Summary
Описан модифицированный метод выделения мембранной фракции из клеток человека и подготовки проб для обнаружения СПДК N -glycosylation и общего белка с использованием вестерн - блот. Введем еще метод GFP-маркировки наблюдать за торговлей СПДК использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол может быть использован в обычных биологических лабораториях.
Introduction
Нарушение регуляции липидного обмена является общей характеристикой рака и болезней обмена веществ , 1-6. В этих процессах, стеринов регуляторный элемент-связывающих белков (SREBPs), семейство факторов транскрипции, играют решающую роль в контроле экспрессии генов , имеющих важное значение для поглощения и синтеза холестерина, жирных кислот, фосфолипидов и 7-10.
SREBPs, в том числе SREBP-1a, SREBP-1c и SREBP-2, синтезируются в виде неактивных предшественников , которые связываются с мембраной эндоплазматического ретикулума (ER) в силу двух трансмембранных доменов 7. N-конец SREBPs содержит ДНК-связывающий домен трансактивации генов - мишеней 11. С-конец SREBP предшественников связывается с SREBP скола-активирующий белок (SCAP) 12,13, в политопная мембранный белок , который играет ключевую роль в регуляции стабильности SREBP и активации 14-16.
implemenставление транскрипционной функции требует транслокацию СПДК / SREBP комплекса из ЭР к Гольджи, где два протеаз последовательно расщеплять SREBP и освободить его N-концевой фрагмент, который затем входит в ядро для трансактивации генов липогенных 7. В этих процессах, уровни стеринов в ЭР мембраны контролируют выход СПДК / SREBP комплекса из ЭР 7,17. При высоких условиях стеролов, стеринов связывается с СПДК или ER-резидент инсулин-индуцированный ген белка-1 (1-экс порте) или -2 (2-экс порте), усиливая ассоциацию с СПДК Insigs, сохраняющих СПДК / SREBP комплекс в ER 18-20. Когда уровни стеролов уменьшают, СПДК диссоциирует с Insigs. Это приводит к конформационным изменениям SCAP, что позволяет СПДК взаимодействие с общими покрывающих белков комплекса (КС) II. Комплекс является медиатором включение СПДК / SREBP комплекса в многообещающий везикул и направляет его транспортировку из ЭР к Гольджи 21,22. После Translocвания к Гольджи, SREBPs последовательно расщепляется Зону-1 и Site-2 протеаз, что приводит к выделению из N-конец 7,23-29.
СПДК белок несет три N -связанной олигосахариды на аспарагин (N) позиции N263, N590 и N641 15. Недавно мы показали , что глюкоза-опосредованного N -glycosylation из СПДК в этих местах является необходимым условием условием для торговли СПДК / SREBP из ЭР к Гольджи в условиях низких стеролов 30-32. Потеря SCAP гликозилирования с помощью мутации всех трех аспарагина на глутамин (NNN в QQQ) отключает торговлю СПДК SREBP комплекса и результаты / в нестабильности SCAP белка и уменьшения активации SREBP 31. Наши последние данные показывают также , что SREBP-1 сильно активируется в глиобластомы и регулируется SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Ориентация СПДК / SREBP-1 сигнализации появляется в качестве новой стратегии для лечения злокачественных новообразований и метаболических Syndromes 1,3,35-38. Поэтому важно разработать эффективный метод для анализа уровней СПДК белка и N -glycosylation и контроля за его оборотом человеческих клеток и тканей пациента.
