgi à l'aide de la GFP-SCAP dans les cellules humaines
- Semences de 2,5 x 10 5 cellules U87 dans une boîte de 60 mm avec du DMEM supplémenté avec 5% de SBF et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 heures avant la transfection.
- Diluer 4 pg GFP-SCAP plasmide dans 0,5 ml réduite de milieu sérique et mélanger.
- Ajouter 8 ul réactif ADN de transfection par pipetage directement dans 0,5 ml de milieu sérique réduit contenant des plasmides et mélanger doucement.
- Incuber le complexe réactif / plasmide de transfection pendant 25 minutes à la chambretempérature.
- Ajouter complexe de transfection des cellules avec un milieu frais et continuer à la culture pendant 24 heures à 5% de CO 2 et 37 ° C.
- Réensemencer 5 - 10 × 10 4 cellules dans une plaque de 6 puits contenant une lamelle de verre (22 mm x 22 mm) et continuer à la culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures.
- Laver une fois avec du PBS et traiter les cellules pendant 12 heures avec ou sans glucose (5 mM) en présence ou en l'absence de tunicamycine (1 pg / ml).
- Laver les cellules une fois avec du PBS et fixer dans 4% de formaldéhyde pendant 10 min.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS, inverser les lamelles, monter sur des lames avec antifade réactif, et sceller les lamelles à l'aide de vernis à ongles.
- Vérifiez le trafic GFP-SCAP en utilisant un objectif à immersion d'huile 63X dans un balayage laser confocal microscope 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 montre la détection d' une protéine endogène et SCAP SREBP-1 sous forme nucléaire dans les cellules du glioblastome U87 humains en réponse à une stimulation de glucose en utilisant Western Blot. SCAP protéine membranaire est détectée dans la «fraction membranaire». La forme de noyau (N-terminal) de SREBP-1 est détectée dans les «extraits nucléaires». Le niveau de protéine SCAP (PDI sert de contrôle interne des protéines de la membrane ER) et SREBP-1 sous forme nucléaire sont nettement améliorée par la stimulation du glucose. Ces résultats démontrent que le protocole est capable de détecter la protéine PAP endogène dans les cellules humaines.
La figure 2 montre l'analyse de SCAP N -glycosylation et le total des teneurs en protéines GFP-SCAP en réponse au glucose stimulation et le traitement de tunicamycine dans des cellules HEK293T exprimant la GFP marquée de hamster SCAP. Figure
La figure 3 montre que la GFP-SCAP traite du RE à l'appareil de Golgi , en réponse à une stimulation de glucose a été inhibée par le traitement à la tunicamycine dans les cellules U87. Comme on le voit sur la figure 3A, des images de microscopie confocale montrent que la protéine GFP-SCAP réside dans le RE en l'absence de glucose, comme indiqué par la co-localisation avec IPD, une protéine ER-résidente (rouge). En revanche, en présence de glucose, GFP-SCAP se déplace vers l'appareil de Golgi, représenté par la co-localisation avec le Golgi protéine marqueur Giantin (rouge) (figure 3B). Par ailleurs, la tunicamycinele traitement supprime le trafic induite par le glucose de la GFP-SCAP de l'ER à l'appareil de Golgi (figure 3A et B).
Figure 1. Détection de Endogène SCAP Protein et SREBP-1 Formulaire nucléaire dans les cellules U87. Analyse Western blot de la membrane et des extraits nucléaires de cellules U87 glioblastome primaire humaines cultivées dans un milieu sans sérum avec ou sans glucose (5 mM) pendant 12 heures. un anticorps anti-PAP contre aa SCAP humaine 450-500 a été utilisé pour détecter le PACP endogène dans les cellules humaines. La forme active (N-terminal) de SREBP-1 est détectée dans les "extraits nucléaires" en utilisant un anticorps contre le aa 301-407 fragment de SREBP-1 humain. Ce chiffre a été modifié avec la permission de 31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versisur ce chiffre.
