Summary
We beschrijven een aangepaste werkwijze voor membraanfractie isolatie uit humane cellen en monstervoorbereiding voor de detectie van SCAP N -glycosylation en totaal eiwit door Western blot. We verdere invoering van een GFP-labeling methode om SCAP mensenhandel te monitoren met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan in normale biologische laboratoria.
Introduction
Deregulering van het vetmetabolisme is een gemeenschappelijk kenmerk van kanker en metabole ziekten 1-6. Bij deze werkwijzen, sterol-regulerende element bindende eiwitten (SREBPs), een familie van transcriptiefactoren, spelen een cruciale rol in de expressie van genen betrokken in de opname en de synthese van cholesterol, vetzuren en fosfolipiden 7-10.
SREBPs, waaronder SREBP-1a, SREBP-1c en SREBP-2, worden gesynthetiseerd als inactieve precursors die binden aan het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vanwege twee transmembraandomeinen 7. De N-terminus van SREBPs bevat een DNA-bindingsdomein voor de transactivatie van doelgenen 11. De C-terminus van SREBP precursors bindt aan SREBP-splitsing activerend eiwit (SCAP) 12,13, polytopisch een membraaneiwit dat een centrale rol in de regulatie van SREBP stabiliteit en activering 14-16 speelt.
de uitvoelegging van transcriptionele functie vereist de translocatie van de SCAP / SREBP complex uit het ER naar het Golgi, waar twee proteases sequentieel SREBP splitsen en laat de N-terminale fragment, dat vervolgens gaat in de kern van de transactivatie van lipogene genen 7. Bij deze werkwijzen, de niveaus van sterolen in het ER membraan controle van de uitgang van de SCAP / SREBP complex uit het ER 7,17. Onder hoge sterol omstandigheden, sterol bindt aan SCAP of ER-resident insuline-geïnduceerde gen-eiwit-1 (Insig-1) of -2 (Insig-2), het verbeteren van de associatie van SCAP met Insigs dat de SCAP / SREBP complex in het behouden ER 18-20. Wanneer sterolen verlagen, SCAP distantieert met Insigs. Dit leidt tot een SCAP conformationele verandering die SCAP interactie gemeenschappelijke manteleiwitten (COP) II complex maakt. Het complex bemiddelt de opname van de SCAP / SREBP complex in de ontluikende blaasjes en richt haar vervoer van het ER naar het Golgi 21,22. Bij Translocatie het Golgi worden SREBPs achtereenvolgens gesplitst door site-1 en Site-2 proteasen, wat leidt tot de afgifte van N-terminus 7,23-29.
SCAP eiwit draagt drie N-gebonden oligosachariden op asparagine (N) positioneert N263, N590, N641 en 15. We hebben onlangs onthuld dat glucose-gemedieerde N -glycosylation van SCAP in deze sites is een voorwaarde voorwaarde voor SCAP / SREBP mensenhandel uit het ER naar het Golgi onder lage sterolen omstandigheden 30-32. Verlies van SCAP glycosylering via mutatie van alle drie de asparagine naar glutamine (NNN naar QQQ) schakelt de handel in de SCAP / SREBP complex en resulteert in de instabiliteit van SCAP eiwit en vermindering van SREBP activering 31. Onze recente gegevens tonen ook aan dat SREBP-1 is zeer actief in glioblastoma en gereguleerd door SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1-signalering is in opkomst als een nieuwe strategie om maligniteiten en metabole s behandelenyndromes 1,3,35-38. Daarom is het belangrijk om een effectieve methode om SCAP eiwit en N -glycosylation niveaus analyseren en controleren de handel in menselijke cellen en weefsels patiënten ontwikkelen.
