Summary
Descreve-se um método modificado para o isolamento de fracção de membrana a partir de células humanas e de preparação da amostra para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós introduzimos ainda um método de rotulagem GFP para monitorar o tráfico SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser utilizado em laboratórios de biologia regulares.
Introduction
A desregulamentação do metabolismo lipídico é uma característica comum de câncer e doenças metabólicas 1-6. Nestes processos, esterol de proteínas reguladoras de ligação ao elemento (SREBPs), uma família de factores de transcrição, desempenham um papel crítico no controle da expressão de genes importantes para a absorção e síntese de colesterol, ácidos gordos, fosfolípidos e 7-10.
SREBPs, incluindo SREBP-1a, SREBP-1c, e de SREBP-2, são sintetizadas como precursores inactivos que se ligam à membrana do retículo endoplasmático (ER), em virtude de dois domínios transmembranares 7. O N-terminal da SREBPs contém um domínio de ligação de ADN para a transactivação de genes alvo 11. O C-terminal dos precursores SREBP liga-se ao de SREBP proteína de activação de clivagem (SCAP) 12,13, uma proteína de membrana politópica que desempenha um papel fundamental na regulação da estabilidade e SREBP activação 14-16.
a implemenção da função da transcrição requer a translocação do complexo SCAP / SREBP do RE para o Golgi, onde duas proteases clivam sequencialmente SREBP e libertar o seu fragmento N-terminal, o qual então entra para dentro do núcleo para a transactivação de genes lipogênicas 7. Nestes processos, os níveis de esteróis na membrana do RE controlar a saída do complexo SCAP / SREBP do ER 7,17. Sob condições de elevada esterol, esterol SCAP se liga a ou ER-residente induzida por insulina do gene da proteína-1 (Insig-1) ou -2 (Insig-2), aumentando a associação de SCAP com Insigs que retêm o complexo SCAP / SREBP na ER 18-20. Quando os níveis de esteróis diminuir, SCAP dissocia com Insigs. Isto leva a uma alteração conformacional SCAP, que permite a interacção com proteínas de revestimento SCAP comuns complexo (COP) II. O complexo medeia a incorporação do complexo SCAP / SREBP para as vesículas do brotamento e dirige o seu transporte do RE para o Golgi 21,22. Após a translocção para o Golgi, SREBPs são sequencialmente clivada por Site-1 e Site-2 proteases, levando à libertação de N-terminal 7,23-29.
Proteína SCAP carrega três N -ligada oligossacarídeos na asparagina (N) posiciona N263, N590 e N641 15. Recentemente, revelou que mediada por glicose N -glycosylation de SCAP nestes locais é uma condição prévia para o tráfico SCAP / SREBP do RE para o Golgi sob baixas condições de esterol 30-32. Perda de glicosilação através de mutação de SCAP todos os três asparagina a glutamina (NNN para qqq) desactiva o tráfico do complexo SCAP / SREBP e resulta na instabilidade de proteínas SCAP e redução da activação SREBP 31. Nossos dados recentes também demonstram que SREBP-1 é altamente ativada no glioblastoma e regulamentada pela SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Segmentação / sinalização SCAP SREBP-1 está a emergir como uma nova estratégia para o tratamento de doenças malignas e s metabólicosyndromes 1,3,35-38. Portanto, é importante desenvolver um método eficaz para analisar os níveis de proteína SCAP e N -glycosylation e monitorar o seu tráfico de células humanas e tecidos de pacientes.
A região da proteína luminal SCAP (aminoácidos 540-707) no ER contém dois locais -glycosylation N (N590 e N641) que estão protegidos contra a proteólise quando as membranas intactas são tratadas com tripsina 15. Este fragmento luminal tem um peso molecular de ~ 30 kDa, que é suficientemente pequeno para permitir a resolução de variantes glicosiladas de SCAP individuais por electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) 15,31. Aqui, nós fornecemos um método para detectar N -glycosylation do SCAP e a proteína total em células humanas. Este protocolo é derivado a partir do método descrito nas publicações de laboratório Brown e Goldstein 15 e nossa publicação recente 31. O protocolo pode ser utilizado em tele estudo de proteínas a partir de células de mamífero SCAP.
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Protocol
1. Detecção de proteína endógena em células humanas SCAP
- Cultura Celular e Tratamento
- Semear as células ~ U87 1 x 10 6 em um prato de 10 cm, com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes do tratamento.
- Lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, mudar as células para meio DMEM fresco com ou sem glicose (5 mM) durante 12 h.
