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Biology

SCAP의 분석 Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Radiation Oncology, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center and College of Medicine

Summary

우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.

Introduction

지질 대사의 규제 완화는 암과 대사성 질환 1-6의 일반적인 특성이다. 이러한 프로세스에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBPs) 전사 인자의 계열은 흡수 및 콜레스테롤, 지방산의 합성 및 인지질 7-10에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 중요한 역할을한다.

SREBP-1a에서, SREBP-1C 및 SREBP-2를 포함 SREBPs는 두 개의 횡단 도메인 (7)의 미덕에 의해 소포체 (ER) 막에 결합 비활성 전구체로 합성된다. SREBPs의 N 말단이 표적 유전자 (11)의 전이 활성화를위한 DNA 결합 도메인이 포함되어 있습니다. SREBP 전구체의 C- 말단 절단 SREBP-활성화 단백질 (SCAP) (12, 13), SREBP 안정성 14-16 활성의 조절에 중추적 인 역할을하는 polytopic 막 단백질에 결합한다.

implemen전사 기능 테이션은 두 단백질 분해 효소가 순차적으로 SREBP을 절단하고 지방을 생성하는 유전자 (7)의 전이 활성화의 핵으로 들어간다는 N- 말단 단편을 해제 골지에 응급실에서 SCAP / SREBP 복합체의 전위가 필요합니다. 이 과정에서, ER 막에 스테롤의 수준은 ER 7,17에서 SCAP / SREBP 복합체의 종료를 제어 할 수 있습니다. 높은 스테롤 조건 스테롤은 SCAP 또는 ER 상주 결합 인슐린 - 유도 유전자 단백질 -1 (Insig-1) 또는 -2 (Insig-2)에서 SCAP / SREBP 착체를 보유 Insigs으로 SCAP의 연결을 강화 ER 18 ~ 20. 스테롤 수치가 감소하면, SCAP는 Insigs로 해리. 이것은 일반적인 코트 단백질 (COP) II 단지와 SCAP 상호 작용을 할 수있는 SCAP 구조적 변화로 이어집니다. 복잡한 신진 소포로 SCAP / SREBP 복합체의 결합을 매개하고 골지 (21, 22)에 ER에서의 전송을 지시합니다. transloc시골지에 ATION, SREBPs 순차적으로 N 말단 7,23-29의 출시로 이어지는 사이트 1 및 사이트-2 단백질 분해 효소에 의해 분해된다.

SCAP 단백질 N은 아스파라긴에 올리고당을 -linked 세 운반 (N)는 N263, N590과 N641 (15)를 배치합니다. 우리는 최근이 사이트에서 SCAP의 포도당 매개 N의 -glycosylation 낮은 스테롤 조건 30-32에서 골지체로 ER에서 SCAP / SREBP 거래를위한 필수 조건입니다 것으로 나타났습니다. (NNN은 QQQ하는) 글루타민에 세 아스파라긴의 돌연변이를 통해 SCAP의 글리코 실화의 손실 SCAP의 단백질과 SREBP 활성화 (31)의 감소의 불안정성에 SCAP / SREBP의 복잡하고 결과의 인신 매매를 사용하지 않습니다. 우리의 최근의 데이터는 또한 SREBP-1의 높은 아교 모세포종에서 활성화 및 SCAP의 N -glycosylation 4,31,33,34에 의해 규제됩니다 보여줍니다. 타겟팅 SCAP / SREBP-1 신호는 악성 종양과 신진 대사의 치료에 새로운 전략으로 부상1,3,35-38 yndromes. 따라서, SCAP 및 N 단백질의 수준을 분석 -glycosylation 인간 세포 및 환자 조직에서의 피킹을 모니터링하기위한 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요하다.

응급실에서 SCAP 단백질 (아미노산 540-707)의 내강 영역은 그대로 막은 트립신 (15)으로 처리 할 때 단백질 분해로부터 보호되는 두 개의 N의 -glycosylation 사이트 (N590과 N641)가 포함되어 있습니다. 이 내강 단편 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 15,31 SCAP 개별 당화 변형의 해상도를 허용하도록 충분히 작은 ~ 30 kDa의 분자량을 갖는다. 여기서는 N의 SCAP의 -glycosylation 인간 세포에서 전체 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 브라운 및 골드 스타 인 연구소 15하고 최근 출판 (31)로부터의 공보에 기재된 방법으로부터 유도된다. 프로토콜은 t에서 사용될 수있다그는 포유 동물 세포에서 SCAP 단백질의 연구.

