Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Published: January 25, 2017 doi: 10.3791/54710

Abstract

Reporter-Mäuse wurden weithin verwendet, um die Lokalisierung der Expression von Genen gezielt zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine Strategie einen neuen transgenen Reporter Mausmodell zu etablieren. Wir entschieden uns für Interleukin (IL) 22 Genexpression zu visualisieren, da dieses Zytokin wichtige Aktivitäten im Darm hat, wo sie einen Beitrag durch eine Entzündung beschädigte Gewebe zu reparieren. Reporter - Systeme bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Produkte in vivo zu identifizieren. Im Falle von IL-22, hatte andere Studien ersten Zellen aus Geweben isoliert und dann die Zellen in vitro erneut stimuliert. IL-22, das normalerweise ausgeschieden wird, wurde in den Zellen unter Verwendung eines Arzneimittels gefangen, und die intrazelluläre Färbung wurde verwendet, um es zu visualisieren. Dieses Verfahren identifiziert Zellen, die Herstellung von IL-22, aber nicht bestimmen , ob sie in vivo Dabei wurden. Der Reporter Design enthält ein Gen für ein fluoreszierendes Protein (tdTomato) in den IL-22-Gen in einer solchen wa Einfügeny , die das fluoreszierende Protein nicht sezerniert werden und bleibt daher in den produzierenden Zellen in vivo gefangen. Fluoreszierende Produzenten können dann in Gewebeschnitten oder durch ex vivo Analyse durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. Die eigentlichen Bauprozess für die Reporter enthalten ein bakterielles künstliches Chromosom Recombineering, die die IL-22-Gen enthielt. Dieses erzeugte Chromosom wurde dann in das Mausgenom eingeführt. Homöostatischen IL-22-Reporter-Expression in verschiedenen Mausgeweben, einschließlich der Milz, Thymus, Lymphknoten, Peyerschen Plaques und Darm, durch Durchflusszytometrie-Analyse beobachtet. Kolitis wurde von T-Zellen (CD4 + CD45RBhigh) Transfer induziert und Reporterexpression sichtbar gemacht wurde. Positive T-Zellen wurden zunächst die in den mesenterischen Lymphknoten und dann akkumuliert sie in der Lamina propria des distalen Dünndarm und Dickdarm Gewebe. Die Strategie BACs gab gute Treue Reporterexpression im Vergleich zu IL-22 Expres mitsion, und es ist einfacher als Knock-in-Verfahren.

Introduction

Zelltyp-spezifische Expression von Reportergenen ist nützlich exprimierenden Zellen in das Zielgewebe unter homöostatischen und gestörter Zustände aktiv zu identifizieren. Es ermöglicht auch die Reinigung dieser Zellen, die lebensfähig bleiben, ihre anderen Eigenschaften zu untersuchen. Reporter-Mäuse wurden bei der Aufklärung der Wirkmechanismus für bestimmte Zytokine, Transkriptionsfaktoren und regulatorische Elemente verwendet. Bisherigen Strategien 1, 2, 3 haben sich auf Klopfen der Reporter in den Ziel - Locus in der Maus - Chromosom, ein zeitraubende und kostspieliges Verfahren weitgehend verlassen. Somit ist eine einfachere Methode zur Erzeugung von Reportermäusen wünschenswert.

Cytokine sind eine breite Klasse von kleinen, sekretierte Proteine ​​/ Peptide, die Immunreaktionen durch interzelluläre Signalübertragung regulieren. Interleukin 22 (IL-22) ist ein Zytokin mit vielen Aktivitäten berichtet, einschließlich Barriere function, die Reparatur von Gewebe und Entzündungen 4. Obwohl IL-22 anfangs als T-Zellprodukt 5 demonstrierte nachfolgende entdeckt wurde berichtet seine Expression in natürlichen Killer (NK) -Zellen in Menschen und Mäusen 6 7 und in anderen Klassen von angeborenen Lymphozyten 8. Trotz intensiver Beobachtung von IL-22-produzierenden Zellen, die Visualisierung von IL-22 bisher erforderlichen ex vivo Stimulation und Permeabilisierung zu Flecken mit Antikörpern. Daher wäre Roman IL-22-Reporter-Mäuse ein sehr nützliches Werkzeug, um die Funktion von IL-22 in Homöostase und pathogenen Prozessen zu untersuchen.