- Preparação de Membrana Celular frações e Nucleares Extractos
- Lavar as células uma vez com PBS, raspar em 1 ml de PBS, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células num tampão gelado contendo 10 mM de HEPES-KOH (pH 7,6), KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, ácido etilenodiaminotetracético de sódio 1 mM (EDTA), ácido etileno de sódio glicol-tetraacético 1 mM (EGTA), 250 mM sacarose, e uma mistura de inibidores de protease (5 μg / ml de pepstatina A, 10 ug / ml de leupeptina, 0,5 fluoreto de fenilmetilsulfonilo mM (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e 25 ug / ml de N-acetil-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) durante 30 min no gelo.
- Passa extractos de células através de uma 22 L x 1 1/2 agulha 30 vezes e centrifugar a 890 xg, a 4 ° C durante 5 min para isolar núcleos.
- Utilizar o sobrenadante para a separação de fracções de membrana (passo 1.2.7). Ressuspender o sedimento nuclear em 0,1 mL de tampão C (20 mM de HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M de NaCl, 2,5% (v / v) de glicerol, MgCl2 1,5 mM, EDTA de sódio 1 mM, EGTA de sódio 1 mM e uma mistura de inibidores da protease (5 ug / ml de pepstatina A, 10 ug / ml de leupeptina, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, e 25 ug / ml ALLN)).
- Rodar a suspensão a 4 ° C durante 60 minutos e centrifugar a 20000 xg numa microcentrífuga durante 20 min a 4 ° C. O sobrenadante é designado como "extractos nucleares".
- Aquece-se os extractos nucleares a 100 ° C durante 10 min com tampão de carregamento de 5x (312,5 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol e 0,05% de azul de bromofenol) antes de se submeter a SDS-PAGE.
- Centrifuga-se o sobrenadante a partir de centrifugação a 890 xg original a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Para a análise Western blot subsequente, dissolve-se o sedimento em 0,1 ml de tampão SDS de lise (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, NaCl 100 mM, 1% (v / v) de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA de sódio 1 mM, e 1 mM EGTA de sódio). Esta é designada "fracção de membrana".
NOTA: Nós usamos 20.000 xg por 20 min para sedimentar membranas. 100.000 xg durante 10 - 20 min foi usado nos papéis de laboratório Brown e Goldstein 15. - Incubar a fracção da membrana a 37 ° C durante 30 min e determinar a concentração de proteína pelo ensaio de proteína de Bradford. Adicionar uma solução de azul de bromofenol ul 100x antes de submeter as amostras a SDS-PAGE.
- Carga 25 - 50 ug de proteínas de membrana totais num gel de SDS-PAGE a 10% 39. Submeter o gela 80 V durante 15 min, em seguida, mudar para 130 V e correr para outro 115 min. Transferir a 140 mA para 130 min 39.
- Para a análise de transferência de Western, utilize anticorpo anti-SCAP para detectar a proteína total SCAP. Use isomerase de dissulfito de proteína (PDI), uma proteína residente do ER-40, como um controlo interno. Use anticorpo anti-SREBP-1 para detectar a banda N-terminal de SREBP-1. Use Lamin A como um controlo interno para os extractos nucleares 31.
2. Análise do SCAP -glycosylation N em células humanas
- Cultura de células, transfecção, tratamento e
- Para a análise de membrana, células HEK293T semente ~ 1 x 10 6 em um prato de 10 cm, com meio DMEM suplementado com FBS a 5% e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes da transfecção.
- Diluir 4-8 ug GFP-SCAP plasmídeo (uma oferta do Dr. Peter Espenshade) 22 em 1 ml reduzidos meio de soro e misture delicadamente.
- Adicionar 8-16 mL de reagente DNA transfecção pipetando diretamente nos 1 ml reduzidos meio de soro contendo plasmídeos e misture delicadamente.
- Incubar o complexo de reagentes / plasmídeo de transfecção durante 25 min à temperatura ambiente.
- Adicionar complexo de transfecção para as células com meio fresco e continuar a cultura durante 24 horas a 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Lavar uma vez com PBS e tratar as células durante 12 h com ou sem glicose (5 mM) na presença ou na ausência de tunicamicina (1 ug / ml), um inibidor de N -glycosylation.
- Prepare pelotas da membrana celular como descrito nos passos 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 e 1.2.7.
- Detecção de -glycosylation N SCAP
- tripsina proteólise
- Ressuspender as peletes de membrana a partir de células que sobre-expressam GFP-SCAP em 114 ul de tampão contendo HEPES 10 mM-KOH (pH 7,4), 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, EDTA de sódio 1 mM, e NaCl 100 mM.
- incubar 57l alíquotas de proteínas de membrana na ausência ou na presença de 1 ul de tripsina (1 mg / mL), num volume total de 58 uL, durante 30 min a 30 ° C; 81.
- Pare reacções pela adição de 2 ul (400 unidades) de inibidor de tripsina de soja.