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Protocol

인간의 세포 1. 검색 내생의 SCAP 단백질

  1. 세포 배양 및 치료
    1. 시드 ~ 1 × 106 U87의 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)와 10cm 접시에 세포는 처리 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %.
    2. 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세포를 세척 한 다음 12 시간 동안 (5 mM)을하거나하지 않고 새로운 글루코스 DMEM 배지에 세포를 전환.
  2. 세포 막 분수 및 핵 추출물의 제조
    1. 세척 세포는 한 번 PBS로 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 1 ml의 PBS로 긁어, 원심 분리기.
    2. 된 10 mM HEPES-KOH (PH 7.6), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM의 나트륨 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 250 mM의 함유 빙냉 완충액에서 재현 탁 셀 수 크로스, 및 프로테아제 억제제의 혼합물 (5 μg / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 25 μg의 / ㎖ N 아세틸 레우-의 Leu-Norleu-AL 30 분 (ALLN)) 얼음 에다가요.
    3. 핵을 분리하는 5 분 동안 4 ° C에서 890 XG에 22 G의 X를 통해 1 1/2 바늘 30 회 원심 분리기를 세포 추출물을 전달합니다.
    4. 막 분획 (단계 1.2.7)의 분리 상층 액을 사용합니다. 버퍼 C (20 mM의 HEPES / KOH pH를 7.6, 0.42 M의 NaCl, 2.5 % (v / v) 글리세롤, 0.1 ml의 핵 펠렛을 재현 탁 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 1 mM의 나트륨 EGTA 및 혼합물 단백질 분해 효소 억제제 (5 μg의 / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 PMSF, 1 mM의 DTT, 25 μg의 / ㎖ ALLN)).
    5. 4 ° C에서 20 분 동안의 microcentrifuge에 20,000 XG에서 60 분 원심 분리기 4 ° C에서 정지를 돌립니다. 상청액 "핵 추출물"로 지정된다.
    6. (5 배 로딩 버퍼 10 분 (31)를 100 ° C에서 핵 추출물을 가열SDS-PAGE를 실시하기 전에 2.5 mM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β-머 캅토 에탄올, 청색 0.05 % 브로 모 페놀).
    7. 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에서 원래 890 XG에 스핀에서 뜨는을 원심 분리기. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해, 0.1 SDS 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 100 mM의 염화나트륨, 1 % (v / v)의 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 1 mM 나트륨 EDTA ml의 1의 펠릿을 용해 mM의 나트륨 EGTA). 이것은 "막 분수"지정됩니다.
      참고 : 우리는 막 펠렛 20,000 XG에 20 분을 사용합니다. 10 10 XG - 20 분은 브라운과 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 논문에 사용되어왔다.
    8. 30 분 동안 37 ° C의 막 분획을 부화 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정한다. SDS-PAGE에 샘플을 실시하기 전에 1 ㎕의 100 배 브로 모 페놀 블루 솔루션을 추가합니다.
    9. 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 전체 막 단백질 50 μg의 -로드 (25). 젤을 실행80 V에서 15 분 동안, 다음 130 V로 변경하고 다른 115 분 동안 실행합니다. 130 분 39 140mA에서 전송합니다.
      1. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 전체 SCAP 단백질을 검출하기 위해 항 SCAP 항체를 사용한다. 내부 통제로, 단백질 이황화 이성화 효소 (PDI), 응급실 상주 단백질 (40)를 사용합니다. SREBP-1의 N 말단 대역을 검출하도록 안티 SREBP-1 항체를 사용한다. 핵 추출물 (31)에 대한 내부 통제로 라민를 사용합니다.

