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Biology

SCAP का विश्लेषण Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Radiation Oncology, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center and College of Medicine

Summary

हम पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके SCAP एन -glycosylation और कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए मानव कोशिकाओं से झिल्ली अंश अलगाव और नमूना तैयार करने के लिए एक संशोधित विधि का वर्णन है। हम आगे confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग SCAP की तस्करी की निगरानी के लिए एक GFP लेबलिंग विधि का परिचय। इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

लिपिड चयापचय की ढील कैंसर और चयापचय रोगों 1-6 की एक आम लक्षण है। इन प्रक्रियाओं में, स्टेरोल नियामक तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (SREBPs), प्रतिलेखन कारक के एक परिवार, तेज और कोलेस्ट्रॉल, फैटी एसिड के संश्लेषण, और फॉस्फोलिपिड 7-10 के लिए महत्वपूर्ण जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

SREBP -1 ए, SREBP -1 सी, और SREBP -2 सहित SREBPs, निष्क्रिय व्यापारियों है कि दो transmembrane डोमेन 7 के आधार पर जालिका (ईआर) झिल्ली के लिए बाध्य के रूप में संश्लेषित कर रहे हैं। SREBPs के एन टर्मिनस लक्ष्य जीन 11 की transactivation के लिए एक डीएनए बाध्यकारी डोमेन होते हैं। SREBP व्यापारियों की सी टर्मिनस SREBP दरार सक्रिय प्रोटीन (SCAP) 12,13, एक polytopic झिल्ली प्रोटीन है कि SREBP स्थिरता और सक्रियण 14-16 के नियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाता को बांधता है।

implemenट्रांसक्रिप्शनल समारोह के tation Golgi, जहां दो proteases क्रमिक रूप से SREBP फोड़ना और उसके एन टर्मिनल टुकड़ा है, जो तब lipogenic जीन 7 की transactivation के लिए नाभिक में प्रवेश करती जारी करने के लिए ईआर से SCAP / SREBP परिसर के translocation की आवश्यकता है। इन प्रक्रियाओं में, ईआर झिल्ली में sterols के स्तर को ईआर 7,17 से SCAP / SREBP परिसर के बाहर निकलने के नियंत्रित करते हैं। उच्च sterol शर्तों के तहत, sterol SCAP या ईआर निवासी को बांधता है इंसुलिन प्रेरित जीन प्रोटीन -1 (Insig -1) या -2 (Insig -2), Insigs कि में SCAP / SREBP जटिल बनाए रखने के साथ SCAP के सहयोग को बढ़ाने ईआर 18-20। sterol का स्तर कम होता है, SCAP Insigs साथ विघटित। यह एक SCAP गठनात्मक परिवर्तन है, जो आम कोट प्रोटीन (पुलिस) द्वितीय परिसर के साथ बातचीत की अनुमति देता SCAP की ओर जाता है। जटिल नवोदित vesicles में SCAP / SREBP परिसर का समावेश मध्यस्थता और Golgi 21,22 करने के लिए ईआर से अपने परिवहन निर्देशन। transloc परGolgi को समझना, SREBPs क्रमिक रूप से साइट -1 और साइट -2 proteases से चिपके रहते हैं, के एन टर्मिनस 7,23-29 रिहाई के लिए अग्रणी।

