Abstract
Des souris rapporteurs ont été largement utilisés pour observer la localisation de l'expression des gènes ciblés. Ce protocole met l'accent sur une stratégie visant à établir un nouveau modèle de souris transgénique journaliste. Nous avons choisi de visualiser l'interleukine (IL) 22 l'expression des gènes, car cette cytokine a des activités importantes dans l'intestin, où elle contribue à réparer les tissus endommagés par l'inflammation. Les systèmes rapporteurs offrent des avantages considérables par rapport aux autres procédés permettant d'identifier les produits in vivo. Dans le cas de l' IL-22, d' autres études ont d' abord isolé les cellules des tissus, puis re-stimulé les cellules in vitro. IL-22, qui est normalement sécrétée, est emprisonné à l'intérieur des cellules à l'aide d'un médicament, et une coloration intracellulaire a été utilisé pour visualiser. Cette méthode identifie les cellules capables de produire de l' IL-22, mais il ne détermine pas si elles le faisaient in vivo. La conception reporteur comprend l'insertion d'un gène pour une protéine fluorescente (tdTomato) dans le gène IL-22 dans un tel way que la protéine fluorescente ne peut être sécrété et donc reste piégée à l' intérieur des cellules productrices in vivo. Producteurs fluorescentes peuvent ensuite être visualisées dans des coupes de tissus ou par une analyse ex vivo par cytométrie de flux. Le processus de construction proprement dite pour le journaliste inclus recombineering un chromosome artificiel bactérien qui contenait le gène IL-22. Ce chromosome manipulé est ensuite introduit dans le génome de la souris. Homéostatique de l'IL-22 reporteur expression a été observée dans les tissus de souris différentes, y compris la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer, et de l'intestin, par cytométrie de flux. Colite a été induite par des cellules T (CD4 + CD45RBhigh) le transfert et l' expression du journaliste a été visualisé. Les cellules T positives sont d'abord présentes dans les ganglions lymphatiques mésentériques, puis ils se sont accumulés à l'intérieur de la lamina propria des petits tissus de l'intestin grêle et du côlon distal. La stratégie utilisant BACs a donné une bonne fidélité reporter l'expression par rapport à l'IL-22 expression, et il est plus simple que les procédures knock-in.
Introduction
Cellule expression spécifique du type de gènes rapporteurs est utile pour identifier les cellules exprimant activement la cible dans les tissus sous état homéostatique et perturbés. Elle permet aussi la purification de ces cellules, qui restent viables, pour étudier leurs autres propriétés. Des souris rapporteurs ont été utilisés dans l'élucidation du mécanisme d'action de cytokines spécifiques, des facteurs de transcription, et des éléments régulateurs. Stratégies Précédent 1, 2, 3 ont largement compté sur frapper le journaliste dans le locus cible dans le chromosome de la souris, une procédure fastidieuse et coûteuse. Ainsi, un procédé plus simple pour la génération de souris rapporteurs est souhaitable.
Les cytokines sont une large classe de petites protéines sécrétées / peptides qui régulent les réponses immunitaires par le biais de la signalisation intercellulaire. Interleukine 22 (IL-22) est une cytokine avec beaucoup rapporté activités, y compris la barrière function, la réparation des tissus, et l' inflammation 4. Bien que l' IL-22 a d' abord été découvert en tant que produit des cellules T 5, les rapports subséquents ont démontré son expression dans tueuses naturelles (cellules NK) chez les humains et les souris 6 7 et dans d' autres classes de lymphocytes innées 8. Malgré une vaste observation de cellules-22 produisant IL, la visualisation de l' IL-22 précédemment nécessaire stimulation ex vivo et perméabilisation aux taches avec des anticorps. Par conséquent, le roman IL-22 souris rapporteurs serait un outil très utile pour étudier la fonction de l'IL-22 dans les processus homéostatique et pathogènes.
Ici, nous avons développé un modèle de souris transgénique journaliste simplifiée pour observer les cellules IL-22 produisant in vivo et in vitro. En utilisant une méthode BAC recombineering 9, nous avons inséré la séquence tdTomato ADNc avec Poly A fragments de signal dans l'IL-22 locnous et remplacé exon 1. Les autres régions, exons, et des éléments régulateurs non traduites ne sont pas perturbés, puisque nous voudrions imiter la régulation naturelle de l'IL-22, autant que possible. Le site d'insertion reporteur perturbe la séquence signal, ce qui entraîne l'accumulation du reporteur dans les cellules productrices, contrairement à l'IL-22 elle-même, qui est rapidement sécrété. Ce nouveau procédé peut également être appliqué à la production de souris rapporteurs pour d'autres protéines sécrétées.