Полостную область СПДК белка (аминокислоты 540-707) в ER содержит два участка -glycosylation N (N590 и N641), которые защищены от протеолиза при неповрежденных мембран обрабатывают трипсином 15. Этот фрагмент полостную имеет молекулярную массу ~ 30 кДа , который достаточно мал , чтобы позволить разрешение отдельных гликозилированных вариантов СПДК методом электрофореза в полиакриламидном геле в сульфат натрия додецилсульфата (SDS-PAGE) 15,31. Здесь мы предлагаем способ для обнаружения N -glycosylation из СПДК и общего белка в клетках человека. Этот протокол является производным от метода , описанного в публикации из лаборатории Брауна и Goldstein 15 и нашей недавней публикации 31. Протокол может быть использован в тон изучение SCAP белка из клеток млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Обнаружение эндогенного СПДК белка в клетках человека
- Культура клеток и лечение
- Семенной ~ 1 × 10 6 U87 клеток в 10 см чашку с Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубируют клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 ч перед обработкой.
- Промыть клетки один раз фосфатным буферным раствором (PBS), а затем переключить клетки на свежий DMEM среде с добавлением или без глюкозы (5 мМ) в течение 12 ч.
- Получение клеточных мембран фракций и ядерных экстрактов
- Промыть клетки один раз PBS, скрести в 1 мл PBS, и центрифуге при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в охлажденный льдом буфере , содержащем 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,6), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ натрий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), 1 мМ этилен натрия гликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), 250 мМ сахарозы, и смесь ингибиторов протеазы (5 μг / мл пепстатина А, 10 мкг / мл лейпептина, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), и 25 мкг / мл N-ацетил-Лей-Лей-Norleu-аль (всех п)) в течение 30 мин на льду.
- Проходят клеточных экстрактов через 22 G x 1 1/2 игла 30 раз и центрифуге при 890 мкг при 4 ° С в течение 5 мин для выделения ядер.
- Используйте надосадочную жидкость для разделения мембранных фракций (этап 1.2.7). Ресуспендируют ядерный осадок в 0,1 мл буфера С (20 мМ HEPES / KOH рН 7,6, 0,42 М NaCl, 2,5% (об / об) глицерина, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА натрия, 1 мМ EGTA натрия и смесь ингибиторы протеазы (5 мкг / мл пепстатина а, 10 мкг / мл лейпептина, 0,5 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ и 25 мкг / мл всех п)).
- Поворотом суспензию при температуре 4 ° С в течение 60 мин и центрифугируют при 20000 х г в микроцентрифуге в течение 20 мин при 4 ° C. Супернатант, обозначенными как "ядерных экстрактов".
- Тепло ядерных экстрактов при 100 ° С в течение 10 мин с 5-кратным загрузочным буфером (312,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 10% ДСН, 50% глицерина, 12,5% β-меркаптоэтанола, и 0,05% голубой бромфениловый) перед воздействием на SDS-PAGE.
- Центрифуга супернатант из оригинального 890 XG спина при 20000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Для последующего Вестерн-блот-анализа, растворить осадок в 0,1 мл SDS буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 1% (об / об) додецилсульфата натрия (SDS), 1 мМ ЭДТА, натрия и 1 мМ EGTA натрия). Его обозначили как "мембранную фракцию".
Примечание: Мы используем 20 000 мкг в течение 20 мин для осаждения мембран. 100000 мкг в течение 10 - 20 мин было использовано в работах из лаборатории Браун и Гольдштейн 15. - Выдержите в мембранной фракции при 37 ° С в течение 30 мин и определяют концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Добавить 1 мкл 100x бромфенолового синего раствора перед тем, подвергая образцы в SDS-PAGE.
- Нагрузка 25 - 50 мкг общего мембранных белков на 10% SDS-PAGE гель 39а. Запустите гельпри 80 V в течение 15 мин, а затем изменить до 130 V и запустить еще 115 мин. Передача при 140 мА в течение 130 мин 39.
- Для Вестерн-блоттинга анализа используют анти-SCAP антитела для выявления общего белка SCAP. Использование дисульфида белка изомеразы (PDI), в ER-резидент белка 40, в качестве внутреннего контроля. Использование анти-SREBP-1 антитела для выявления N-концевой полосы SREBP-1. Используйте Ламин А в качестве внутреннего контроля для ядерных экстрактов 31.