SCAP प्रोटीन तीन एन asparagine पर से जुड़े oligosaccharides किया जाता है (एन) N263, N590, N641 और 15 पदों। हमने हाल ही में पता चला है कि इन साइटों में SCAP की ग्लूकोज की मध्यस्थता एन -glycosylation कम sterol शर्तों के तहत 30-32 Golgi को ईआर से SCAP / SREBP की तस्करी के लिए एक शर्त शर्त है। Glutamine (एनएनएन QQQ करने के लिए) के लिए सभी तीन asparagine के उत्परिवर्तन के माध्यम से SCAP ग्लाइकोसिलेशन की हानि SCAP / SREBP जटिल और SCAP प्रोटीन और SREBP सक्रियण 31 की कमी की अस्थिरता में परिणामों की तस्करी निष्क्रिय करता है। हमारे हाल के आंकड़े यह भी कि SREBP-1 है अत्यधिक glioblastoma में सक्रिय और SCAP एन -glycosylation 4,31,33,34 द्वारा नियंत्रित किया जाता है प्रदर्शित करता है। लक्ष्य निर्धारण SCAP / SREBP -1 संकेतन एक नई रणनीति कैंसर और चयापचय रों इलाज के रूप में उभर रहा हैyndromes 1,3,35-38। इसलिए, यह SCAP प्रोटीन और एन -glycosylation स्तर का विश्लेषण और मानव कोशिकाओं और मरीज के ऊतकों में इसकी तस्करी को नजर रखने के लिए एक प्रभावी तरीका विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

ईआर में SCAP प्रोटीन (अमीनो एसिड 540-707) के ल्यूमिनल क्षेत्र दो एन -glycosylation साइटों (N590 और N641) कि प्रोटियोलिसिस से संरक्षित कर रहे हैं जब बरकरार झिल्ली trypsin 15 के साथ व्यवहार कर रहे हैं शामिल हैं। इस ल्यूमिनल टुकड़ा ~ 30 केडीए के एक आणविक वजन है कि काफी छोटा SCAP के व्यक्तिगत ग्लाइकोसिलेटेड वेरिएंट का संकल्प सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) 15,31 द्वारा अनुमति देने के लिए है। यहाँ, हम Scap के एन -glycosylation और मानव कोशिकाओं में कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल विधि ब्राउन और गोल्डस्टीन प्रयोगशाला 15 और हमारे हाल ही में प्रकाशन के 31 से प्रकाशनों में वर्णित से ली गई है। प्रोटोकॉल टी में इस्तेमाल किया जा सकतावह स्तनधारी कोशिकाओं से SCAP प्रोटीन का अध्ययन करते हैं।