- A desglicosilação por p�tido N- glicosidase F (PNGase F)
- Por tratamento subsequente com PNGase F, adicionar 10 ul de uma solução contendo 3,5% (p / v) de SDS e 7% (vol / vol) de 2-mercaptoetanol a cada amostra.
- Após aquecimento a 100 ° C durante 10 min, adiciona-se sequencialmente 7 ul de fosfato de sódio 0,5 M (pH 7,5), 7 mL de 10% (v / v) de Nonidet P-40 com inibidores de 12 × de protease, e 2 ul (0,5 U / ul) de PNGase F.
- Após incubação a 37 ° C durante 3 h, parar as reacções pela adição de tampão de carregamento de 5x (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol e 0,05% de azul de bromofenol). Aquecer as misturas a 100 ° C durante 10 me sujeita a SDS-PAGE. Carga 25-50 ug de proteínas de membrana totais num gel de SDS-PAGE a 10% 39. Submeter o gel a 80 V durante 15 min, em seguida, altere a 130 V por mais 115 min. Transferir a 140 mA para 130 min.
- Para o Western blot, utilize anticorpo anti-SCAP ug / ml 10 (9D5) para detectar N -glycosylation e proteína total SCAP.
- tripsina proteólise
3. Detecção de SCAP Tráfico de RE para o Golgi utilizando GFP-SCAP em células humanas
- Semente de 2,5 x 10 5 células U87 de um prato de 60 milímetros com DMEM suplementado com FBS a 5% e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes da transfecção.
- Dilui-se 4 ug de GFP-SCAP plasmídeo em 0,5 ml de meio de soro reduzido e misturar.
- Adicionar 8 mL de reagente DNA transfecção pipetando diretamente em 0,5 ml de meio de soro reduzido contendo plasmídeos e misture delicadamente.
- Incubar o complexo de reagentes / plasmídeo de transfecção durante 25 min a salatemperatura.
- Adicionar complexo de transfecção para as células com meio fresco e continuar a cultura durante 24 horas a 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Repropagação 5 - 10 x 10 4 células para uma placa de 6 poços contendo uma lamela de vidro (22 mm x 22 mm) e continuar a cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Lavar uma vez com PBS e tratar as células durante 12 h com ou sem glicose (5 mM) na presença ou na ausência de tunicamicina (1 ug / ml).
- Lave as células uma vez com PBS e fixar em 4% de formaldeído, durante 10 min.
- Lave as células três vezes com PBS, inverter as lamelas, montagem em lâminas juntamente com antifade reagente, e selar as lamelas usando unha polonês.
- Verifique o tráfico GFP-SCAP usando uma objectiva de imersão em óleo de 63X em uma varredura a laser microscópio confocal 41.
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Representative Results
A Figura 1 mostra a detecção da proteína endógena e SCAP forma nuclear de SREBP-1 em células U87 de glioblastoma humanas em resposta à glicose estimulação utilizando Western blot. O SCAP proteína da membrana é detectada no "fracção de membrana". A forma do núcleo (N-terminal) de SREBP-1 é detectada no "Extractos nucleares". O nível de proteína de SCAP (PDI serve como um controlo interno de proteínas de membrana ER) e forma nuclear de SREBP-1 são marcadamente aumentada por estímulo de glicose. Estes resultados demonstram que o protocolo é capaz de detectar a proteína SCAP endógena em células humanas.
A Figura 2 mostra a análise de -glycosylation SCAP N e os níveis totais de proteína GFP-SCAP em resposta à glicose estimulação e tratamento com tunicamicina de células HEK293T expressando SCAP hamster marcado com GFP. A Figura
A Figura 3 mostra que o tráfico de GFP-SCAP do RE para o Golgi em resposta à glicose estimulação foi suprimida por tunicamicina tratamento em células U87. Como mostrado na Figura 3A, imagens de microscopia confocal demonstram que a proteína GFP-SCAP reside no ER na ausência de glicose, como demonstrado pela sua co-localização com PDI, um ER-residente proteína (vermelho). Em contraste, na presença de glicose, GFP-SCAP move-se para o Golgi, mostrado pela co-localização com o marcador de Golgi proteína Giantin (vermelho) (Figura 3B). Além disso, tunicamicinatratamento suprimida tráfico induzida pela glicose de GFP-SCAP do RE para o Golgi (Figura 3A e B).
Figura 1. A detecção da proteína endógena SCAP e de SREBP-1 Forma nuclear em células de U87. A análise por Western blot da membrana e extractos nucleares a partir de células U87 de glioblastoma humanas de cultura primária em meio isento de soro com ou sem glicose (5 mM) durante 12 h. Anti-SCAP anticorpo contra a AA SCAP humana 450-500 foi usado para detectar o SCAP endógena em células humanas. A forma activa (N-terminal) de SREBP-1 é detectada nos extractos nucleares "" utilizando o anticorpo contra a AA 301-407 fragmento de SREBP-1 humano. Esta figura foi modificado com a permissão de 31. Por favor clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.