인간의 세포 2. 분석 SCAP의 N의 -glycosylation

  1. 세포 배양, 형질 및 치료
    1. 멤브레인 분석을 위해, DMEM와 10cm 접시 시드 ~ 1 × 106 HEK293T 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %.
    2. 혈청 배지를 감소 1 ml의 8 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 (박사 피터 Espenshade의 선물) (22) 부드럽게 혼합 - 4 희석.
    3. 플라스미드를 포함하는 혈청 배지를 감소 1ml를 직접 피펫 팅하여 16 μl의 DNA 형질 전환 시약 부드럽게 혼합 - 8을 추가합니다.
    4. 실온에서 25 분 동안 형질 감염 시약 / 플라스미드 복합체 인큐베이션.
    5. 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다.
    6. PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)는 N -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다.
  2. 단계 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 및 1.2.7에 설명 된대로 세포막 알약을 준비합니다.
  3. SCAP의 N의 -glycosylation의 검출
    1. 트립신 단백질 분해
      1. 10 mM의 HEPES · KOH (PH 7.4), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 100 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 114 μL에 GFP-SCAP 과발현 세포 막 펠렛을 재현 탁.
      2. 57 품어81에서 30 ° C에서 30 분 동안 58 μl의 총 부피의 부재 또는 트립신 1 μL (1 μg의 / μL)의 존재 하에서 막 단백질의 리터 씩.
      3. 대두 트립신 억제제 2 μL (400 부)을 첨가하여 반응을 중지.
    2. 펩티드 - N- 글리코시다 제 F에 의한 탈 글리코 실화 (MALDI 스펙트럼은 PNGase F)
      1. MALDI 스펙트럼은 PNGase F 후속 처리에 대해서는 3.5 % (중량 / 부피) SDS 7 % (부피 / 부피)를 포함하는 용액 10 ㎕를 각 샘플에 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다.
      2. 10 분 동안 100 ℃에서 가열 한 후, 연속적으로 0.5 M 인산 나트륨 (PH 7.5), 10 % (v / v)의 Nonidet 12 × 프로테아제 억제제와 P-40, 2 μL 7 μL 7 μL (0.5 U 추가 MALDI 스펙트럼은 PNGase F.의 / μL)
      3. 3 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 5 배 로딩 완충액 (312.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β 머 캅토 에탄올, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)를 첨가하여 반응을 중지. 10m 100 ° C의 혼합물을 가열및 SDS-PAGE에 따라. 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 총 멤브레인 단백질의 25-50 μg의로드. 다음 다른 115 분 동안 130 V로 변경, 15 분 동안 80 V에서 젤을 실행합니다. 130 분 동안 140mA에서 전송합니다.
      4. 웨스턴 블롯를 들어, N의 -glycosylation 총 SCAP 단백질을 검출하기 위해 10 μg의 / ㎖ 방지 SCAP (9D5) 항체를 사용합니다.

인간의 세포에서 GFP-SCAP를 사용하여 검출 골지에 ER에서 SCAP 인신 매매의 (3)

  1. DMEM와 60mm 접시 시드 2.5 × 105 U87 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %.
  2. 0.5 ml의 4 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 감소 혈청 배지를 희석 혼합한다.
  3. 직접으로 0.5 ml의에게 플라스미드를 포함하는 감소 된 혈청 배지를 피펫 팅에 의해 8 μl의 DNA 형질 전환 시약을 추가하고 부드럽게 섞는다.
  4. 방에서 25 분 동안 형질 전환 시약 / 플라스미드 복합체를 품다온도.
  5. 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다.
  6. 유리 커버 슬립 (22mm × 22mm)를 포함하는 6 웰 플레이트에 10 × 10 4 세포와 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 문화를 계속 - 5 시드.
  7. PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다.
  8. PBS로 한 번 세포를 씻으 10 분 동안 4 % 포름 알데히드에 고정합니다.
  9. 의 커버 슬립을 반전, PBS로 세포를 세 번 씻으 antifade 시약과 함께 슬라이드에 장착하고, 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉.
  10. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (41)의 63X 기름 침지 목표를 사용하여 GFP-SCAP 거래를 확인합니다.

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Representative Results


도 1은 웨스턴 블롯을 사용하여 자극 포도당 응답 인간 아교 모세포종 U87 세포에서 내인성 단백질 및 SCAP SREBP-1 핵 형태의 검출을 나타낸다. 막 단백질 SCAP는 "막 분획"에서 검출된다. SREBP-1의 핵 형태 (N 말단)이 "핵 추출물"에 검출된다. SCAP 단백질의 수준은 현저하게 포도당의 자극에 의해 강화되고, SREBP-1 핵 형태 (PDI는 ER 막 단백질의 내부 대조군으로서 작용). 이러한 결과는 프로토콜 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수 있음을 보여준다.