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Protocol

1. मानव कोशिकाओं में अंतर्जात की जांच SCAP प्रोटीन

  1. सेल संस्कृति और उपचार
    1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक के साथ एक 10 सेमी डिश में बीज ~ 1 × 10 6 U87 कोशिकाओं और उपचार से पहले 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, तो साथ या ग्लूकोज के बिना 12 घंटे के लिए (5 मिमी) ताजा DMEM मध्यम करने के लिए कोशिकाओं स्विच।
  2. सेल झिल्ली भागों और परमाणु अर्क की तैयारी
    1. धो कोशिकाओं पीबीएस के साथ एक बार, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर 1 मिलीलीटर पीबीएस में परिमार्जन, और सेंट्रीफ्यूज।
    2. एक ठंडा 10 मिमी HEPES-कोह (पीएच 7.6), 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी सोडियम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1 मिमी सोडियम एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड (EGTA), 250 मिमी युक्त बफर में Resuspend कोशिकाओं सूक्रोज, और प्रोटीज अवरोधकों का एक मिश्रण (5 μजी / मिलीलीटर pepstatin ए, 10 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin, 0.5 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), और 25 माइक्रोग्राम / एमएल एन एसिटाइल-Leu-लियू-Norleu-अल (ALLN)) 30 मिनट के लिए बर्फ पर।
    3. सेल के अर्क के माध्यम से एक 22 जी एक्स 5 मिनट नाभिक को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 890 XG पर 1 1/2 सुई 30 बार और सेंट्रीफ्यूज गुजरती हैं।
    4. झिल्ली भिन्न (कदम 1.2.7) के अलग होने के लिए सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें। बफर सी (20 मिमी HEPES / Koh पीएच 7.6, 0.42 एम NaCl, 2.5% (वी / वी) ग्लिसरॉल के 0.1 मिलीलीटर में परमाणु गोली Resuspend, 1.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी सोडियम EDTA, 1 मिमी सोडियम EGTA और का एक मिश्रण प्रोटीज अवरोधकों (5 माइक्रोग्राम / एमएल pepstatin ए, 10 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin, 0.5 मिमी PMSF, 1 मिमी डीटीटी, और 25 माइक्रोग्राम / एमएल ALLN))।
    5. 60 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 20,000 XG पर घुमाएँ। सतह पर तैरनेवाला "परमाणु अर्क" के रूप में नामित किया गया है।
    6. 5x लोडिंग बफर के साथ 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर परमाणु अर्क गर्मी (312.5 मिमी Tris एचसीएल पीएच 6.8, 10% एसडीएस, 50% ग्लिसरॉल, 12.5% ​​β-mercaptoethanol, और 0.05% bromophenol नीला) एसडीएस पृष्ठ को subjecting से पहले।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर मूल 890 XG स्पिन से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। बाद में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, एसडीएस lysis बफर (10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 6.8, 100 मिमी NaCl, 1% (वी / वी) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 1 मिमी सोडियम EDTA के 0.1 मिलीग्राम और 1 में गोली भंग मिमी सोडियम EGTA)। यह "झिल्ली अंश" नामित किया गया है।
      नोट: हम 20,000 20 के लिए XG मिनट का उपयोग झिल्ली गोली। 100,000 10 के लिए XG - 20 मिनट ब्राउन और गोल्डस्टीन प्रयोगशाला में 15 से कागज में इस्तेमाल किया गया है।
    8. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली अंश सेते हैं और ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। एसडीएस पृष्ठ के लिए नमूने subjecting से पहले 1 μl 100x bromophenol नीले समाधान जोड़ें।
    9. एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल 39 पर 50 कुल झिल्ली प्रोटीन की माइक्रोग्राम - लोड 25। जेल चला80 वी में 15 मिनट के लिए, तो 130 वी करने के लिए बदलने के लिए और एक और 115 मिनट के लिए चला रहे हैं। 130 मिनट 39 के लिए 140 मा पर स्थानांतरण।
      1. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के लिए, कुल SCAP प्रोटीन का पता लगाने के विरोधी SCAP एंटीबॉडी का उपयोग करें। प्रोटीन डाइसल्फाइड आइसोमेरेस (PDI), एक ईआर निवासी प्रोटीन 40 उपयोग, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में। SREBP -1 के एन टर्मिनल बैंड का पता लगाने के विरोधी SREBP -1 एंटीबॉडी का उपयोग करें। परमाणु अर्क 31 के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में Lamin ए का प्रयोग करें।