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Protocol
Tous les animaux ont reçu des soins appropriés conformément aux procédures expérimentales décrites dans le Guide 2011 pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire Comité de Frédéric Laboratoire national de recherche sur le cancer.
1. Production d'IL-22-tdTomato Reporter Souris par BAC Recombineering
NOTE: Les souris doivent être inconscient et ne se déplacent pas en réponse à un stimulus nociceptif. Stériliser la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol et stériliser les instruments chirurgicaux à l'aide d'un stérilisateur à billes de verre.
- Purifier ADN de BAC (RP23-401E11, la longueur du clone 228391 bps) en utilisant un procédé d'extraction alcaline 10, 11. Caractériser le clone BAC par Spel digestion de 5 pg de RP23-401E11 pour confirmer la taille correcte du gène cible. NOTE: L'ADN BAC a été digéré en 14 fragments.
- Insérer le gène rapporteur tdTomato dans le site Not I / Sal I du vecteur navette PLD53SC-A-GFP-B11 et de remplacer le gène de la GFP dans le même site. Ensuite, en utilisant BAC RP23-401E11 comme matrice, amplifier les boîtes d'homologie (A et B) au premier exon traduction du IL-22 (exon 1) par PCR (95 ° C , 2 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 30 secondes et une extension finale à 72 ° C pendant 10 minutes). Dans un système de réaction de PCR de 50 ul, ajouter 50 ng (1 ul) d'ADN de BAC, 0,5 pi d'amorce (10 pM), 40 pl de PCR Supermix haute fidélité, et 8 ul de H 2 O.
NOTE: Les amorces pour les cases A et B sont les suivantes: Une boîte Forward: 5'T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG et Reverse: 5'CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Case B Forward: 5'G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA et Reverse: 5' - T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Les sites des enzymes de restriction (Asc I et Pac I) sont soulignés. - Ligaturer 500 ng de Ascl digéré A et 500 ng de Pac I digéré B fragments dans 50 ng de PLD53SC-ATB (tdTomato) vecteur à 16 ° C pendant 1 heure.
- Transformer le vecteur PLD53SC-ATB purifiée dans des cellules de BAC-11 compétente et la culture les sur Luria-Bertani (LB) des plaques de gélose avec chloramphénicol (20 pg / ml) et de l' ampicilline (30 pg / ml) à 37 ° C. Choisissez deux à trois colonies de co-intégration des maîtres plaques Ch / Amp.
- Inoculer chaque colonie dans 1 ml de LB additionné de 20 pg / ml de chloramphenicol et on incube les pendant 1 heure à 37 ° C et à 225 tours par minute. Se propager 100 ul de chaque mélange sur une plaque de LB-agar (10 g de peptone 140, 5 g d'extrait de levure, 12 g d'agar et 1 litre d'eau; pH 7,5) additionné de chloramphénicol, de 4-4,5% de saccharose. Incuber la culture de la nuit à 37 ° C.
- Choisissez les deux colonies, petits et grands et replate eux sur deux plaques LB-agar avec chloramphénicol. Ensuite, exposer les plaques avec ou sans lumière UV pendant 30 secondes et ramasser les colonies sensibles aux UV pour une analyse plus approfondie.
- Identifier l'ADN de BAC modifié par PCR en utilisant tdTomato / IL-22 amorce hétérozygote (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT Gat ggT; inverse: 5' TGT AAT Cgg ggA TGT Cgg C). Les conditions du thermocycleur sont les suivantes: 95 ° C pendant 2 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 56 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 30 secondes; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
- Confirmer la séquence de la zone modifiée du BAC par séquençage direct de BAC grand-prep BAC ADN 12.
- Anesthetize une souris receveuse avec une dose de 0,25% tribromoéthanol dans la cavité péritonéale lors de l'implantation des zygotes microinjection dans C57BL souris / 6c pseudo-enceinte.
- Linéariser l'IL-22 tdTomato BAC construction (10 ug) par digestion avec 5 pi de restriction endonucleasePi-Scel dans 100 ul du système réactionnel et micro - injection de l'ADN de BAC linéarisé dans des oeufs fécondés de souris C57BL / 6 femelles au stade pronucléaire 13. Screen souris transgéniques par une analyse par transfert de Southern de l'ADN isolé à partir de biopsies de la queue en utilisant des procédures standard.