2. Анализ СПДК N -glycosylation в клетках человека
- Культура клеток, трансфекция, и лечение
- Для анализа мембраны, семена ~ 1 × 10 6 HEK293T клеток в 10 см чашку с DMEM с добавлением 5% FBS и инкубировать клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов до трансфекции.
- Развести 4 - 8 мкг GFP-SCAP плазмиды (подарок от Dr. Peter Espenshade) 22 в 1 мл сыворотки уменьшенных среды и аккуратно перемешать.
- Добавить 8 - 16 мкл реагента трансфекции ДНК с помощью пипетки непосредственно в 1 мл сыворотки уменьшенных среды, содержащей плазмид и аккуратно перемешать.
- Выдержите реагент для трансфекции / плазмидной комплекса в течение 25 мин при комнатной температуре.
- Добавьте трансфекции комплекса к клеткам со свежей средой и продолжать культуры в течение 24 часов при 5% CO 2 и 37 ° С.
- Промывают один раз PBS и лечить клетки в течение 12 часов с или без глюкозы (5 мМ) в присутствии или в отсутствие туникамицина (1 мкг / мл), ингибитор N -glycosylation.
- Приготовьте клеточной мембраны гранул, как описано в пунктах 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 и 1.2.7.
- Обнаружение SCAP N -glycosylation
- Трипсин протеолиза
- Ресуспендируют мембраны гранул из клеток с гиперэкспрессией GFP-СПДК в 114 мкл буфера , содержащего 10 мМ HEPES · KOH (рН 7,4), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА , натрия и 100 мМ NaCl.
- Выдержите 5781; л аликвоты мембранных белков в отсутствие или в присутствии 1 мкл трипсина (1 мкг / мкл), в общем объеме 58 мкл, в течение 30 мин при 30 ° C.
- Остановить реакцию добавлением 2 мкл (400 единиц) соевого ингибитора трипсина.
- Дегликозилирование по пептидные N- гликозидазы F (F PNG - азой)
- Для последующей обработки PNG-азой F, добавить 10 мкл раствора, содержащего 3,5% (вес / объем) SDS и 7% (об / об) 2-меркаптоэтанола к каждому образцу.
- После нагревания при 100 ° С в течение 10 мин, последовательно добавляют 7 мкл 0,5 М фосфата натрия (рН 7,5), 7 мкл 10% (об / об) Нонидет P-40 с ингибиторами 12 × протеазы, и 2 мкл (0,5 ед / мкл) F. PNG-азой
- После инкубации при 37 ° С в течение 3 ч, остановить реакцию добавлением 5-кратного буфера для загрузки (312,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 10% SDS, 50% глицерина, 12,5% бета-меркаптоэтанола и 0,05% бромфенола синего). Нагреть смеси при 100 ° С в течение 10 мв и с учетом SDS-PAGE. Нагрузка 25-50 мкг общей мембранных белков на 10% SDS-PAGE гель 39а. Запуск гель при 80 В в течение 15 мин, а затем изменить до 130 В в течение еще 115 мин. Передача при 140 мА в течение 130 мин.
- Для Вестерн - блоттинга, используют 10 мкг / мл анти-SCAP (9D5) антитела для обнаружения N -glycosylation и общего белка SCAP.
- Трипсин протеолиза
3. Обнаружение SCAP оборота от ER к Golgi с помощью GFP-СПДК в клетках человека
- Семенной 2,5 × 10 5 U87 клеток в 60 мм блюдо с DMEM с добавлением 5% FBS и инкубировать клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов до трансфекции.
- Развести 4 мкг GFP-SCAP плазмиды в 0,5 мл восстановленного сыворотки среды и перемешать.
- Добавить 8 мкл реагента трансфекции ДНК с помощью пипетки непосредственно в 0,5 мл восстановленного сыворотки среды, содержащей плазмид и аккуратно перемешать.
- Выдержите реагент для трансфекции / плазмидной комплекса в течение 25 мин при комнатнойтемпература.