2. मानव कोशिकाओं में SCAP के विश्लेषण एन -glycosylation

  1. सेल संस्कृति, अभिकर्मक, और उपचार
    1. झिल्ली विश्लेषण के लिए, DMEM के साथ एक 10 सेमी डिश में बीज ~ 1 × 10 6 HEK293T कोशिकाओं 5% FBS के साथ पूरक और अभिकर्मक से पहले 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. सीरम मध्यम कम कर 1 मिलीलीटर में 8 माइक्रोग्राम GFP-SCAP प्लाज्मिड (डॉ पीटर Espenshade से एक उपहार) 22 और धीरे मिश्रण - पतला 4।
    3. सीरम plasmids युक्त मध्यम कम कर 1 मिलीलीटर में सीधे pipetting द्वारा 16 μl डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक और धीरे मिश्रण - 8 जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक / प्लाज्मिड जटिल सेते हैं।
    5. ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं को अभिकर्मक जटिल जोड़ें और 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संस्कृति के लिए जारी है।
    6. पीबीएस के साथ एक बार धोएं और के साथ या उपस्थिति या tunicamycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल), एक एन -glycosylation अवरोध के अभाव में ग्लूकोज (5 मिमी) के बिना 12 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज।
  2. कदम 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, 1.2.7 और के रूप में वर्णित कोशिका झिल्ली छर्रों तैयार करें।
  3. SCAP एन -glycosylation की जांच
    1. trypsin प्रोटियोलिसिस
      1. 10 मिमी HEPES · KOH (7.4 पीएच), 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी सोडियम EDTA, और 100 मिमी NaCl युक्त बफर के 114 μl में GFP SCAP overexpressing कोशिकाओं से झिल्ली छर्रों Resuspend।
      2. सेते 5781; अभाव या trypsin के 1 μl (1 माइक्रोग्राम / μl) की उपस्थिति में झिल्ली प्रोटीन के एल aliquots, 30 डिग्री सेल्सियस पर 58 μl की कुल मात्रा, 30 मिनट के लिए में।
      3. सोयाबीन trypsin अवरोध के 2 μl (400 इकाइयों) के अलावा द्वारा प्रतिक्रियाओं बंद करो।
    2. Peptide- एन एफ glycosidase द्वारा Deglycosylation (PNGase एफ)
      1. PNGase एफ के साथ बाद में उपचार के लिए, जिसमें 3.5% (wt / खंड) एसडीएस और 7% (/ खंड खंड) समाधान के 10 μl प्रत्येक नमूने के लिए 2-मर्केप्टोइथेनाल जोड़ें।
      2. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद, क्रमिक रूप से 0.5 एम सोडियम फास्फेट (पीएच 7.5), 10% (वी / वी) Nonidet P-40 12 × प्रोटीज अवरोधकों के साथ, और 2 μl के 7 μl के 7 μl (0.5 यू जोड़ने / PNGase एफ के μl)
      3. 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, 5x लोडिंग बफर (312.5 मिमी Tris एचसीएल पीएच 6.8, 10% एसडीएस, 50% ग्लिसरॉल, 12.5% ​​β-mercaptoethanol, और 0.05% bromophenol नीला) के अलावा द्वारा प्रतिक्रियाओं बंद करो। 10 मीटर के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मीमें और एसडीएस पृष्ठ के अधीन। लोड 25-50 एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल 39 पर कुल झिल्ली प्रोटीन की माइक्रोग्राम। 15 मिनट के लिए 80 वी पर जेल चला, तो एक और 115 मिनट के लिए 130 वी करने के लिए बदल जाते हैं। 130 मिनट के लिए 140 मा पर स्थानांतरण।
      4. पश्चिमी धब्बा के लिए, एन -glycosylation और कुल SCAP प्रोटीन का पता लगाने के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी SCAP (9D5) एंटीबॉडी का उपयोग करें।

3. Golgi को ईआर से SCAP तस्करी की जांच मानव कोशिकाओं में GFP-SCAP का उपयोग करके

  1. बीज 2.5 × 10 5 DMEM के साथ एक 60 मिमी डिश में U87 कोशिकाओं 5% FBS के साथ पूरक और अभिकर्मक से पहले 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
  2. पतला 0.5 मिलीलीटर में 4 माइक्रोग्राम GFP-SCAP प्लाज्मिड कम हो सीरम मध्यम और मिश्रण।
  3. सीधे में 0.5 मिलीलीटर plasmids युक्त कम हो सीरम मध्यम pipetting द्वारा 8 μl डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और धीरे मिश्रण।
  4. कमरे में 25 मिनट के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक / प्लाज्मिड जटिल सेतेतापमान।
  5. ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं को अभिकर्मक जटिल जोड़ें और 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संस्कृति के लिए जारी है।
  6. 6 अच्छी तरह से थाली एक गिलास को कवर पर्ची (22 मिमी × 22 मिमी) युक्त में 10 × 10 4 कोशिकाओं और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 संस्कृति के लिए जारी - 5 Reseed।
  7. पीबीएस के साथ एक बार धोएं और के साथ या उपस्थिति या tunicamycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के अभाव में ग्लूकोज (5 मिमी) के बिना 12 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज।
  8. पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और 10 मिनट के लिए 4% formaldehyde में तय कर लो।
  9. कोशिकाओं, antifade अभिकर्मक के साथ एक साथ स्लाइड पर माउंट पीबीएस के साथ तीन बार धोएं coverslips पलटना, और नेल पॉलिश का उपयोग कर coverslips सील।
  10. एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन 41 में एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग GFP-SCAP की तस्करी की जाँच करें।