Préparation 2. Single-cellule à partir de la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques et Patch de Peyer
REMARQUE: les souris rapporteurs IL-22-tdTomato ont été maintenus à l'Institut national du cancer (NCI, Frederick, MD). La méthode d'euthanasie est conforme aux plus récentes lignes directrices AVMA sur l'euthanasie. Toutes les souris ont été euthanasiés en utilisant inhalation de CO 2 14.
- Euthanasier un IL-22-tdTomato souris dans une chambre de CO 2 et de le mettre sur un tampon propre. Stériliser la peau de l'abdomen par pulvérisation de 70% d'alcool et le couper ouvert. Enlever la rate dans le flanc gauche et le thymus derrière le sternum.
- Pour récolter les nœuds de mesentericlymph (situé dans le tissu mésentérique) et les plaques de Peyer (petites lymphoidnodules dans toute la région de l'iléon de l'intestin grêle), prendre la nacrée mésentérique blanc nœuds près de til paroi de l'intestin grêle, en utilisant disséquer pince avec des pointes à pointe fine dentelées d'abord, puis retirer l'ensemble de l'intestin grêle et le côlon hors du corps. Trouver les patches ovales étendus (les patches de Peyer) le long de l'intestin et les couper avec des ciseaux. Broyer ces tissus lymphoïdes (ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer) individuellement entre deux lames dépolies en une suspension monocellulaire dans du PBS / 1% de sérum bovin fœtal (FBS) du tampon sur glace.
- Hacher la rate ou des tissus thymus en utilisant la même méthode que dans l'étape 2.2. Centrifuger la suspension splénique pendant 8 minutes à 500 g et 4 ° C. Ajouter 1 ml de tampon de lyse ACK par rate pour les culots cellulaires.
- Bien mélanger et laisser reposer pendant 1 min. Ajouter 9 ml de tampon de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à chaque échantillon. Isoler par centrifugation pendant 8 minutes à 500 x g et 4 ° C pour éliminer les globules rouges.
REMARQUE: Ne pas ajouter un tampon de lyse ACK aux cellules du thymus. - Remettre en suspension les leucocytes obtenus dans 5 ml de PBS et pass les cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um. Collecter les culots cellulaires par centrifugation à 500 g pendant 8 min.
- Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu RPMI ou tampon FACS et compter les cellules viables en utilisant un colorant bleu solution à 0,4% de trypan / PBS.
3. Isolation des intraépithéliale Lymphocytes et lamina propria cellules de l'intestin
- Ouvrez la peau abdominale comme dans l'étape 2.1, couper le petit intestin, du duodénum (à côté de l'estomac) à iléon (près de l'annexe), et l'ensemble du côlon, juste au-dessus de l'anus. Retirez le tissu adipeux supplémentaire et forceps de tissu en utilisant mésentériques. Mettez les intestins immédiatement dans du PBS glacé.
- Recherchez les plaques de Peyer (petits nodules rugueux) le long de la région distale de l'intestin grêle. Retirer les masses à l'aide de forceps Andopen l'intestin de la longueur à l'aide de ciseaux. Rincer soigneusement l'intestin avec 10 ml de PBS glacé.
- Incuber les tissus dans 20 ml de tampon de pré-digestion (EDTA 5 mMet dithiothréitol 1 mM dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS)) pendant 30 min à 37 ° C avec une rotation lente (50 tours par minute) dans un agitateur. Après chacune de 2 incubations, enlever la couche de cellules épithéliales, contenant les lymphocytes intraépithéliaux (LIE) de, par tourbillonnement intense (30 sec à 12000 rpm) et de transmettre tous les tissus à travers un tamis cellulaire de 100 um.
- Ajouter 20 ml d'une nouvelle solution d'EDTA au tissu pour la deuxième incubation pendant 30 min à 37 ° C. Passez les fractions IEL à travers un tamis cellulaire de 100 um et les mettre en commun avec les fractions précédentes. Gardez les fragments de l'intestin restant sur la glace à traiter à l'étape 3.9.
