Summary
Se describe un método modificado para el aislamiento de la fracción de membrana a partir de células humanas y de preparación de muestras para la detección de -glycosylation SCAP N y la proteína total mediante el uso de transferencia Western. Se introduce además un método de GFP-etiquetado para monitorear el tráfico de SCAP mediante microscopía confocal. Este protocolo se puede utilizar en los laboratorios de biología regulares.
Introduction
La desregulación del metabolismo de los lípidos es una característica común de cáncer y enfermedades metabólicas 1-6. En estos procesos, las proteínas reguladoras de unión al elemento de esterol-(SREBPs), una familia de factores de transcripción, juegan un papel crítico en el control de la expresión de genes importantes para la absorción y síntesis de colesterol, ácidos grasos, fosfolípidos y 7-10.
SREBPs, incluyendo SREBP-1a, SREBP-1c, y SREBP-2, se sintetizan como precursores inactivos que se unen a la membrana del retículo endoplásmico (ER) en virtud de dos dominios transmembrana 7. La N-terminal de SREBPs contiene un dominio de unión a ADN para la transactivación de genes diana 11. El C-terminal de los precursores de SREBP une a la proteína SREBP escisión activadora (SCAP) 12,13, una proteína de membrana politópica que juega un papel fundamental en la regulación de la estabilidad y la activación SREBP 14-16.
la eje-tación de la función de la transcripción requiere la translocación del complejo SCAP / SREBP desde el RE al aparato de Golgi, donde dos proteasas escinden secuencialmente SREBP y liberan su fragmento N-terminal, que entra entonces en el núcleo para la transactivación de genes lipogénicos 7. En estos procesos, los niveles de esteroles en la membrana del ER controlan la salida del complejo SCAP / SREBP del ER 7,17. Bajo condiciones de alta esterol, esterol se une a SCAP o ER-residente inducida por insulina gen de la proteína-1 (Insig-1) o -2 (Insig-2), la mejora de la asociación de SCAP con Insigs que mantengan el complejo SCAP / SREBP en el ER 18-20. Cuando los niveles de esteroles disminuyen, SCAP se disocia con Insigs. Esto conduce a un cambio conformacional SCAP, que permite la interacción con proteínas de la cubierta SCAP comunes complejo (COP) II. El complejo media la incorporación del SCAP / SREBP en las vesículas en ciernes y dirige su transporte desde el ER al Golgi 21,22. Al TransLocación al Golgi, SREBPs se escinden secuencialmente por Site-1 y Site-2 proteasas, lo que conduce a la liberación de la N-terminal 7,23-29.
Proteína SCAP lleva tres oligosacáridos N -vinculada a asparagina (N) posiciona N263, N590, N641 y 15. Recientemente hemos revelado que la glucosa mediada por N -glycosylation de SCAP en estos sitios es una condición previa para el tráfico de SCAP / SREBP desde el RE hasta el aparato de Golgi en condiciones de esterol bajas 30-32. La pérdida de la glicosilación SCAP a través de la mutación de los tres asparagina a glutamina (NNN a QQQ) desactiva el tráfico del complejo SCAP / SREBP y los resultados en la inestabilidad de la proteína SCAP y la reducción de la activación de SREBP 31. Nuestros datos recientes también demuestran que SREBP-1 es muy activa en el glioblastoma y regulada por SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Orientación / SREBP-1 de señalización SCAP está emergiendo como una nueva estrategia para el tratamiento de tumores malignos y s metabólicosyndromes 1,3,35-38. Por lo tanto, es importante desarrollar un método eficaz para analizar los niveles de proteína SCAP y N -glycosylation y supervisar su tráfico de células y tejidos humanos de pacientes.