Figura 2. Análise Western Blot de -glycosylation SCAP N e níveis de proteína GFP-SCAP. A) Diagrama esquemático que mostra a estrutura Spanning SCAP atravessar a membrana do RE. Existem três asparagina (N) em SCAP resíduos, os quais residem no lúmen do ER e são modificados por oligossacáridos N-ligados. O fragmento de SCAP contendo os aminoácidos 540-707 é resistente a digestão com tripsina. Ele contém duas pocilgas N-ligada de modificação de oligossacárido, N590 e N641, que pode ser detectada por um anticorpo de IgG-9D5 contra a AA 540-707 de SCAP hamster por Western Blot B) Análise de transferência de Western de -glycosylation SCAP N (superior:. Com tratamento com tripsina) ou níveis de proteína GFP-SCAP (inferior: no tratamento de tripsina) de células HEK293T transiently transfectadas com GFP-SCAP durante 24 hr e, em seguida, cultivadas em meio isento de soro com ou sem glicose (5 mM) na presença ou na ausência de tunicamicina (1 ug / ml), um inibidor de N -glycosylation, durante 12 h. Os números no lado esquerdo da blot indicam o número de sites -glycosylation N na proteína SCAP (locais N590 e N641) (superior, detectado pelo anticorpo IgG-9D5). painel inferior para GFP-SCAP foi detectado por um anticorpo contra a proteína GFP. Esta figura foi modificado com a permissão de 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Detecção do tráfico SCAP do RE para o Golgi. A, B) As imagens de microscopia confocal demonstram que a GFP-SCAP reside no ER ou se move para tele Golgi na ausência ou na presença de glucose (5 mM) com / sem tunicamicina (1 ug / ml) em células U87 tratamento durante 12 h. PDI mostra a coloração de ER (vermelho) (A). Giantin, o marcador de Golgi (vermelho) (B). DAPI (azul) mancha o núcleo da célula. As barras de escala representam 10 um. Figura 3A é novos dados e não foi publicado antes. Figura 3B foi modificado com a permissão de 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos um protocolo para o isolamento de fracções de membrana de células de origem humana e para a preparação das amostras para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós fornecemos também um método para monitorar o tráfico SCAP usando GFP-rotulagem e microscopia confocal. O método é utilizado especificamente para analisar proteína de membrana e é uma ferramenta importante para investigar SCAP N -glycosylation e tráfico.
Em comparação com o método que utiliza várias lectinas de reconhecer diferentes cadeias de glicano N e identificar proteínas N -glycosylated 42, o nosso método descrito aqui utiliza PNGase F para remover proteína ligada de N-glicano e detecta o deslocamento de migração para identificar o fragmento de proteína de glicosilação SCAP aa 540-707. A limitação do método de lectina é dependente da identificação do tipo apropriado de lectina de reconhecer o específico
Neste estudo, o plasmídeo de SCAP marcado com GFP utilizadas para análise de -glycosylation N e o tráfico de células humanas é de hamster-origem. SCAP anticorpo (IgG-9D5) que é produzido contra os aminoácidos 540-707 da proteína fragmento SCAP pode apenas detectar a proteína e N -glycosylation do SCAP de hamster, tal como no do ovário de hamster chinês A linha de células (CHO) 15. O anticorpo contra os aminoácidos 450-500 de SCAP humano é capaz de detectar a proteína SCAP endógeno em células humanas, como mostrado na Figura 1 para detectar SCAP N -glyco.sylation em células ou tecidos humanos, precisamos desenvolver um anticorpo específico contra os aminoácidos 540-707 fragmento do SCAP humano. Além disso, a identificação de uma lectina específica para reconhecer N-glicano ligados a SCAP é uma forma alternativa para analisar SCAP humana N -glycosylation 42. Além disso, a definição da composição e estrutura da obrigatório em SCAP cada N cadeia de glicano (N263, N590 e N641) vai facilitar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de tráfico SCAP do RE para o Golgi.
Além disso, para obter os melhores resultados para a detecção de SCAP N -glycosylation, foi ajustado alguns parâmetros de reacção de acordo com as nossas condições experimentais, que são modificados a partir dos métodos descritos nas publicações da Brown e Goldstein Laboratório 15. Para detectar com êxito proteína SCAP e sua -glycosylation N, a qualidade das fracções de membrana e extractos nucleares são muito importantes. Determinou-se directamente a concentração de proteína após as fracções de membrana incubadas a 37 ° C, evitando colocar a amostra de volta em gelo. O método descrito aqui pode ser amplamente aplicada a diferentes campos de pesquisa, incluindo o cancro, doenças cardiovasculares, diabetes e obesidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
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