- Centrifuger les fractions IEL regroupées à 800 g pendant 5 min à 4 ° C. Laver les fractions IEL regroupées avec 10 ml de HBSS / 5% de FBS et de spin-les pendant 5 min à 800 xg et 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans 8 ml de milieu 44% de silice colloïdale 15 et de les recouvrir avec 5 ml de milieu à 67% de silice colloïdale. Centrifuger 44% / 670,5% gradient de mélange de cellules pendant 20 minutes à la température ambiante et 1500 x g.
- Recueillir les cellules IEL de la bande à l'interface. Tout d'abord, enlever la couche supérieure du surnageant (environ 5 ml) en utilisant 1 ml pipette. Ensuite, IELs de récolte à l'interphase du milieu de gradient de silice colloïdale.
- Laver les IELs en ajoutant 10 ml de milieu RPMI. Faites tourner les cellules vers le bas pendant 5 minutes à 800 xg et 4 ° C. Remettre en suspension les IELs dans 5 ml de RPMI pour l'étape 3.15.
- Pour l'isolement des lymphocytes de la lamina propria (LPLs), émincer les fragments de tissu intestinal à partir de l'étape 3.4 en petits morceaux avec des ciseaux (1 mm) et de digérer les morceaux avec 10 ml de tampon de digestion (0,05 g de collagénase, 0,05 g de DNasel, et 0,3 g de dispase II dans du RPMI / 5% de FBS) pendant 15 à 20 min à 37 ° C.
- Filtrer le mélange à travers un tamis cellulaire de 70 pm. Le surnageant d'écoulement contient le LPL libéré.
- digérer complètement les fragments d'intestin en répétant les étapes 03.09 à 03.10 (normalement, ils doivent êtrerépété 3 fois). Chaque fois, mutualiser les surnageants contenant le LPLs.
- Recueillir les cellules par centrifugation pendant 5 min à 1500 x g et à température ambiante et remise en suspension des culots dans du RPMI / 5% de FBS. Passez-les à travers une cellule crépine de 40 um.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans 10 ml de la fraction 40% d'un milieu gradient de 40:80 de la silice colloïdale et les superposer sur 5 ml de la fraction de 80% dans un tube de 15 ml.
- Effectuer la séparation de gradient de densité par centrifugation pendant 20 min à 1500 xg et à température ambiante 15.
- Recueillir le LPLs, comme décrit à l'étape 3.7. Laver une fois avec 10 ml de PBS et remettre en suspension les culots dans 1 ml de PBS / 1% de FBS tampon ou un milieu RPMI.
- Compter les cellules viables (à la fois IELS et LPLs) en utilisant un colorant bleu solution à 0,4% de trypan / PBS.
4. Expression de l'IL-22 dans la rectocolite tdTomato
- Préparer des suspensions de cellules de rate de souris simples IL-22-tdTomato à une concentration de 1 x 10 <sup> 7 cellules / ml dans du PBS stérile, tel que décrit dans les étapes 2.1-2.4.
- Purifier les cellules T CD4 + à l' aide de la souris CD4 cellulaire méthode d'isolement négative 10. Les marquer avec des anticorps anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 cellules dans du PBS Tampon de FBS / 1%) et de l' anti-CD45RB-FITC (clone 16A, 0,5 ul / 1 x 10 6 cellules dans du PBS / 1% de tampon FBS) par incubation à 4 ° C pendant 30 min.
- Faites tourner les cellules vers le bas pendant 5 minutes à 500 g et 4 ° C. Laver les cellules avec 2 ml de tampon / PBS à 1% de FBS et les remettre en suspension dans 1 ml de / 1% de FBS tampon de coloration du PBS.
- Exécutez les cellules T marquées sur une cytométrie en flux machine à 16. Porte des cellules sur une population de lymphocytes T et trier les cellules CD4 + CD45RB élevées doubles-positives (la longueur d' onde détectée à 488 nm et 633 nm) lasers.
- Récolter les cellules triées par centrifugation pendant 5 min à 500 g et 4 ° C. Remettre en suspension les culots cellulaires dans du tampon PBS stérile à 1 x 10 6 6) dans le péritoine ofeach Rag1 - souris receveuse - /.
- Sacrifiez les souris receveuses sous CO 2 à différents points de temps. Récolter les ganglions lymphatiques mésentériques et les petits et gros intestin, comme décrit dans les étapes 2.1 et 2.2. Mettez chaque ganglion mésentérique et découpez-ouverte intestin (papier / intestin / papier en sandwich) dans 4% de paraformaldehyde (PFA; manipuler sous une hotte) pendant la nuit pour réparer les tissus. Remplacer le PFA avec 18% de saccharose pendant 16-24 h, puis congeler les tissus pour sectionner.