La región luminal de proteínas SCAP (aminoácidos 540-707) en el RE contiene dos sitios -glycosylation N (N590 y N641) que están protegidas de proteólisis cuando las membranas intactas se tratan con tripsina 15. Este fragmento luminal tiene un peso molecular de ~ 30 kDa que es lo suficientemente pequeño como para permitir la resolución de las variantes glicosiladas individuales de SCAP por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) 15,31. A continuación, se proporciona un método para detectar N -glycosylation de SCAP y la proteína total en las células humanas. Este protocolo se deriva del método descrito en las publicaciones del laboratorio de Brown y Goldstein 15 y nuestra reciente publicación 31. El protocolo puede ser utilizado en tél estudio de la proteína SCAP a partir de células de mamíferos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteína La detección de SCAP endógena en las células humanas
- Cultivo Celular y Tratamiento
- Células de semillas ~ 1 × 10 6 U87 en un plato de 10 cm con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes del tratamiento.
- Lavar las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación, cambiar las células a medio DMEM fresco con o sin glucosa (5 mM) durante 12 horas.
- Preparación de la Membrana Celular fracciones y extractos nucleares
- Lavar las células una vez con PBS, raspan en 1 ml de PBS, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en un tampón enfriado con hielo que contiene 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, ácido etilendiaminotetraacético de sodio 1 mM (EDTA), ácido etileno sodio glicol tetraacético 1 mM (EGTA), 250 mM sacarosa, y una mezcla de inhibidores de proteasa (5 μg / ml de pepstatina A, 10 mg / ml de leupeptina, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), ditiotreitol 1 mM (DTT), y 25 mg / ml N-acetil-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) durante 30 min sobre hielo.
- Pasar los extractos celulares a través de un 22 G x 1 1/2 de aguja 30 veces y centrifugar a 890 xg a 4 ° C durante 5 minutos para aislar los núcleos.
- Usar el sobrenadante para la separación de fracciones de membrana (etapa 1.2.7). Resuspender el sedimento nuclear en 0,1 ml de tampón C (HEPES 20 mM / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v /) de glicerol v, MgCl 1,5 mM 2, EDTA de sodio 1 mM, EGTA sódico 1 mM y una mezcla de inhibidores de proteasa (5 mg / ml de pepstatina A, 10 mg / ml de leupeptina, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, y 25 mg / ml ALLN)).
- Girar la suspensión a 4 ° C durante 60 min y se centrifuga a 20.000 xg en una microcentrífuga durante 20 min a 4 ° C. El sobrenadante se designa como "extractos nucleares".
- Calentar los extractos nucleares de 100 ° C durante 10 min con tampón 5x de carga (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol, y 0,05% de azul de bromofenol) antes de someter a SDS-PAGE.
- Centrifugar el sobrenadante de la original giro 890 xg a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Para el análisis de transferencia de western posterior, disolver el precipitado en 0,1 ml de tampón SDS de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, NaCl 100 mM, 1% (v / v) de dodecilsulfato de sodio (SDS), EDTA de sodio 1 mM, y 1 mM EGTA de sodio). Esto se denomina "fracción de membrana".
NOTA: Utilizamos 20.000 xg durante 20 minutos para sedimentar las membranas. 100.000 xg durante 10 - 20 min se ha utilizado en los papeles del laboratorio de Brown y Goldstein 15. - Incubar la fracción de membrana a 37 ° C durante 30 min y determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteína de Bradford. Añadir 1 l de solución de azul de bromofenol 100x antes de someter las muestras a SDS-PAGE.
- Carga 25 - 50 g de proteínas totales de la membrana en un gel de SDS-PAGE 10% 39. Dejar correr el gela 80 V durante 15 minutos, a continuación, cambie a 130 V y una duración de 115 min otra. Transferir a 140 mA durante 130 min 39.
- Para el análisis de transferencia de Western, utilice anticuerpo anti-SCAP para detectar la proteína total SCAP. Utilice proteína disulfuro isomerasa (PDI), una proteína de ER-residente 40, como un control interno. Utilice anti-SREBP-1 anticuerpo para detectar la banda N-terminal de SREBP-1. Utilice Lamin A como un control interno para los extractos nucleares 31.