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Representative Results


चित्रा 1 पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके उत्तेजना ग्लूकोज के जवाब में अंतर्जात SCAP प्रोटीन और मानव glioblastoma U87 कोशिकाओं में SREBP -1 परमाणु फार्म का पता लगाने से पता चलता है। झिल्ली प्रोटीन SCAP "झिल्ली अंश" में पाया जाता है। SREBP -1 के नाभिक फार्म (एन टर्मिनल) "परमाणु अर्क" में पाया जाता है। SCAP प्रोटीन का स्तर और SREBP -1 परमाणु रूप में स्पष्ट रूप से ग्लूकोज उत्तेजना से बढ़ा रहे हैं (PDI ईआर झिल्ली प्रोटीन की एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है)। ये परिणाम दिखाना है कि प्रोटोकॉल मानव कोशिकाओं में अंतर्जात SCAP प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम है।


चित्रा 2 GFP लेबल हम्सटर SCAP व्यक्त HEK293T कोशिकाओं में उत्तेजना और tunicamycin उपचार ग्लूकोज के जवाब में SCAP एन -glycosylation और कुल GFP-SCAP प्रोटीन के स्तर के विश्लेषण से पता चलता। चित्रा एन -glycosylation साइटों को ले जाने ईआर झिल्ली भर SCAP प्रोटीन की विषयगत संरचना से पता चलता। 540 युक्त हूँ SCAP का टुकड़ा - 707, ईआर में 6 वें ल्यूमिनल पाश में स्थित है, trypsin प्रतिरोधी 15 है और साइटों N590 और N641 पर एन -glycosylation के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसा कि चित्र 2 बी (ऊपरी पैनल) में दिखाया गया है उपचार, अधिक वजन बैंड (540 हूँ युक्त - 707) trypsin के बाद एक या दो एन से जुड़े ग्लूकोज और PNGase के अभाव की उपस्थिति में oligosaccharides (N590 और N641) युक्त SCAP प्रोटीन का संकेत या tunicamycin (आईजीजी-9D5 एंटीबॉडी से पता चला)। PNGase एफ की उपस्थिति में, एन-लिंक्ड oligosaccharides SCAP प्रोटीन से हटा दिया गया, टुकड़ा (एए 540 - 707) के कारण तेजी से एसडीएस पृष्ठ में स्थानांतरित करने के। लगातार, पूरी तरह से tunicamycin द्वारा एन -glycosylation दीक्षा प्रक्रिया अवरुद्ध समाप्त कर दिया SCAP एन -glycosylation, एक कम की उपस्थिति ने संकेतSCAP टुकड़ा (चित्रा 2 बी, ऊपरी पैनल) के बैंड। इसके अलावा, कुल GFP-SCAP प्रोटीन (GFP के खिलाफ एक एंटीबॉडी से पता चला) ग्लूकोज के अभाव में या tunicamycin उपचार (चित्रा 2 बी, कम पैनल) के माध्यम से कम हो गया था। ये परिणाम दिखाना है कि प्रोटोकॉल SCAP एन -glycosylation के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।


चित्रा 3 से पता चलता है कि उत्तेजना ग्लूकोज के जवाब में Golgi को ईआर से GFP-SCAP की तस्करी U87 कोशिकाओं में tunicamycin उपचार द्वारा दबा दिया गया था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3 ए, confocal माइक्रोस्कोपी छवियों कि GFP-SCAP प्रोटीन, के रूप में PDI, एक ईआर निवासी प्रोटीन (लाल) के साथ अपने सह स्थानीयकरण द्वारा दिखाए गए ग्लूकोज के अभाव में ईआर में रहता दिखा। इसके विपरीत, ग्लूकोज की उपस्थिति में, GFP SCAP Golgi करने के लिए ले जाता है, Golgi प्रोटीन मार्कर Giantin (लाल) (चित्रा 3 बी) के साथ सह स्थानीयकरण द्वारा दिखाया गया है। इसके अलावा, tunicamycinउपचार Golgi (चित्रा 3 ए और बी) के लिए ईआर से दबा दिया GFP-SCAP की ग्लूकोज प्रेरित तस्करी।