- Добавьте трансфекции комплекса к клеткам со свежей средой и продолжать культуры в течение 24 часов при 5% CO 2 и 37 ° С.
- Reseed 5 - 10 × 10 4 клеток в 6-луночный планшет , содержащий покровным стеклом (22 мм × 22 мм) и продолжают культуры при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов.
- Промывают один раз PBS и лечить клетки в течение 12 часов с или без глюкозы (5 мМ) в присутствии или в отсутствие туникамицина (1 мкг / мл).
- Промыть клетки один раз с PBS и зафиксировать в 4% формальдегиде в течение 10 мин.
- Мыть клетки три раза PBS, инвертировать покровные, крепление на салазках вместе с antifade реагентом, и запечатать покровные с помощью лака для ногтей.
- Проверьте торговлю GFP-SCAP с использованием объектива масла погружения 63x в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано обнаружение эндогенного белка СПДК и SREBP-1 ядерной формы в клетках глиобластомы U87 человека в ответ на глюкозу стимуляции с помощью вестерн - блот. Мембранный белок СПДК обнаруживается в "мембранной фракции". Форма ядра (N-концевой) из SREBP-1 обнаружен в "ядерных экстрактов". Уровень белка SCAP (PDI служит в качестве внутреннего контроля ER мембранных белков) и SREBP-1 ядерной формы заметно усиливается глюкозы стимуляции. Эти результаты показывают, что протокол способен обнаружить эндогенного белка SCAP в клетках человека.
На рисунке 2 показан анализ СПДК N -glycosylation и уровни общего белка GFP-Scap в ответ на глюкозу стимуляции и лечения туникамицина в HEK293T клетках , экспрессирующих GFP-меченых хомяка СПДК. Рисунок
Рисунок 3 показывает , что оборот GFP-СПДК из ЭР к Гольджи в ответ на глюкозу стимуляции подавлялось туникамицина лечения в U87 клетках. Как показано на фигуре 3А, конфокальной микроскопии изображения показывают , что GFP-СПДК белок находится в ER в отсутствие глюкозы, как показал его совместной локализации с PDI, ER-резидент белка (красный). В отличие от этого , в присутствии глюкозы, GFP-СПДК перемещается в Гольджи, зафиксированный в совместной локализации с Гольджи маркерного белка Giantin (красный) (рис 3б). Кроме того, туникамициналечение подавлено вызываемую глюкозой оборотом GFP-СПДК из ЭР к Гольджи (фиг.3А и В).
Рисунок 1. Обнаружение эндогенного белка SCAP и SREBP-1 ядерных форм в U87 клеток. Вестерн - блот - анализом мембраны и ядерных экстрактов из клеток U87 первичных глиобластомы человека , культивируемых в бессывороточной среде с использованием или без глюкозы (5 мМ) в течение 12 ч. Анти-СПДК антитела против SCAP а.о. человека 450 - 500 использовали для обнаружения эндогенный СПДК в клетках человека. Активная форма (N-терминал) из SREBP-1 обнаружен в "ядерных экстрактах" с использованием антитела против аа 301 - 407 фрагмента человеческого SREBP-1. Эта цифра была изменена с разрешения 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versiна этой фигуре.