Hier entwickelten wir ein vereinfachtes transgenes Mausmodell reporter die IL-22-produzierenden Zellen in vivo und in vitro zu beobachten. Mit Hilfe eines BAC Recombineering Methode 9, legten wir die tdTomato cDNA - Sequenz mit Poly - A - Signal - Fragmente in die IL-22 locuns und ersetzt Exon 1. Die anderen untranslatierten Regionen, Exons und regulatorische Elemente nicht gestört wurden, da wir die natürliche Regulation von IL-22, so viel wie möglich zu imitieren möchten. Der Ort der Reporter Insertion unterbricht die Signalsequenz, was zu der Ansammlung des Reporter innerhalb der produzierenden Zellen, im Gegensatz zu IL-22 selbst, die schnell ausgeschieden wird. Dieses neue Verfahren kann auch zur Erzeugung von Reportermäusen für andere sekretierte Proteine ​​angewendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Tiere erhielten die richtige Pflege in Übereinstimmung mit den im Guide 2011 skizzierten experimentellen Verfahren zur Pflege und Verwendung von Labortieren Komitee Frederick National Laboratory for Cancer Research.

1. Erzeugung von IL-22-tdTomato Reporter Mäusen durch BAC Recombineering

HINWEIS: Die Mäuse sollten bewusstlos sein und nicht als Reaktion auf einen schädlichen Reiz bewegen. Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 70% Ethanol und zu sterilisieren alle chirurgischen Werkzeuge, um eine Glasperle Sterilisator verwenden.

  1. Reinige BAC - DNA (RP23-401E11, clone Länge 228.391 bps) unter Verwendung eines alkalischen Extraktionsverfahren 10, 11. Charakterisieren Sie den BAC-Klon durch SpeI Verdauung von 5 ug RP23-401E11 die korrekte Größe des Zielgens zu bestätigen. HINWEIS: Die BAC DNA wurde in 14 Fragmente gespalten.
  2. Legen Sie die tdTomato Reporter-Gen in die Not I / Sal I-Stelle des PLD53SC-A-GFP-B-Shuttle-Vektor11 und das GFP - Gen in der gleichen Stelle ersetzen. Dann als Matrize BAC RP23-401E11, verstärken die Homologie - Boxen (A und B) zu dem ersten übersetzten Exon von Il-22 (Exon 1) durch PCR (95 ° C 2 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec, und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min). In einem 50 & mgr; l PCR - Reaktionssystem, werden 50 ng (1 & mgr; l) von BAC - DNA, 0,5 ul Primer (10 uM), 40 ul PCR Supermix high fidelity und 8 & mgr; l H 2 O.
    HINWEIS: Die Primer für die A- und B - Boxen sind wie folgt: Ein Feld Forward: 5 'T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG und Reverse: 5' CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B - Box vorwärts: 5' - G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA und Reverse: 5 'T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Die Standorte der Restriktionsenzyme (Asc I und Pac I) sind unterstrichen.
  3. Ligieren 500 ng Asc I-verdaute A und 500 ng von Pac I-verdaute B fragments in 50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) Vektor bei 16 ° C für 1 Stunde.
  4. Transformieren des gereinigten PLD53SC-ATB Vektors in BAC-kompetente Zellen 11 und Kultur sie auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten mit Chloramphenicol (20 ug / ml) und Ampicillin (30 ug / ml) bei 37 ° C. Wählen Sie zwei vor drei Kolonien von Co-Integration von den Ch / Amp Master-Platten.
  5. Beimpfen jede Kolonie in 1 ml LB, ergänzt mit 20 ug / ml Chloramphenicol und inkubiert sie für 1 h bei 37 ° C und 225 rpm. Verbreiten 100 ul jeder Mischung auf einem LB-Agarplatte (10 g Pepton 140, 5 g Hefeextrakt, 12 g Agar und 1 l Wasser, pH 7,5), ergänzt mit Chloramphenicol und 4-4,5% Saccharose. Inkubieren der Kultur über Nacht bei 37 ° C.
  6. Wählen Sie große und kleine Kolonien und Ausstrich sie auf zwei LB-Agar-Platten mit Chloramphenicol. Dann setzen die Platten entweder mit oder ohne UV-Licht für 30 Sekunden und wählen Sie die UV-empfindlichen Kolonien zur weiteren Analyse.
  7. Identifizieren Sie die modifizierten BAC-DNA durch PCR unter Verwendung tdTomato / IL-22 heterozygot Primer (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT ggT; Reverse: 5' TGT AAT Cgg ggA TGT Cgg C). Die Thermocycler-Bedingungen sind wie folgt: 95 ° C für 2 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 56 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec; und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min.
  8. Bestätigen die Sequenz des modifizierten Bereich des BAC durch direkte Sequenzierung BAC groß prep BAC DNA 12.
  9. Anästhesieren einen Empfänger-Maus mit einer Dosis von 0,25% Tribromethanol in die Bauchhöhle bei der mikroinjizierten Zygoten in pseudo-schwangeren C57BL / 6c Mäuse implantiert.
  10. Linearisieren der IL-22-tdTomato BAC (10 & mgr; g) durch Verdau mit 5 ul Restriktions endonucleasePi-SceI in 100 & mgr; l des Reaktionssystems zu konstruieren und die linearisierte BAC DNA in befruchtete Eier von C57BL / 6 - Weibchen im Vorkernstadium 13 microinject. Screen den transgenen Mäusen durch Southern-Blot-Analyse von DNA aus Schwanzbiopsien unter Verwendung von Standardverfahren isoliert.