De luminale regio SCAP eiwit (aminozuren 540-707) in het ER bevat twee N -glycosylation sites (N590 en N641), die worden beschermd tegen proteolyse wanneer intacte membranen worden behandeld met trypsine 15. Deze luminale fragment heeft een molecuulgewicht van ~ 30 kDa die klein genoeg is om de oplossing van individuele geglycosyleerde varianten van SCAP door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) 15,31 toelaten. Hier geven we een methode om N -glycosylation van SCAP en de totale hoeveelheid eiwit in menselijke cellen te detecteren. Dit protocol is afgeleid van de in de publicaties van Brown en Goldstein laboratorium 15 en onze recente publicatie 31 beschreven werkwijze. Het protocol kan worden gebruikt in thij bestuderen van SCAP eiwit uit zoogdiercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Detectie van endogene SCAP eiwit in menselijke cellen
- Celkweek en behandeling
- Zaad ~ 1 x 10 6 U87 cellen in een 10 cm schaal met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor de behandeling.
- Was de cellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), schakel cellen vers DMEM-medium met of zonder glucose (5 mM) gedurende 12 uur.
- Voorbereiding van de celmembraan fracties en nucleaire extracten
- Was de cellen eenmaal met PBS, schrapen in 1 ml PBS en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer cellen in een ijskoude buffer die 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium- ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM natrium ethyleenglycol azijnzuur (EGTA), 250 mM sucrose en een mengsel van proteaseremmers (5 μg / ml pepstatine A, 10 pg / ml leupeptine, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT) en 25 ug / ml N-acetyl-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) gedurende 30 min op ijs.
- Celextracten passeren door een 22 G x 1 1/2 naald 30 keer en centrifugeer bij 890 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten om kernen te isoleren.
- Met de bovenstaande vloeistof voor de scheiding van membraanfracties (stap 1.2.7). Resuspendeer de nucleaire pellet in 0,1 ml buffer C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v / v) glycerol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, 1 mM natrium EGTA en een mengsel van proteaseremmers (5 ug / ml pepstatine A, 10 pg / ml leupeptine, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, en 25 ug / ml ALLN)).
- Draai de suspensie bij 4 ° C gedurende 60 minuten en centrifugeer bij 20.000 x g in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 ° C. De supernatant wordt aangeduid als "nucleaire extracten".
- Verwarm de nucleaire extracten bij 100 ° C gedurende 10 minuten met 5 x laadbuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol en 0,05% broomfenolblauw) voor het onderwerpen aan SDS-PAGE.
- Centrifugeer de supernatant van de oorspronkelijke 890 xg centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Voor daaropvolgende Western blotanalyse los de pellet in 0,1 ml SDS-lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM natrium-EDTA, en 1 mM natrium EGTA). Dit wordt aangeduid als "membraanfractie".
LET OP: We maken gebruik van 20.000 xg gedurende 20 min aan membranen pellet. 100.000 xg gedurende 10 - 20 minuten is gebruikt in de papieren van de Brown en Goldstein laboratorium 15. - Incubeer het membraan fractie bij 37 ° C gedurende 30 minuten en bepaal de proteïneconcentratie door Bradford eiwitbepaling. Voeg 1 pl 100x broomfenolblauw oplossing vóór het onderwerpen van de monsters aan SDS-PAGE.
- Load 25-50 ug totaal membraaneiwitten op een 10% SDS-PAGE gel 39. Voer het gelbij 80 V gedurende 15 minuten, dan veranderen tot 130 V en uit te voeren voor een ander 115 min. Transfer bij 140 mA gedurende 130 min 39.
- Voor Western blot analyse gebruik van anti-SCAP antilichaam aan het totale SCAP eiwit detecteren. Gebruik eiwit-isomerase (PDI), een ER-resident-eiwit 40, als een interne controle. Met anti-SREBP-1 antilichaam aan het N-terminale groep SREBP-1 te detecteren. Gebruik Lamin A als een interne controle voor nucleaire extracten 31.
2. Analyse van SCAP N -glycosylation in menselijke cellen
- Celkweek, transfectie en behandeling
- Voor membraan analyse zaad ~ 1 x 10 6 HEK293T cellen in een 10 cm schaal met DMEM aangevuld met 5% FBS en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor transfectie.