आकृति 1
चित्रा 1. अंतर्जात SCAP प्रोटीन और SREBP -1 U87 कोशिकाओं में परमाणु फार्म। झिल्ली और मानव प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा U87 के साथ या ग्लूकोज के बिना 12 घंटे के लिए (5 मिमी) सीरम मुक्त मीडिया में संवर्धित कोशिकाओं से परमाणु अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की जांच। मानव SCAP हूँ 450 के खिलाफ एंटी SCAP एंटीबॉडी - 500 मानव कोशिकाओं में अंतर्जात SCAP पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। SREBP -1 के सक्रिय रूप (एन टर्मिनल) "परमाणु अर्क" में पाया हूँ 301 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर रहा है - मानव SREBP -1 के 407 टुकड़ा। यह आंकड़ा 31 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की पर।

चित्र 2
चित्रा 2. SCAP एन -glycosylation और GFP-SCAP प्रोटीन का स्तर की वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण। ए) योजनाबद्ध दिखा SCAP संरचना फैले ईआर झिल्ली को पार आरेख। वहाँ SCAP में तीन asparagine (एन) के अवशेष, जो सभी के लिए ईआर लुमेन में रहते हैं और एन-लिंक्ड oligosaccharides द्वारा संशोधित कर रहे हैं। SCAP युक्त एमिनो एसिड 540-707 का टुकड़ा trypsin पाचन के लिए प्रतिरोधी है। । यह दो एन से जुड़े oligosaccharide संशोधन sties, N590 और N641, जो हूँ 540 के खिलाफ आईजीजी 9D5 एंटीबॉडी से पता लगाया जा सकता है - 707 पश्चिमी धब्बा बी द्वारा हम्सटर SCAP) SCAP एन -glycosylation (ऊपरी के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के साथ trypsin उपचार) या GFP-SCAP प्रोटीन का स्तर (कम: HEK293T कोशिकाओं पार से कोई trypsin उपचार)iently और 24 घंटे के लिए GFP-SCAP साथ ट्रांसफ़ेक्ट तो साथ या उपस्थिति या tunicamycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल), एक एन -glycosylation अवरोध के अभाव में ग्लूकोज (5 मिमी) के बिना सीरम मुक्त मीडिया में सुसंस्कृत, 12 घंटे के लिए। दाग के बाईं ओर संख्या SCAP प्रोटीन (N590 और N641 साइटों) (ऊपरी, आईजीजी 9D5 एंटीबॉडी से पता चला) पर एन -glycosylation साइटों की संख्या से संकेत मिलता है। GFP-SCAP के लिए लोअर पैनल GFP प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी द्वारा खोजा गया था। यह आंकड़ा 31 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Golgi। ए में ईआर से SCAP तस्करी की जांच, बी) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों कि GFP-SCAP ईआर में रहता है या टी के लिए ले जाता दिखानेउन्होंने साथ / अनुपस्थिति या ग्लूकोज (5 मिमी) की उपस्थिति 12 घंटे के लिए tunicamycin (1 माइक्रोग्राम / एमएल) U87 कोशिकाओं में इलाज के बिना में Golgi। PDI ईआर धुंधला (लाल) (ए) से पता चलता है। Giantin, Golgi मार्कर (लाल) (बी)। DAPI (नीला) सेल नाभिक दाग। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 3A नए डेटा है और इससे पहले प्रकाशित नहीं किया गया है। चित्रा 3 बी 31 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम मानव कोशिकाओं में झिल्ली अंशों के अलगाव के लिए और पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके SCAP एन -glycosylation और कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए नमूने की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम आगे GFP लेबलिंग और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके SCAP की तस्करी पर नजर रखने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं। विधि विशेष झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण किया जाता है और SCAP एन -glycosylation और तस्करी की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