2. Análisis de SCAP N -glycosylation en células humanas
- Cultivo celular, transfección, tratamiento y
- Para el análisis de la membrana, las células de semilla de ~ 1 × 10 6 HEK293T en un plato de 10 cm con DMEM suplementado con 5% de FBS y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes de la transfección.
- Diluir 4 - 8 g de GFP-SCAP plásmido (un regalo del doctor Peter Espenshade) 22 en 1 ml de suero reducido a medio y mezclar suavemente.
- Añadir 8 - 16 de l reactivo de transfección de ADN con la pipeta directamente en los 1 ml reducidos medio que contiene suero plásmidos y mezclar suavemente.
- Incubar el complejo reactivo / plásmido de transfección durante 25 min a temperatura ambiente.
- Añadir complejo de transfección a las células con medio fresco y continuar a la cultura de 24 horas a 5% de CO2 y 37 ° C.
- Lavar una vez con PBS y el tratamiento de las células durante 12 h con o sin glucosa (5 mM) en presencia o ausencia de tunicamicina (1 mg / ml), un inhibidor de la N -glycosylation.
- Preparar los sedimentos de membrana celular como se describe en los puntos 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, 1.2.7 y.
- La detección de SCAP N -glycosylation
- La proteólisis tripsina
- Resuspender los sedimentos de membrana a partir de células que sobreexpresan GFP-SCAP en 114 l de tampón que contiene 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), KCl 10 mM, MgCl mM 2, EDTA de sodio 1,5 1 mM, y NaCl 100 mM.
- incubar 5781; l alícuotas de proteínas de la membrana en la ausencia o presencia de 1 l de tripsina (1 mg / l), en un volumen total de 58 l, durante 30 minutos a 30 ° C.
- Deja de reacciones mediante la adición de 2 l (400 unidades) de inhibidor de tripsina de soja.
- La desglicosilación por péptido N- glicosidasa F (PNGasa F)
- Para el tratamiento posterior con PNGasa F, añadir 10 l de solución que contenía 3,5% (peso / vol) SDS y 7% (vol / vol) 2-mercaptoetanol a cada muestra.
- Después de calentar a 100 ° C durante 10 min, añadir secuencialmente 7 l de fosfato de sodio 0,5 M (pH 7,5), 7 l de 10% (v / v) de Nonidet P-40 con inhibidores de 12 × de la proteasa, y 2 l (0,5 U / l) de PNGasa F.
- Después de incubación a 37 ° C durante 3 hr, detener las reacciones mediante la adición de tampón 5x de carga (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol, y 0,05% de azul de bromofenol). Calentar las mezclas a 100 ° C durante 10 my está sujeto a SDS-PAGE. Load 25-50 g de proteínas totales de la membrana en un gel de SDS-PAGE 10% 39. Correr el gel a 80 V durante 15 minutos, a continuación, cambie a 130 V para otro 115 min. Transferir a 140 mA durante 130 min.
- Para el Western blot, utilizar anticuerpos 10 mg / ml de anti-SCAP (9D5) para detectar N -glycosylation y proteínas totales SCAP.
- La proteólisis tripsina
3. Detección de SCAP Trata de ER al Golgi mediante el uso de GFP-SCAP en células humanas
- Seed 2,5 × 10 5 células U87 en un plato de 60 mm con DMEM suplementado con 5% de FBS y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes de la transfección.
- Diluir 4 g de plásmido GFP-SCAP en 0,5 ml de suero reducido a medio y mezclar.
- Añadir 8 l de reactivo de transfección de ADN con la pipeta directamente en 0,5 ml de medio de suero reducido que contiene plásmidos y mezclar suavemente.
- Incubar el complejo reactivo / plásmido de transfección durante 25 min a la habitacióntemperatura.
- Añadir complejo de transfección a las células con medio fresco y continuar a la cultura de 24 horas a 5% de CO2 y 37 ° C.
- Reseed 5 - 10 × 10 4 células en una placa de 6 pocillos que contiene una hoja de cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm) y seguir cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 horas.