2. Single-Zell-Herstellung aus Milzen, Thymus, Lymphknoten und Peyer-Patch-

HINWEIS: IL-22-tdTomato Reporter-Mäuse am National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD) gehalten wurden. Die Euthanasie-Verfahren entspricht den neuesten AVMA Richtlinien zur Euthanasie. Alle Mäuse wurden unter Verwendung von CO 2 Inhalation 14 euthanasiert.

  1. Euthanize eine IL-22-tdTomato Maus in einem CO 2 Kammer und legte es auf eine saubere Unterlage. Sterilisieren Sie den Bauch Haut um 70% Alkohol besprühen und schneiden Sie es auf. Entfernen Sie die Milz in der linken Flanke und den Thymus hinter dem Brustbein.
  2. Um die mesentericlymph Knoten ernten (im mesenterialen Gewebe befindet) und Peyer-Plaques (kleine lymphoidnodules im gesamten Ileum Bereich des Dünndarms), nehmen Sie die Perlweiß mesenteric Knoten der Nähe ter Wand des Dünndarms Zange mit ersten feinen Punkt geriffelten Spitzen mit sezieren und entfernen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm aus dem Körper heraus. Finden Sie die erweiterte ovale Patches (Peyer-Plaques) entlang des Darms und schneiden Sie sie mit einer Schere. Grind diese Lymphgewebe (Lymphknoten und Peyer-Plaques), die einzeln zwischen zwei mattierten Folien in eine Einzelzellsuspension in PBS / 1% fötalem Rinderserum (FBS) Puffer auf Eis.
  3. Zerhacken der Milz oder Thymus-Gewebe unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Schritt 2.2. Zentrifugieren Sie die Milz- Suspension für 8 min bei 500 × g und 4 ° C. 1 ml ACK Lysepuffer pro Milz an die Zellpellets.
  4. Gut mischen und lassen Sie sie für 1 min stehen. Hinzufügen 9 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Puffer zu jeder Probe. Zentrifugieren durch Zentrifugation für 8 min bei 500 xg und 4 ° C, um die roten Blutkörperchen zu entfernen.
    HINWEIS: Verwenden Sie keine ACK Lysepuffer in den Thymus-Zellen hinzuzufügen.
  5. Resuspendieren der resultierenden Leukocyten in 5 ml PBS und pass die Zellen durch ein 100 & mgr; m Zelle Sieb. Sammle die Zellpellets durch Zentrifugation bei 500 × g für 8 min.
  6. Resuspendieren der Zellen in 5 ml RPMI-Medium oder FACS-Puffer und zählt die lebensfähigen Zellen 0,4% Trypanblau-Farbstoff / PBS-Lösung.