- Utilisez la machine de cryostat pour couper le tissu 17, 18, 19. Chauffer les sections de tissu à la température ambiante pendant environ 60 min et placez-les dans de l'acétone pendant 10 min à température ambiante. Séchez-les à température ambiante pendant environ 5 min.
- Ajouter FBS en excès, l'enlever à la pipette, et d'ajouter anti-DP à une dilution 1: 200 dans 0,1% de BSA / 1x PBS. Incuber l'anticorps à 37 ° C pendant 60 min.
- Rincer les sections dans du PBS 1X pendant 10 minutes et d'appliquer l'anticorps secondaire correspondant (chèvre anti-lapin 568) au tissu, dilué 1: 300 dans 1% de BSA / PBS 1x, pendant 30 min à température ambiante.
- Rincer les lames dans 1x PBS pendant 10 minutes, les essuyer, et d'ajouter des lamelles.
- Visualisez tous les échantillons avec un microscope à fluorescence sous éclairage constant (RFP: filtre d'excitation 540-580 nm) en utilisant l'objectif 40X.
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Representative Results
A murine IL-22 journaliste transgène a été créée en utilisant recombineering pour modifier un chromosome bactérien artificiel portant le locus IL-22. La figure 1 représente un schéma du vecteur contenant le gène de pBACe3.6 sacBII, un marqueur de sélection positif et chloramphénicol gène de résistance à 11. Après l' introduction tdTomato dans l' exon 1, la séquence du peptide signal a été perturbé, comme représenté sur la figure 2. Ainsi, le journaliste de tdTomato a été emprisonné à l'intérieur des cellules IL-22 exprimant, permettant leur détection et leur isolement par cytométrie en flux. Les souris homozygotes ont été élevés à partir de lignées fondatrices et criblés par PCR, et ils ne nécessitent rétrocroisement afin d'obtenir une descendance avec l'identité génétique, comme cela est nécessaire dans la stratégie knock-in habituelle. Pour tester la fidélité de l'IL-22 reporters, des splénocytes -generated in vitro ont été mises en culture dans des conditions neutres ou TH22.
Figure 1: Carte du vecteur pBACe3.6 du site. pBACe3.6 se caractérise par la résistance aux antibiotiques contenant du chloramphénicol et un gène sacBII comme un marqueur positif de sélection. Au cours de la recombinaison, les clones désirés sont le saccharose résistant par leur exprimant le gène sacBII et sont autorisés à croître sur des milieux contenant du saccharose, alors que les colonies négatives BAC sont le saccharose-sensible.
Figure 2: Vue schématique du clone RP23-401E11 BAC modifié. Un gène rapporteur tdTomato a été introduit dans l'Il-22 locus, qui comprend l'IL-22 et de régulation des éléments dans un chromosome artificiel bactérien (BAC RP23-401E11) de souris, en utilisant la technologie de recombineering. Par recombinaison homologue, la séquence du peptide signal de l' IL-22 dans la BAC a été perturbée et l' exon 1 du Il-22 a été remplacé par le gène rapporteur tdTomato. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Identification de l' IL-22 journalistes dans les splénocytes en culture in vitro. les cellules T CD4 ont été purifiés à partir de la rate et ensuite stimulées avec des anticorps anti-CD28; anti-CD3 (condition neutre); ou anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β et de 6-Formylindolo (3,2-b) carbazole (FICZ) pendant 5 jours. IL-22-tdTomato a été analysée par cytométrie en flux (en haut deux) et la microscopie à fluorescence (deux en bas, barre d'échelle: 100 um). Les nombres dans les quarts de cercle indiquent le pour cent des cellules CD45 +.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Visualisation des cellules dans les tissus de souris différentes IL-22-production. Les suspensions de cellules uniques ont été préparées à partir de la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques, les intestins (IEL et LP), et les plaques de Peyer. Ils ont ensuite été colorées en surface avec FITC anti-CD3 et examinées pour l'expression de tdTomato. MLN: ganglion mésentérique, RLA: axillaire ganglionnaire, PP: les plaques de Peyer, IEL: cellules intraépithéliales isolées à partir de l'intestin grêle, LP: cellules de la lamina propria purifiée à partir de l'intestin grêle. Les nombres dans les quarts de cercle indiquent le pour cent des cellules CD45 +. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Localisation de l' IL-22 reporters au cours du développement du transfert de lymphocytes T colite. les cellules de l'IL-22 de souris rapporteurs CD4CD45RBHigh T ont été transférés dans Rag1 - / - souris, et les signaux de tdTomato ont été évalués par immunohistochimie dans les différents tissus à différents moments au cours du développement de la colite. Les flèches indiquent les signaux de l'IL-22 tdTomato. Barres d'échelle = 25 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