- Lavar una vez con PBS y el tratamiento de las células durante 12 h con o sin glucosa (5 mM) en presencia o ausencia de tunicamicina (1 mg / ml).
- Lavar las células una vez con PBS y fijar en 4% de formaldehído durante 10 min.
- Lavar las células tres veces con PBS, invertir los cubreobjetos, montar en portaobjetos junto con antifade reactivo, y sellar el cubreobjetos usando esmalte de uñas.
- Compruebe el tráfico de GFP-SCAP utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63X en un microscopio confocal de barrido láser 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 muestra la detección de proteína SCAP endógeno y SREBP-1 forma nuclear en las células de glioblastoma U87 humanos en respuesta a la estimulación de glucosa mediante el uso de transferencia Western. El SCAP proteína de membrana se detecta en la "fracción de membrana". La forma de núcleo (N-terminal) de SREBP-1 se detecta en los "extractos nucleares". El nivel de proteína SCAP (PDI sirve como un control interno de las proteínas de membrana ER) y SREBP-1 forman nucleares son notablemente mejorada por la estimulación de la glucosa. Estos resultados demuestran que el protocolo es capaz de detectar la proteína SCAP endógeno en células humanas.
La Figura 2 muestra el análisis de -glycosylation SCAP N y los niveles totales de proteína GFP-SCAP en respuesta a la estimulación de glucosa y el tratamiento tunicamicina en células HEK293T que expresan GFP-etiquetados SCAP hámster. La figura
La Figura 3 muestra que el tráfico de GFP-SCAP desde el RE al aparato de Golgi en respuesta a la estimulación de glucosa fue suprimida por el tratamiento tunicamicina en células U87. Como se muestra en la Figura 3A, las imágenes de microscopía confocal muestran que la proteína GFP-SCAP reside en el ER en ausencia de glucosa, como se muestra por su co-localización con PDI, una ER-residente proteína (rojo). Por el contrario, en presencia de glucosa, GFP-SCAP se mueve al Golgi, que se muestra por la co-localización con el aparato de Golgi marcador de proteína Giantin (rojo) (Figura 3B). Por otra parte, la tunicamicinatratamiento suprime el tráfico inducida por glucosa de GFP-SCAP desde el RE al aparato de Golgi (Figura 3A y B).
Figura 1. Detección de proteína endógena SCAP y Forma Nuclear en células U87. El análisis de transferencia Western de la membrana y los extractos nucleares de células U87 de glioblastoma primario humanas cultivadas en medio libre de suero con o sin glucosa (5 mM) durante 12 hr 1 SREBP-. El anticuerpo anti-SCAP contra aa SCAP humana 450-500 se utilizó para detectar el SCAP endógeno en células humanas. La forma activa (N-terminal) de SREBP-1 se detecta en los "extractos nucleares" usando anticuerpo contra el aa 301-407 fragmento de SREBP-1 humano. Esta cifra se ha modificado con el permiso de 31. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandesel de esta figura.