- Verdunnen 4-8 ug GFP-SCAP plasmide (een gift van Dr. Peter Espenshade) 22 in 1 ml gereduceerd serum medium en meng voorzichtig.
- Voeg 8-16 ul DNA transfectiereagens door direct pipetteren in de 1 ml gereduceerd serum medium dat plasmiden en meng voorzichtig.
- Incubeer de transfectiereagens / plasmide complex gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg transfectie complex aan de cellen met vers medium en blijven kweek gedurende 24 uur bij 5% CO2 en 37 ° C.
- Was eenmaal met PBS en behandeling van de cellen gedurende 12 uur met of zonder glucose (5 mM) in aanwezigheid of afwezigheid van tunicamycine (1 ug / ml), een N -glycosylation inhibitor.
- Bereid celmembraan pellets zoals beschreven in de stappen 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 en 1.2.7.
- Detectie van SCAP N -glycosylation
- trypsine Proteolyse
- Resuspendeer het membraan pellets uit cellen tot overexpressie GFP-SCAP in 114 pl buffer die 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium EDTA en 100 mM NaCl.
- Incubate 5781, l aliquots van membraaneiwitten in afwezigheid of aanwezigheid van 1 pl trypsine (1 pg / pl), in een totaal volume van 58 ui, gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
- Stop de reacties door toevoegen van 2 pl (400 eenheden) sojaboon trypsineremmer.
- Deglycosylatie door peptide-N- glycosidase F (PNGase F)
- Met aansluitende behandeling met PNGase F, voeg 10 ul oplossing die 3,5% (gew / vol) SDS en 7% (vol / vol) 2-mercaptoethanol aan elk monster.
- Na verwarmen bij 100 ° C gedurende 10 min, achtereenvolgens voeg 7 pl 0,5 M natriumfosfaat (pH 7,5), 7 gl 10% (v / v) Nonidet P-40 met 12 × proteaseremmers, en 2 ui (0,5 U / pl) van PNGase F.
- Na incubatie bij 37 ° C gedurende 3 uur, stop reactie door de toevoeging van 5 x laadbuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol en 0,05% broomfenolblauw). Verwarm het mengsel bij 100 ° C gedurende 10 min en onderworpen aan SDS-PAGE. Laad 25-50 ug totaal membraaneiwitten op een 10% SDS-PAGE gel 39. Voer de gel bij 80 V gedurende 15 minuten, dan veranderen tot 130 V voor nog eens 115 min. Transfer bij 140 mA gedurende 130 min.
- Voor de Western blot gebruikt 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) antilichaam tegen N -glycosylation en totale SCAP eiwit detecteren.
- trypsine Proteolyse
3. Detectie van SCAP Trafficking van ER naar het Golgi met behulp van GFP-SCAP in menselijke cellen
- Zaad 2,5 x 10 5 U87 cellen in een 60 mm schaal met DMEM aangevuld met 5% FBS en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor transfectie.
- Verdun 4 ug GFP-SCAP plasmide in 0,5 ml gereduceerd serum medium en meng.
- Voeg 8 ul DNA transfectiereagens door pipetteren direct in 0,5 ml gereduceerd serum medium dat plasmiden en meng voorzichtig.
- Incubeer de transfectiereagens / plasmide complex gedurende 25 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur.
- Voeg transfectie complex aan de cellen met vers medium en blijven kweek gedurende 24 uur bij 5% CO2 en 37 ° C.
- Reseed 5-10 x 10 4 cellen in een 6-wells plaat met een dekglaasje (22 mm x 22 mm) en verder kweken bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Was eenmaal met PBS en behandeling van de cellen gedurende 12 uur met of zonder glucose (5 mM) in aanwezigheid of afwezigheid van tunicamycine (1 ug / ml).