3. Isolierung von intraepitheliale Lymphozyten und Lamina propria Zellen aus den Därmen

  1. Öffnen Sie die Bauchhaut, wie in Schritt 2.1, schneiden Sie den Dünndarm, von Duodenum (neben dem Magen) zu Ileum (in der Nähe der Anlage) und das gesamte Kolon, direkt über dem Anus. Entfernen Sie die zusätzlichen Fett- und mesenterialen Gewebe mit einer Pinzette. Setzen Sie den Darm sofort in eiskaltem PBS.
  2. Geben Sie für Peyer-Plaques (kleine, raue Knoten) entlang dem distalen Bereich des Dünndarms. Entfernen Sie die Massen mit einer Pinzette andopen den Darm der Länge nach einer Schere. Gründlich spülen Darm mit 10 ml eiskaltem PBS.
  3. Inkubieren des Gewebes in 20 ml vorgeVerdauungsPuffer (5 mM EDTAund 1 mM Dithiothreitol in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)) für 30 min bei 37 ° C unter langsamer Rotation (50 rpm) in einem Schüttler. Nach jedem von 2 Inkubationen, entfernen Sie die epithelialen Zellschicht, die intraepitheliale Lymphozyten (IELs), durch intensive Verwirbelung (30 sec bei 12.000 Umdrehungen pro Minute) und übergeben alle Gewebe durch ein 100 & mgr; m Zelle Sieb enthält.
  4. 20 ml neuer EDTA-Lösung auf das Gewebe für die zweite Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Führen Sie die IEL Fraktionen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb und sie gemeinsam mit den bisherigen Fraktionen. Halten Sie die verbleibenden Darm-Fragmente auf Eis werden in Schritt 3.9 behandelt.
  5. Zentrifugiere die gepoolten Fraktionen IEL bei 800 xg für 5 min bei 4 ° C. Waschen der vereinigten IEL Fraktionen mit 10 ml HBSS / 5% FBS und Spin sie bei 800 xg für 5 min nach unten und 4 ° C.
  6. Resuspendieren der Zellen in 8 ml 44% kolloidales Siliciumdioxid Medium 15 und überlagern sie mit 5 ml 67% kolloidales Siliciumdioxid Medium. Zentrifugieren Sie die 44% / 670,5% Zellgemisch Gradienten für 20 min bei Raumtemperatur und 1500 x g.
  7. Sammeln Sie die IEL-Zellen aus dem Band an der Schnittstelle. Entfernen Sie zuerst die oberste Schicht des Überstandes (ca. 5 ml) unter Verwendung von 1 ml Pipette. Dann Ernte IELs an der Phasen des kolloidalen Silica mit mittlerer Steigung.
  8. Waschen Sie die IELs von 10 ml RPMI-Medium hinzugefügt wird. Drehen Sie die Zellen nach unten für 5 Minuten bei 800 × g und 4 ° C. Resuspendieren der IELs in 5 ml RPMI für Schritt 3.15.
  9. Zur Isolierung der Lamina propria-Lymphozyten (LPLs), Hackfleisch Darm Gewebefragmente aus Schritt 3.4 in kleine Stücke Schere (1 mm) und zu verdauen, die Stücke mit 10 ml Aufschlusspuffer (0,05 g Kollagenase, 0,05 g DNaseI verwenden, und 0,3 g Dispase II in RPMI / 5% FBS) für 15-20 min bei 37 ° C.
  10. Filtern des Gemisches durch eine 70 & mgr; m Zellsieb. Die Durchflussüberstand enthält das frei LPL.
  11. verdauen Voll Darm-Fragmente durch Schritte 3,9-3,10 Wiederholung (in der Regel müssen sie sein3-mal wiederholt). Jedes Mal, bündeln die Überstände der LPLs enthält.
  12. Sammle die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 xg und Raumtemperatur und Resuspendieren der Pellets in RPMI / 5% FBS. Übergeben sie durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb.
  13. Resuspendieren der Zellpellets in 10 ml der 40% Anteil an einem 40:80 kolloidalen mittlerer Steigung Kieselsäure und überziehe sie auf 5 ml der 80% Fraktion in einem 15-ml-Tube.
  14. Führen des Dichtegradienten Trennung durch Zentrifugation für 20 min bei 1500 xg und Raumtemperatur 15.
  15. Sammeln Sie die LPLs, wie in Schritt 3.7 beschrieben. Wasche sie einmal mit 10 ml PBS und Resuspendieren der Pellets in 1 ml PBS / 1% FBS RPMI Medium oder Puffer.
  16. Zählen Sie die lebenden Zellen (beide IELs und LPLs) unter Verwendung von 0,4% Trypanblaufarbstoff / PBS-Lösung.