IL-22 joue un rôle essentiel dans la défense de l'hôte et le remodelage des tissus innées. Des cellules de production d' IL-22 ont été identifiées par une coloration ex vivo intracellulaire. Cependant, il reste encore difficile de suivre l' expression de l' IL-22 in situ, soit dans l'état normal ou dans des conditions inflammatoires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer un modèle de souris reporter IL-22, ce qui nous permet de localiser les cellules rapporteurs exprimant in vivo. Le codage tdTomato du gène rapporteur a été inséré dans le locus de l'IL-22 à un site qui perturbe la séquence signal. Cette stratégie se traduit par le journaliste étant piégés dans la cellule productrice, contrairement à l'IL-22 qui est rapidement sécrétée, ce qui permet la visualisation de la cellule productrice. IL-22-reporteur conçu était contenu dans un grand taux d'alcoolémie dans le but de préserver les éléments de régulation, conférant ainsi la fidélité d'expression du rapporteur correspondant à celle de l'IL-22. Les tissus intestinaux des m transgéniquesglace affiche expression rapporteur homéostatique dans les cellules T CD4 et lymphocytes innées dans la lamina propria de l'intestin grêle. Dans la colite induite, les cellules T CD4 ont exprimé le journaliste dans le côlon.
Le rôle de l'IL-22 dans la maladie inflammatoire de l'intestin est peu claire. En participant à la défense de la muqueuse et la régénération des tissus intestinaux, l' IL-22 est capable d'induire la production de deux de protection 20, 21, 22 et des médiateurs pro - inflammatoires (par exemple IL-8) 23, 24. Deux modèles de T colite entraîné cellulaire ont montré une augmentation de l'IL-22 dans le côlon, y compris TCR α - / - souris 25, 26 et le modèle de transfert CD45RB de salut 27. On compare les modèles de la maladie intestinale inflammatoire, l'expression de l'IL-22 dans l'intestin était plus élevé dans un Crla maladie de modelthan de ohn dans un modèle de recto - colite hémorragique 21, 24 .Ici, on transfère les cellules T CD4CD45RBhi des souris rapporteurs dans Rag1 - / - et les destinataires mimer le processus pathogène de la maladie de Crohn. Nous avons constaté que, la colite précédente, IL-22 journalistes ont été visualisées dans l'intestin des ganglions lymphatiques drainants (MLN). Les signaux alors diminués dans le MLN et déplacés vers les intestins, en particulier les petits intestins et colons distales, avec le développement de la colite. La plupart des journalistes de tdTomato ont été localisés à l'intérieur de la muqueuse lamina propria de l'intestin.
Un type de journaliste pour IL-22 différente a été décrit précédemment, dans lequel les cellules sont marquées en permanence de telle sorte qu'elles et leurs filles continuent d'exprimer le journaliste, que la transcription de l' IL-22 ou non a continué 28. Comme dans notre étude, gut lymphocytes innées ont été marquées dans des conditions homéostatiques, et dans la colite, til reporteur a été localisée dans les cellules T des ganglions lymphatiques mésentériques au tissu intestinal.
Les procédures décrites dans ce protocole seraient applicables pour l'établissement d'autres souris transgène rapporteurs, comme l'IL-17, IL-25, et ainsi de suite. Cependant, il est essentiel de choisir des clones BAC convenables portant distales des éléments régulateurs pour assurer la fidélité de l'expression du gène rapporteur, étant donné que les transgènes sont intégrés de manière aléatoire dans le génome de la souris. La souris rapporteur permet l'identification des cellules exprimant in vivo, ainsi que pour la purification et la caractérisation de cellules vivantes. Nous avons utilisé tdTomato, une protéine fluorescente rouge exceptionnellement brillant, comme un gène rapporteur fluorescent pour rendre le rapporteur approprié pour les études d'imagerie d'animaux vivants.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