도 2는 GFP 표지 햄스터 SCAP 발현 HEK293T 세포 자극 tunicamycin 처리 글루코스에 반응하여 SCAP의 N의 총 -glycosylation GFP-SCAP 단백질 수준의 분석을 나타낸다.도 N의 -glycosylation 사이트를 운반하는 ER 막에 걸쳐 SCAP 단백질의 주제 구조를 보여줍니다. AA에게 540 포함 SCAP의 조각 - 응급실에서 6 일 내강 루프에있는 707, 트립신 내성 15 및 사이트 N590과 N641에 N의 -glycosylation의 분석에 사용됩니다. 처리 (AA 540 함유 - 707)보다 높은 중량 밴드 트립신 후도 2b (상부 패널)에 나타낸 바와 같이 하나 또는 두 개의 N은 MALDI 스펙트럼은 PNGase의 글루코스 부재의 존재 하에서 당사슬 (N590 및 N641)를 -linked 함유 SCAP 단백질을 나타낸다 (IgG를-9D5 항체 검출) 또는 tunicamycin. 빠른 SDS-PAGE에서 이동 - MALDI 스펙트럼은 PNGase F의 존재, N 결합 된 올리고당은 단편 (707 AA 540)를 일으키는 원인이되는 SCAP 단백질에서 제거되었습니다. 일관 완전 tunicamycin하여 N의 -glycosylation 개시 프로세스를 차단 하부의 모양으로 표시된 N SCAP의 -glycosylation를 폐지SCAP 조각 (그림 2B, 상단 패널)의 밴드. 또한, (GFP에 대한 항체에 의해 검출 된) 총 GFP-SCAP 단백질 글루코스의 부재 또는 tunicamycin 처리 (도 2b에 도시 된 바와 같이, 하부 패널)로 감소 하였다. 이러한 결과는 프로토콜 SCAP N -glycosylation의 분석에 적합 함을 입증한다.


그림 3은 자극을 포도당에 대한 응답에서 골지체로 ER에서 GFP-SCAP의 인신 매매는 U87 세포에서 tunicamycin 처리에 의해 억제 된 것을 알 수있다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 공 초점 현미경 사진 PDI, 응급실 상주 단백질 (적색)과의 공동 지역화 같이 GFP-SCAP 단백질, 글루코스 부재에서 ER에 존재하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 글루코오스의 존재하에 GFP-SCAP은 골지 마커 단백질 Giantin (적색) (도 3b)와 공동으로 현지화 도시 골지로 이동한다. 또한, tunicamycin치료는 골지체 (도 3A와 B)의 ER에서 GFP-SCAP의 포도당 - 유도 피킹을 억제 하였다.

그림 1
그림 1. 감지 내생 SCAP 단백질과 SREBP-1 U87 세포에서 핵 양식. 막과 12 시간 (5 밀리미터) 또는 포도당없이 무 혈청 배지에서 배양 된 인간의 기본 아교 모세포종 U87 세포에서 핵 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 인간 SCAP 단 (450)에 대해 안티 SCAP 항체 - 인간 500 세포에서 내인성 SCAP를 검출하는데 사용되었다. 인간 SREBP-1 407 단편 - SREBP-1의 활성 형 (N 말단)은 단 (301)에 대해 항체를 이용하여 "핵 추출물"에 검출된다. 이 수치는 31의 허가를 수정되었습니다. 더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의에.