4. Expression von IL-22-tdTomato in Kolitis

  1. Bereiten einzelnen Milzzellsuspensionen von IL-22-tdTomato Mäusen bei einer Konzentration von 1 x 10 <sup> 7 Zellen / ml in sterilem PBS, wie 2,1-2,4 in Schritten beschrieben.
  2. Reinige die CD4 + T - Zellen der Maus CD4 - Zell Negative Isolation Methode unter Verwendung von 10. Etikettieren sie mit anti-CD4-APC (Klon RM4-5, 0,5 & mgr; l / 1 x 10 6 Zellen in PBS / 1% FBS - Puffer) und anti-CD45RB-FITC (Klon 16A, 0,5 & mgr; l / 1 x 10 6 Zellen in PBS FBS Puffer / 1%) durch Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
  3. Drehen Sie die Zellen nach unten für 5 Minuten bei 500 × g und 4 ° C. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS / 1% FBS-Puffer und Resuspension sie in 1 ml PBS / 1% FBS Färbepuffer.
  4. Führen Sie die markierten T - Zellen auf einer Durchflusszytometrie Maschine 16. Tor die Zellen auf einer T-Zell - Population und Art CD4 + CD45RB hoch doppelt positiven Zellen (die Wellenlänge bei 488 nm detektiert und 633 nm Laser).
  5. Ernte der sortierten Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 500 xg und 4 ° C. Resuspension der Zellpellets in sterile PBS - Puffer auf 1 x 10 & sup6 ; 6) in das Peritoneum ofeach Rag1 - / - Empfängermaus.
  6. Opfern , um die Empfängermäuse unter CO 2 zu verschiedenen Zeitpunkten. Ernten die mesenteriale Lymphknoten und die Dünn- und Dickdarm, wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben. Setzen Sie jeden Mesenteriallymphknoten und aufgeschnittenem Darm (Papier / Darm / Papier Sandwich) in 4% Paraformaldehyd (PFA; Griff unter einem Abzug) über Nacht das Gewebe zu reparieren. Ersetzen Sie die PFA mit 18% Saccharose für 16-24 h und dann das Gewebe einzufrieren für das Schneiden.
  7. Verwenden Sie den Kryostaten Maschine des Gewebes 17, 18, 19 zu schneiden. Warm die Gewebeabschnitte auf Raumtemperatur für ca. 60 min und sie in Aceton für 10 min bei Raumtemperatur. Trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für ca. 5 min.
  8. In FBS über, entfernen Sie sie mit einer Pipette, und fügen Sie anti-RFP bei einer 1: 200-Verdünnung in 0,1% BSA / 1x PBS. Inkubieren des Antikörpers bei 37 ° C für 60 min.
  9. Spülen Sie die Abschnitte in 1x PBS für 10 min und Anwendung der entsprechenden Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-568) auf das Gewebe, verdünnt 1: 300 in 1% BSA / 1x PBS, für 30 min bei Raumtemperatur.
  10. Spülen Sie Dias in 1x PBS für 10 min, wischen Sie sie trocken und Deck hinzuzufügen.
  11. Visualisieren Sie alle Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop unter gleichmäßige Ausleuchtung (RFP: Anregungsfilter 540-580 nm), um das 40X-Objektiv verwendet wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ein Maus - IL-22 Reporter - Transgen wurde unter Verwendung von Recombineering erstellt eine bakterielle künstliche Chromosom tragen die IL-22 - Locus zu ändern. Figur 1 zeigt ein Diagramm von pBACe3.6 Vektor , der das Gen sacBII, einen positiven Selektionsmarker enthält, und Chloramphenicol - Antibiotikum - Resistenzgen 11. Nach der Einführung tdTomato in Exon 1 wurde die Signalpeptidsequenz unterbrochen wird , wie in Abbildung 2 dargestellt. So wurde die tdTomato Reporter innerhalb der IL-22-exprimierenden Zellen eingeschlossen, deren Nachweis und zur Isolierung von Fluss ermöglicht Zytometrie. Die homozygote Mäuse wurden von Gründerlinien und abgeschirmt durch PCR gezüchtet, und sie nicht Rückkreuzens erfordern, um Nachkommen mit einer genetischen Identität zu erreichen, wie in der üblichen Knock-in-Strategie erforderlich ist. Um die Treue der IL-22 - Reporter zu testen, in vitro -generated Splenozyten wurden kultiviert unter Th22 oder neutralen Bedingungen. in vitro exprimiert wurde, nachgewiesen entweder durch Durchflusszytometrie oder durch Fluoreszenzmikroskopie. In vivo, wie in 4 gezeigt, wurde die IL-22 - Reporter in verschiedenen Mausgeweben unter homöostatischen Zustand detektiert. Die meisten der tdTomato Signal wurde in der Lamina propria (LP-Zellen) aus dem Darm, nicht aber in den axillären Lymphknoten (ALN), der Milz oder Thymus gefunden. Um die tdTomato Reporter in entzündetes Gewebe sichtbar zu machen , haben wir ein Modell der Maus Kolitis induziert durch die Übertragung von Reporter CD4 + CD45Rb hallo T - Zellen in Rag1 - / - Mäusen. Abbildung 5 zeigt , daß die Reporter zuerst die in den mesenterischen Lymphknoten und dann akkumuliert in der Lamina propria des distalen Dünndarm und Dickdarm Gewebe wurden. Zusammengenommen Dieses neuartige Verfahren zur Erzeugung von IL-22-Reportermäusen ist effektiv und zeitsparend.