विधि विभिन्न lectins का उपयोग कर विभिन्न एन -glycan चेन को समझते हैं और एन पहचान -glycosylated प्रोटीन से 42 के साथ तुलना में, हमारे यहाँ वर्णित विधि PNGase एफ का उपयोग करता है दूर करने के लिए प्रोटीन से जुड़े एन -glycan और पता लगाता प्रवास पारी SCAP प्रोटीन टुकड़ा के ग्लाइकोसिलेशन की पहचान करने के लिए हूँ 540-707। लेक्टिन विधि की सीमा लेक्टिन विशिष्ट पहचान करने के लिए की उचित प्रकार की पहचान पर निर्भर है एन -glycosylation विश्लेषण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया है। इसके अलावा, विधि भी homogenization 2 के बाद मानव रोगियों या जानवरों के ऊतकों में SCAP एन -glycosylation और प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। हमारे अध्ययन से कैंसर और चयापचय रोगों में लिपिड चयापचय के हस्ताक्षर का विश्लेषण करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करता है।

इस अध्ययन में, GFP लेबल एन -glycosylation और मानव कोशिकाओं में तस्करी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल SCAP की प्लाज्मिड हम्सटर-मूल है। SCAP एंटीबॉडी (आईजीजी 9D5) है कि अमीनो एसिड SCAP प्रोटीन की 540-707 टुकड़ा केवल प्रोटीन और इस तरह चीनी हैम्स्टर डिम्बग्रंथि (चो) सेल लाइन 15 में के रूप में हम्सटर SCAP के एन -glycosylation, का पता लगा सकते खिलाफ उठाया है। अमीनो एसिड के खिलाफ एंटीबॉडी 450 - 500 मानव SCAP की, मानव कोशिकाओं में अंतर्जात SCAP प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है SCAP एन -glyco पता लगाने के लिए।मानव SCAP के 707 टुकड़ा - मानव कोशिकाओं या ऊतकों में sylation, हम 540 अमीनो एसिड के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी विकसित करने के लिए की जरूरत है। इसके अलावा, एक विशिष्ट लेक्टिन की पहचान पहचान करने के लिए बाध्य SCAP एन -glycan मानव SCAP एन -glycosylation 42 विश्लेषण करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इसके अलावा, रचना और प्रत्येक एन -glycan श्रृंखला SCAP में बाध्यकारी की संरचना को परिभाषित (N263, N590 और N641) Golgi को ईआर से SCAP तस्करी के अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ की सुविधा होगी।

इसके अलावा, SCAP एन -glycosylation का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम कुछ प्रतिक्रिया मानकों को हमारे प्रयोगात्मक शर्तों, जो ब्राउन और गोल्डस्टीन प्रयोगशाला में 15 से प्रकाशनों में वर्णित विधि से संशोधित कर रहे हैं के अनुसार समायोजित। सफलतापूर्वक SCAP प्रोटीन और उसके एन -glycosylation का पता लगाने के लिए, झिल्ली भिन्न और परमाणु अर्क की गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण हैं। हम सीधे 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated झिल्ली अंशों के बाद प्रोटीन एकाग्रता चुना गया, नमूना बर्फ पर वापस डालने से परहेज। विधि यहाँ वर्णित व्यापक रूप से कैंसर, हृदय रोग, मधुमेह, मोटापा और सहित अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 117 SCAP, SREBPs जालिका झिल्ली प्रोटीन लिपिड संश्लेषण
SCAP का विश्लेषण<em&gt; एन</em&gt; -glycosylation और मानव कोशिकाओं में तस्करी
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Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, … More

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

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