Рисунок 2. Вестерн - блот анализ СПДК N -glycosylation и GFP-Scap белка уровней. А) показана схема , представляющая структуру СПДК порождающий пересекают ER мембрану. Есть три аспарагин (N) остатки в СПДК, все из которых проживают в ЭР просвете и модифицированы N-связанных олигосахаридов. Фрагмент Scap содержащий аминокислоты 540-707 устойчив к трипсина пищеварения. Он содержит два N-связанных олигосахарида модификации, N590 , воспользовалась ими и N641, которые могут быть обнаружены IgG-антитела 9D5 против аа 540 - 707 хомячкового СПДК Вестерн - блот - B) Вестерн - блоттинга от СПДК N -glycosylation (верхняя: с. лечение трипсин) или уровни белка GFP-SCAP (ниже: нет трипсина обработка) из HEK293T клеток трансвлена трансфицированные GFP-СПДК в течение 24 ч , а затем культивировали в не содержащей сыворотки среде с добавлением или без глюкозы (5 мМ) в присутствии или в отсутствие туникамицина (1 мкг / мл), ингибитор N -glycosylation, в течение 12 часов. Цифры на левой стороне блоте указывают число N -glycosylation сайтов SCAP белка (N590 и N641) сайтов (верхний, обнаруженного IgG-антитела 9D5). Нижняя панель для GFP-СПДК был обнаружен с помощью антитела против белка GFP. Эта цифра была изменена с разрешения 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Обнаружение SCAP оборота из ЭР к Гольджи. А, Б) конфокальной микроскопией изображения показывают , что GFP-СПДК находится в ER или движется к тон Гольджи в отсутствие или в присутствии глюкозы (5 мМ), с / без туникамицина (1 мкг / мл), лечение в U87 клеток в течение 12 часов. PDI показывает ER окрашивание (красный) (A). Giantin, маркер Гольджи (красный) (В). DAPI (синий) окрашивает ядро клетки. Масштабные столбики представляют 10 мкм. Рисунок 3A новые данные и не были опубликованы ранее. Рисунок 3B была изменена с разрешения 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы опишем протокол для выделения мембранных фракций в клетках человека и для приготовления образцов для обнаружения СПДК N -glycosylation и общего белка с использованием вестерн - блот. Кроме того, мы предоставить способ для контроля за оборотом SCAP с помощью GFP мечение и конфокальной микроскопии. Этот метод специально используется для анализа мембранного белка и является важным инструментом для исследования СПДК N -glycosylation и торговлей.
По сравнению с методом с использованием различных лектинов , чтобы распознавать различные N -glycan цепи и определить г N -glycosylated белки 42, наш метод , описанный здесь использует PNG - азой F для удаления белково-связанный N -glycan и обнаруживает сдвиг миграции для идентификации гликозилирование фрагмента белка SCAP аа 540-707. Ограничение метода лектин зависит от идентификации соответствующего типа лектина признания конкретных
В этом исследовании плазмиды GFP-меченых СПДК , используемого для анализа N -glycosylation и торговле человеческими клетками хомячка-происхождения. СПДК антитела (IgG-9D5) , который поднимается против аминокислот 540-707 фрагмент белка SCAP могут только детектировать белок и N -glycosylation хомячка СПДК, например, в китайского хомяка яичников (СНО) , клетки линии 15. Антитела против аминокислот 450 - 500 человека СПДК способен обнаружить эндогенного белка SCAP в клетках человека, как показано на рисунке 1 Для обнаружения СПДК N -glyco.sylation в человеческих клетках или тканях, нам необходимо разработать специфические антитела против аминокислот 540 - 707 фрагмент человеческого СПДК. Кроме того, идентификация конкретного лектина признать СПДК переплете N -glycan является альтернативным способом анализа человеческого СПДК N -glycosylation 42. Кроме того, определение состава и структуры каждого N -glycan цепи связывания в SCAP (N263, N590 и N641) облегчит наше понимание основного механизма торговли SCAP из ЭР к Гольджи.
Кроме того, для получения наилучших результатов для обнаружения СПДК N -glycosylation, мы скорректировали некоторые параметры реакции в соответствии с нашими экспериментальными условиями, которые модифицированы из способов , описанных в публикациях от Брауна и Goldstein лаборатории 15. Для того, чтобы успешно обнаружить SCAP белка и его N -glycosylation, качество мембранных фракций и ядерных экстрактов очень важны, Мы непосредственно определяли концентрацию белка после мембранных фракций инкубировали при 37 ° C, избегая ввода образца обратно на лед. Описанный здесь метод может быть широко применен к различным областям исследований, в том числе рака, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и ожирения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