Figure 2. Western Blot Analyse des SCAP N -glycosylation et GFP-SCAP niveaux de protéines. A) Schéma montrant la SCAP structure de spanning traverser la membrane du RE. Il y a trois asparagine (N), les résidus présents dans SCAP, lesquels résident dans la lumière du RE et sont modifiés par des oligosaccharides N-liés. Le fragment de SCAP contenant des acides aminés 540-707 est résistant à la digestion par la trypsine. Il contient deux porcheries N-linked modification des oligosaccharides, N590 et N641, qui peuvent être détectées par l' anticorps IgG-9D5 contre l'aa 540-707 de hamster SCAP par western blot B) Western analyse par transfert de SCAP N -glycosylation (supérieure:. Avec traitement à la trypsine) ou des niveaux de protéine GFP-SCAP (inférieure: pas de traitement de la trypsine) à partir de cellules HEK293T transiently transfectées avec GFP-SCAP pendant 24 heures puis mises en culture dans un milieu exempt de sérum , avec ou sans glucose (5 mM) en présence ou en l' absence de tunicamycine (1 pg / ml), un inhibiteur de N -glycosylation, pendant 12 heures. Les chiffres sur le côté gauche du blot indiquent le nombre de N sites -glycosylation sur protéine SCAP (sites N590 et N641) (supérieure, détectée par l' anticorps IgG-9D5). Panneau inférieur pour la GFP-SCAP a été détectée par un anticorps contre la protéine GFP. Ce chiffre a été modifié avec la permission de 31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Détection de SCAP traite de l'ER à l'appareil de Golgi. A, B) des images de microscopie confocale montrent que GFP-SCAP réside dans l'ER ou se déplace à til Golgi en l'absence ou en présence de glucose (5 mM) avec / sans tunicamycine (1 pg / ml) dans le traitement des cellules U87 pendant 12 heures. PDI montre ER coloration (rouge) (A). Giantin, le marqueur de Golgi (rouge) (B). DAPI (bleu) colore le noyau cellulaire. Les barres d'échelle représentent 10 nm. La figure 3A est de nouvelles données et n'a pas été publiée avant. Figure 3B a été modifié avec la permission de 31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour l'isolement des fractions membranaires des cellules humaines et pour la préparation des échantillons pour la détection de SCAP N -glycosylation et la protéine totale en utilisant Western Blot. Nous fournissons en outre un procédé pour surveiller le trafic de SCAP en utilisant GFP-étiquetage et la microscopie confocale. La méthode est spécifiquement utilisé pour analyser la protéine de la membrane et est un outil important pour étudier SCAP N -glycosylation et le trafic.
Par rapport à la méthode en utilisant diverses lectines de reconnaître différentes chaînes -glycan N et identifier N protéines -glycosylated 42, notre méthode décrite ici utilise PNGase F pour éliminer les protéines liées N -glycan et détecte le passage de la migration pour identifier la glycosylation du fragment de protéine SCAP aa 540-707. La limitation de la méthode à la lectine dépend de l'identification du type approprié de lectine spécifique pour reconnaître la
Dans cette étude, le plasmide de SCAP GFP marqué utilisé pour l' analyse de la N -glycosylation et la traite des cellules humaines est hamster origine. Anticorps SCAP (IgG 9D5) qui est dirigé contre les acides aminés 540-707 fragment de la protéine PAP ne peut détecter la protéine et N -glycosylation du SCAP de hamster, comme chez le hamster ovaire chinois de ligne (CHO) , des cellules 15. L'anticorps dirigé contre les acides aminés 450-500 de SCAP humain est capable de détecter la protéine PAP endogène dans les cellules humaines, comme représenté sur la figure 1 pour détecter SCAP N -glyco.sylation dans des cellules ou tissus humains, nous avons besoin de développer un anticorps spécifique contre les acides aminés 540-707 fragment de SCAP humain. En outre, l' identification d'une lectine spécifique à reconnaître SCAP lié N -glycan est une autre façon d'analyser SCAP humaine N -glycosylation 42. En outre, la définition de la composition et de la structure de liaison en SCAP chaque chaîne -glycan N (N263, N590 et N641) faciliteront notre compréhension du mécanisme sous - jacent de la traite des SCAP de l'ER à l'appareil de Golgi.
En outre, pour obtenir les meilleurs résultats pour la détection de SCAP N -glycosylation, nous avons ajusté certains paramètres de la réaction en fonction de nos conditions expérimentales, qui sont modifiés à partir des méthodes décrites dans les publications de la Brown et Goldstein Laboratory 15. Avec succès pour détecter la protéine PAP et son N -glycosylation, la qualité des fractions membranaires et des extraits nucléaires sont très importants. On a déterminé directement la concentration en protéines après les fractions de membrane ont été incubées à 37 ° C, en évitant de mettre l'échantillon en arrière de la glace. La méthode décrite ici peut être largement appliquée à différents domaines de la recherche, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires, le diabète et l'obésité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