- Was de cellen eenmaal met PBS en fixeer 4% formaldehyde gedurende 10 minuten.
- Was de cellen drie keer met PBS, keren de dekglaasjes, monteren op dia's samen met antifade reagens, en sluit de dekglaasjes met behulp van nagellak.
- Controleer de GFP-SCAP handel met behulp van een 63x olie-immersie objectief in een laser scanning confocale microscoop 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de detectie van endogene SCAP eiwit en SREBP-1 nucleair vorm humane glioblastoma U87 cellen als reactie op stimulatie met glucose western blot. Het membraaneiwit SCAP wordt gedetecteerd in de "membraanfractie". De kern vorm (N-terminale) van SREBP-1 gedetecteerd in de "nucleaire extracten". Het niveau van SCAP eiwit (PDI fungeert als een interne controle van ER membraaneiwitten) en SREBP-1 nucleair vorm worden aanzienlijk verbeterd door glucosestimulatie. Deze resultaten demonstreren dat het protocol kan de endogene SCAP eiwit in menselijke cellen te detecteren.
Figuur 2 toont de analyse van SCAP N -glycosylation en totale GFP-SCAP eiwitniveaus in reactie op stimulatie en tunicamycine behandeling bij HEK293T cellen glucose expressie-GFP gemerkte hamster SCAP. Cijfer
Figuur 3 toont dat GFP-SCAP handel van het ER naar het Golgi als reactie op stimulatie glucose werd onderdrukt door tunicamycine behandeling U87 cellen. Zoals getoond in figuur 3A, confocale microscopie beelden tonen dat GFP-eiwit SCAP ligt in het ER in afwezigheid van glucose, zoals blijkt uit de co-lokalisatie met PDI, een ER-resident proteïne (rood). Daarentegen in de aanwezigheid van glucose, GFP-SCAP verplaatst naar de Golgi, getoond door de co-lokalisatie met het Golgi eiwitmerker Giantin (rood) (Figuur 3B). Bovendien tunicamycinebehandeling onderdrukt door glucose geïnduceerde transport van GFP-SCAP van het ER naar het Golgi (figuur 3A en B).
Figuur 1. Detectie van endogene SCAP eiwit en SREBP-1 Nuclear Vorm U87 cellen. Western blot analyse van membraan en nucleaire extracten van humane primaire glioblastoom U87 cellen gekweekt in serumvrij medium met of zonder glucose (5 mM) gedurende 12 uur. Anti-SCAP antilichaam tegen humaan SCAP aa 450-500 werd gebruikt om de endogene SCAP in menselijke cellen te detecteren. De actieve vorm (N-terminale) van SREBP-1 gedetecteerd in de "nucleaire extracten" met antilichaam tegen het aa 301-407 fragment van humaan SREBP-1. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van 31. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.
Figuur 2. Western blot analyse van SCAP N -glycosylation en GFP-SCAP eiwitniveau. A) Schematische weergave van de structuur SCAP spanning steek de ER membraan. Er zijn drie asparagine (N) residuen in SCAP, die verblijven in het ER lumen en worden gemodificeerd door N-gekoppelde oligosacchariden. Het fragment van SCAP aminozuren 540-707 is bestand tegen trypsinedigestie. Het bevat twee N-gekoppelde oligosaccharide modificatie stallen, N590 en N641, die door IgG-antilichaam 9D5 kan worden gedetecteerd tegen de aa 540-707 van hamster SCAP door Western blot B) Western blot analyse van SCAP N -glycosylation (bovenste:. Met trypsine behandeling) of GFP-SCAP eiwit niveaus (lager: geen trypsine behandeling) van HEK293T cellen transiently getransfecteerd met GFP-SCAP voor 24 uur en vervolgens gekweekt in serumvrij medium met of zonder glucose (5 mM) in aanwezigheid of afwezigheid van tunicamycine (1 ug / ml), een N -glycosylation remmer gedurende 12 uur. De nummers op de linkerkant van de vlek geven het aantal N -glycosylation sites op SCAP eiwit (N590 en N641 sites) (boven, gedetecteerd door IgG-9D5 antilichaam). Onderpaneel voor GFP-SCAP werd gedetecteerd met een antilichaam tegen eiwit GFP. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Detectie van SCAP handel van het ER naar het Golgi. A, B) Confocale microscopie beelden tonen aan dat GFP-SCAP ligt in het ER of verplaatst naar tHij Golgi in afwezigheid of aanwezigheid van glucose (5 mM) met / zonder tunicamycine (1 ug / ml) behandeling U87 cellen gedurende 12 uur. PDI toont ER kleuring (rood) (A). Giantin, de Golgi markering (rood) (B). DAPI (blauw) kleurt de celkern. De omvang balken geven 10 urn. Figuur 3A is nieuwe gegevens en is niet eerder gepubliceerd. Figuur 3B is gewijzigd met toestemming van 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we een protocol voor de isolatie van membraanfracties in menselijke cellen en voor de bereiding van de monsters voor de detectie van SCAP N -glycosylation en totaal eiwit door Western blot. Wij bieden verder een methode om SCAP mensenhandel te controleren met behulp van GFP-etikettering en confocale microscopie. De methode wordt specifiek gebruikt om membraaneiwit te analyseren en is een belangrijk instrument om SCAP N -glycosylation en mensenhandel te onderzoeken.
In vergelijking met de methode met behulp van verschillende lectinen om verschillende N-glycan ketens te herkennen en identificeren van N -glycosylated eiwitten 42, ons hier beschreven methode maakt gebruik van PNGase F to-eiwit gekoppelde N-glycan te verwijderen en detecteert de migratie verschuiving naar de glycosylering van eiwitten SCAP fragment te identificeren aa 540-707. De beperking van de lectine werkwijze is afhankelijk van de identificatie van het juiste type lectine tot de specifieke herkennen
In deze studie werd het plasmide van GFP-gelabelde SCAP gebruikt voor de analyse van N -glycosylation en handel in menselijke cellen is hamster-afkomst. SCAP antilichaam (IgG-9D5) die is opgewekt tegen de aminozuren 540-707 fragment van SCAP eiwit alleen het proteïne en N -glycosylation van de hamster SCAP, zoals de Chinese hamster ovarium (CHO) cellijn 15 detecteren. Het antilichaam tegen aminozuren 450-500 van humaan SCAP kan de endogene SCAP eiwit te detecteren in menselijke cellen, zie figuur 1 Aan SCAP N -glyco detecteren.sylation in menselijke cellen of weefsels, moeten we een specifiek antilichaam te ontwikkelen tegen de aminozuren 540-707 fragment van de menselijke SCAP. Bovendien identificatie van een specifiek lectine herkennen SCAP-gebonden N-glycan is een alternatieve manier om menselijke SCAP N -glycosylation 42 analyseren. Bovendien is het bepalen van de samenstelling en structuur van elk N-glycan keten verbindend in SCAP (N263, N590 en N641) zal ons begrip van het onderliggende mechanisme van SCAP mensenhandel uit het ER naar het Golgi te vergemakkelijken.
Bovendien worden de beste resultaten voor de detectie van SCAP N -glycosylation verkrijgen, werd gecorrigeerd aantal reactieparameters volgens onze experimentele omstandigheden, die gemodificeerd op de in de publicaties van Brown en Goldstein Laboratory 15 beschreven werkwijzen. Om succesvol detecteren SCAP eiwit en de N -glycosylation, de kwaliteit van het membraan fracties en nucleaire extracten belangrijke. We direct bepaald de eiwitconcentratie na de membraanfracties geïncubeerd bij 37 ° C, het vermijden waardoor de sample op ijs. De hier beschreven methode op grote schaal kunnen worden toegepast op verschillende vakgebieden, zoals kanker, hart- en vaatziekten, diabetes en obesitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