Abbildung 1: Lageplan des pBACe3.6 Vektor. pBACe3.6 wird durch die Chloramphenicol Antibiotikaresistenz und ein sacBII Gen als positive-Selektionsmarker charakterisiert. Während der Rekombination werden die gewünschten Klone Sucrose-resistente durch ihre sacBII das Gen exprimieren und dürfen auf Saccharose enthaltenden Medien zu wachsen, während die negativen BAC Kolonien Sucrose-empfindlich sind.

Figur 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Klon RP23-401E11 BAC modifiziert. A tdTomato Reporter-Gen wurde in den IL-22-Locus eingeführt, die IL-22 und regulatorische Elemente in einem murinen Bacterial Artificial Chromosome (BAC RP23-401E11) umfasst, Recombineering Technologie. Durch homologe Rekombination, die Sequenz des Signalpeptids von IL-22 in der BAC wurde gestört und Exon 1 von Il-22 wurde durch das tdTomato Reporter - Gen ersetzt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Identifizierung von IL-22 Reporter in Splenozyten in vitro kultiviert. CD4 T-Zellen wurden aus der Milz gereinigt und dann mit anti-CD28 stimuliert; anti-CD3 (Neutralzustand); oder anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β und 6-Formylindolo (3,2-b) carbazol (FICZ) für 5 Tage. (100 & mgr; m Boden zwei, Skala bar) IL-22-tdTomato wurde mittels Durchflusszytometrie (oben zwei) und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Zahlen in den Quadranten zeigen den Prozentsatz der CD45 + Zellen.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Visualisierung von Zellen in verschiedenen Geweben der Maus IL-22-produzierenden. Einzelzellsuspensionen wurden aus der Milz, Thymus, Lymphknoten, Darm (IEL und LP) hergestellt und Peyer-Plaques. Sie wurden dann oberflächen gefärbt mit FITC-anti-CD3 und für tdTomato Expression untersucht. MLN: mesenterischen Lymphknoten, ALN: axillären Lymphknoten, PP: Peyer-Plaques, IEL: intraepitheliale Zellen aus dem Dünndarm isoliert, LP: Lamina propria Zellen aus dem Dünndarm gereinigt. Die Zahlen in den Quadranten zeigen den Prozentsatz der CD45 + Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 5: Lokalisierung von IL-22 - Reporter während der Entwicklung von T-Zell - Transfer ulcerosa. CD4CD45RBHigh T-Zellen aus IL-22-Reporter Mäuse wurden in Rag1 übertragen - / - Mäuse, und die tdTomato Signale wurden durch Immunhistochemie in den verschiedenen Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung einer Kolitis ausgewertet. Die Pfeile zeigen auf die IL-22-tdTomato Signale. Maßstabsbalken = 25 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IL-22 spielt eine wesentliche Rolle bei der angeborenen Immunabwehr und Gewebeumbau. IL-22-produzierenden Zellen wurden ex vivo durch intrazelluläre Anfärbung identifiziert. Allerdings bleibt es immer noch schwierig , IL-22 - Expression in situ zu verfolgen, entweder im normalen Zustand oder in entzündlichen Erkrankungen. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren ein IL-22 - Reporter Mausmodell, das uns die Reporter-exprimierenden Zellen in vivo zu lokalisieren ermöglicht zu entwickeln. Die Reporter-Gen-Codierung tdTomato wurde an einer Stelle in die IL-22-Locus eingefügt, die die Signalsequenz stört. Diese Strategie führt zu dem Reporter wird in der produzierenden Zelle eingeschlossen, im Gegensatz zu IL-22, die schnell ausgeschieden wird, so dass die Visualisierung der produzierenden Zelle. Hochentwickeltes IL-22-Reporter wurde mit dem Ziel, innerhalb eines großen BAC enthielten die Regulationselemente zu erhalten, wodurch fidelity der Expression des Reporter zur Übertragung der von IL-22 entspricht. Die Darmgewebe von transgenen mEis angezeigt homöostatischen Reporterexpression in CD4 T-Zellen und angeborenen Lymphozyten in der Lamina propria des Dünndarms. In induzierten Colitis, ausgedrückt CD4-T-Zellen, die die Reporter in den Dickdarm.