그림 2
그림 2. SCAP N의 -glycosylation 및 GFP-SCAP 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석.가) SCAP 구조 스패닝은 ER 멤브레인을 통과 보여주는 개략도. 소포체 내강에 상주하며 N- 결합 올리고당에 의해 수정 모두 SCAP 세 아스파라긴 (N) 잔기가 존재한다. SCAP 함유 아미노산 540-707의 단편 트립신 분해에 내성이다. . 그것은 금주 모임 (540)에 대한 IgG의-9D5 항체를 검출 할 수있는 두 개의 N- 연결된 올리고당 수정 다래끼, N590과 N641 포함 - 서양 얼룩 B에 의해 햄스터 SCAP) 상부 SCAP N의 -glycosylation (의 웨스턴 블롯 분석 707 :와 함께 트립신 처리) 또는 GFP-SCAP의 단백질 수준 (낮은 : HEK293T 세포 트랜스에게 가입일 트립신 처리)iently 24 시간 동안 GFP-SCAP로 형질 감염하고 12 시간 동안, 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)와, N의 -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을가없는 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 블롯의 좌측의 숫자는 (IgG의-9D5 항체에 의해 검출 어퍼) SCAP 단백질 (N590 및 N641 사이트)에 대한 N의 -glycosylation 사이트의 수를 나타낸다. GFP-SCAP에 대한 낮은 패널이 GFP 단백질에 대한 항체가 검출되었다. 이 그림은 (31)로부터 허가를 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
골지. (A)에 응급실에서 SCAP 인신 매매의 그림 3. 감지, B) 공 초점 현미경 이미지는 GFP-SCAP는 ER에있는 또는 T로 이동하는 것을 보여그는 12 시간 동안 U87 세포에서 tunicamycin (1 μg의 / ㎖) 처리없이와 / 부재 또는 포도당 (5 밀리미터)의 존재 골지. PDI는 ER 염색 (적색) (A)를 보여줍니다. Giantin, 골지 마커 (적색) (B). DAPI (청색) 세포핵 얼룩. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 도 3a는 새로운 데이터이고, 이전에 게시되지 않았습니다.도 3b는 (31)의 허가를 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 연구는 인간 세포의 막 분획을 분리과 웨스턴 블롯을 이용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 시료의 준비를위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 더 GFP - 라벨 및 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 구체적으로는, 막 단백질을 분석하는데 사용 된 N SCAP -glycosylation 및 피킹을 조사하기위한 중요한 도구이다.

다른 N -glycan 사슬을 인식하고 N을 -glycosylated 단백질 (42)을 식별하기 위해 각종 렉틴을 사용하는 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 우리의 방법은 SCAP 단백질 단편의 당화를 식별 이주 시프트 단백질 - 결합 N은 -glycan 제거 MALDI 스펙트럼은 PNGase F를 사용하고, 검출 AA 540-707. 렉틴 방법의 한계는 특정 인식하는 렉틴의 적절한 유형의 식별에 의존 N의 -glycosylation를 분석하는 간단한 절차를 제공합니다. 또한,이 방법은 또한 2 균질화 후에 인간 환자 또는 동물의 조직에 SCAP의 -glycosylation N 단백질의 수준을 분석하기 위해 적용될 수있다. 우리의 연구는 암과 대사성 질환에서 지질 대사의 서명을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다.

본 연구에서는 인간의 세포에서 N의 -glycosylation 및 인신 매매의 분석에 사용 GFP 표지 SCAP의 플라스미드는 햄스터 기원합니다. SCAP 단백질 540-707 단편 만 단백질 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (15)에서와 같이 햄스터 SCAP의 N의 -glycosylation를 검출 할 수있는 아미노산에 대해 발생되는 SCAP 항체 (IgG의-9D5). 아미노산에 대한 항체는 450 -도 1에 나타낸 바와 같이 인간 SCAP (500)의 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수있다 SCAP N의 -glyco를 검출.인간 SCAP (707)의 단편 - 인간 세포 또는 조직에 sylation, 우리는 아미노산에 대해 (540), 특정 항체를 개발할 필요가있다. 또한, 특정 렉틴의 확인은 결합 된 N SCAP는 SCAP -glycan 인간 N -glycosylation (42)을 분석하는 다른 방법을 인식한다. 또한, SCAP 바인딩 각 N -glycan 체인의 구성과 구조를 정의 (N263, N590과 N641)은 골지체로 ER에서 SCAP 인신 매매의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진 할 것이다.

또한, N의 SCAP -glycosylation의 검출을위한 최적의 결과를 얻기 위해, 우리는 브라운 및 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 공보에 기재된 방법에서 변형 된 우리의 실험 조건에 따라 약간의 반응 매개 변수를 조절. 성공적 SCAP 단백질과 N의 -glycosylation를 검출하기 위해, 막 분획과 핵 추출물의 품질이 매우 중요. 우리는 직접 얼음 위로 시료를 넣어 회피 37 ° C에서 배양 막 분획 후, 단백질 농도를 결정 하였다. 여기에 기재된 방법은 널리 암, 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 연구를 포함한 다양한 분야에 적용될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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세포 생물학 이슈 117 SCAP, SREBPs 소포체 세포막 단백질 지질 합성
SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매
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Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

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