Figura 2. Análisis de Western Blot de SCAP N -glycosylation y los valores de proteína GFP-SCAP. A) Diagrama esquemático que muestra la estructura SCAP Spanning cruzar la membrana del RE. Hay tres asparagina (N) residuos en SCAP, todas las cuales residen en el lumen del RE y son modificados por oligosacáridos unidos a N. El fragmento de SCAP que contiene los aminoácidos 540-707 es resistente a la digestión con tripsina. Contiene dos pocilgas N-ligado de modificación de oligosacáridos, N590 y N641, que pueden ser detectados por el anticuerpo IgG-9D5 contra el aa 540 a 707 de hámster SCAP por Western blot B) Análisis de transferencia Western de SCAP N -glycosylation (superior:. Con tratamiento con tripsina) o los niveles de proteína GFP-SCAP (inferior: sin tratamiento con tripsina) a partir de células HEK293T transiently transfectadas con GFP-SCAP durante 24 horas y después se cultivaron en medio libre de suero con o sin glucosa (5 mM) en presencia o ausencia de tunicamicina (1 mg / ml), un inhibidor de N -glycosylation, por 12 hr. Los números en el lado izquierdo de la blot indican el número de sitios -glycosylation N en la proteína SCAP (N590 y N641 sitios) (superior, detectada por el anticuerpo IgG-9D5). El panel inferior para GFP-SCAP fue detectado por un anticuerpo contra la proteína GFP. Esta cifra se ha modificado con el permiso de 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Detección de la trata SCAP desde el RE al aparato de Golgi. A, B) Imágenes de microscopía confocal demuestran que GFP-SCAP reside en el ER o mueve a tél Golgi en ausencia o presencia de glucosa (5 mM) con / sin tunicamicina (1 mg / ml) de tratamiento en las células U87 de 12 hr. PDI muestra la tinción ER (rojo) (A). Giantin, el marcador de Golgi (rojo) (B). DAPI (azul) tiñe el núcleo de la célula. Las barras de escala representan 10 micras. La figura 3A es nuevos datos y no ha sido publicado con anterioridad. Figura 3B se ha modificado con el permiso de 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este estudio, se describe un protocolo para el aislamiento de fracciones de membrana en las células humanas y para la preparación de las muestras para la detección de -glycosylation SCAP N y la proteína total mediante el uso de transferencia Western. Se proporciona además un método para controlar el tráfico de SCAP mediante el uso de GFP-etiquetado y microscopía confocal. El método se utiliza específicamente para analizar las proteínas de membrana y es una herramienta importante para investigar SCAP N -glycosylation y el tráfico.
En comparación con el método que utiliza varias lectinas de reconocer diferentes cadenas -glycan N y N identificar proteínas -glycosylated 42, nuestro método descrito aquí utiliza PNGasa F para eliminar la proteína ligada a N -glycan y detecta el cambio de migración para identificar la glicosilación de fragmento de proteína SCAP aa 540-707. La limitación del método de lectina depende de la identificación del tipo apropiado de lectina de reconocer la específica
En este estudio, el plásmido de SCAP GFP marcado utilizado para el análisis de N -glycosylation y el tráfico en las células humanas es hámster origen. Anticuerpo SCAP (IgG-9D5) que se eleva contra los aminoácidos 540 a 707 fragmento de la proteína SCAP sólo pueden detectar la proteína y N -glycosylation del SCAP hámster, tal como en el de ovario de hámster chino línea celular (CHO) 15. El anticuerpo contra los aminoácidos 450 a 500 de SCAP humano es capaz de detectar la proteína SCAP endógena en las células humanas, como se muestra en la Figura 1 Para detectar SCAP N -glyco.sylation en las células o tejidos humanos, tenemos que desarrollar un anticuerpo específico contra los aminoácidos 540 - 707 fragmento del SCAP humano. Además, la identificación de una lectina específica para reconocer SCAP unida a N -glycan es una forma alternativa de analizar humanos SCAP N -glycosylation 42. Por otra parte, la definición de la composición y estructura de cada cadena -glycan N unión en SCAP (N263, N590 y N641) facilitarán la comprensión de los mecanismos subyacentes de la trata SCAP desde el RE hasta el aparato de Golgi.
Por otra parte, para obtener los mejores resultados para la detección de SCAP N -glycosylation, hemos ajustado algunos parámetros de reacción de acuerdo con nuestras condiciones experimentales, que se modifican a partir de los métodos descritos en las publicaciones de la Brown y Goldstein Laboratorio 15. Para detectar con éxito la proteína SCAP y su -glycosylation N, la calidad de las fracciones de membrana y extractos nucleares son muy importantes. Se determinó directamente la concentración de proteína después de que las fracciones de membrana se incubaron a 37 ° C, evitando poner la muestra de nuevo en hielo. El método descrito aquí puede ser ampliamente aplicada a diferentes campos de la investigación, incluyendo el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y la obesidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