Die Rolle von IL-22 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen hat unklar. Durch die Teilnahme Regeneration in der Darmschleimhaut Verteidigung und Gewebe, IL-22 ist in der Lage , die Produktion der beiden Schutz 20 entlocken, 21, 22 und proinflammatorischen Mediatoren (zB IL-8) 23, 24. Zwei Modelle der T - Zell-driven ulcerosa zeigte Erhöhungen der IL-22 im Kolon, einschließlich TCR α - / - Mäuse 25, 26 und der CD45RB hallo Übertragungsmodell 27. Vergleichen entzündlicher Darmkrankheitsmodellen, IL-22-Expression in dem Darm war höher in einem Crohn-Krankheit modelthan in einem Modell der Colitis ulcerosa 21, 24 .Hier übertragen wir CD4CD45RBhi T - Zellen von den Reporter - Mäuse in Rag1 - / - Empfänger und imitieren die pathogenen Prozess von Morbus Crohn. Wir fanden, dass, vorhergehenden ulcerosa, IL-22 Reportern in intestinalen drainierenden Lymphknoten (MLN) sichtbar gemacht wurden. Die Signale werden dann in den MLN vermindert und zog in den Eingeweiden, insbesondere den distalen Dünndarm und Doppelpunkten, mit der Entwicklung von Colitis. Die meisten tdTomato Reporter wurden in der Lamina propria Schleimhaut des Darmes lokalisiert.

Eine andere Art von Reporter für IL-22 wurde bereits beschrieben, sind in dem Zellen dauerhaft so gekennzeichnet , dass sie und ihre Töchter weiterhin die Reporter zum Ausdruck bringen, ob oder ob nicht die Transkription von IL-22 28 fortgesetzt hat. Wie in unserer Studie gut angeborenen Lymphozyten wurden unter homöostatischen Bedingungen markiert, und in ulcerosa, ter Reporter wurde in T-Zellen von den mesenterischen Lymphknoten Darmgewebe lokalisiert.

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wäre für die Einrichtung anderer Transgen Reporter Mäusen, wie IL-17, IL-25 und so weiter anwendbar sein. Es ist jedoch entscheidend, geeignet BAC Klone tragenden distalen regulatorische Elemente wählen, um die Genauigkeit der Expression des Reportergens zu gewährleisten, da die Transgene zufällig in das Mausgenom integriert sind. Der Reporter Maus ermöglicht die Identifizierung von Zellen in vivo exprimiert, sowie für die Reinigung und Charakterisierung der lebenden Zellen. Wir haben tdTomato, ein außergewöhnlich helles rot fluoreszierendes Protein, als ein fluoreszierendes Reportergens der Reporter geeignet für lebendes Tier Imaging-Studien zu machen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
  2. Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
  3. Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
  4. Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
  5. Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
  6. Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
  7. Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
  8. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
  9. Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
  10. Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
  11. Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
  12. Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
  13. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
  14. Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
  15. Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
  16. Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
  18. Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
  19. Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
  20. Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
  21. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
  22. Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
  23. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  24. Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
  25. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
  26. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
  27. Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
  28. Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).

Tags

Immunologie Heft 119 IL-22 Reporter-Mäuse Ausdruck angeborenen Lymphozyten Durchflusszytometrie Immunhistochemie entzündliche Darmerkrankung.
Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, W., Li, W., Hixon, J. A.,More

Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter