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Biology

La perfusé Technique du rein de souris isolé

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Le rein de souris isolé perfusé (MIPK) est une technique pour la tenue d' un rein de souris ex vivo sous conditions perfusés et fonctionnelles pendant 1 h. Les tampons et les techniques chirurgicales sont décrits en détail.

Abstract

Le rein de souris isolé perfusé (MIPK) est une technique pour la tenue d' un rein de souris ex vivo sous conditions perfusés et fonctionnelles pendant 1 h. Ceci est une condition préalable à l'étude de la physiologie de l'organe isolé et pour de nombreuses applications innovantes qui peuvent être possible à l'avenir, y compris perfusion décellularisation pour les reins bioingénierie ou l'administration d'anti-rejet ou de la drogue du génome édition à des doses élevées pour amorcer le rein pour la transplantation. Pendant le temps de la perfusion, le rein peut être manipulée, la fonction rénale peut être évaluée, ainsi que divers produits pharmaceutiques administrés. Après la procédure, le rein peut être transplanté ou traitées pour la biologie moléculaire, l'analyse biochimique ou examen microscopique.

Ce document décrit le perfusat et la technique chirurgicale nécessaire pour l'ex vivo perfusion des reins de souris. Détails de l'appareil de perfusion sont données et les données sont présentées montrant la vdonnées flux sanguin rénal, la résistance vasculaire, et d'urine comme micrographies fonctionnels électroniques de transmission des différents segments de néphron comme des lectures morphologiques et western blots de protéines de transport des différents segments de néphron comme lecture moléculaire: ESPONSABILITE de la préparation du rein.

Introduction

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La perfusion isolée des organes a fait l'objet d'un effort continu entre les physiologistes depuis de nombreuses décennies 1. La technique permet à la fonction de l'organe, sans influences systémiques tels que la pression artérielle, les hormones, ou les nerfs, à étudier. Carl Eduard Loebell est considéré comme le premier à avoir décrit la perfusion réussie d'un rein isolé, en 1849 2. Depuis lors, le dispositif de perfusion a subi de raffinement significative. Frey et Gruber introduit un poumon artificiel pour l' oxygénation et pulsatiles pompes pour perfusion continue 2. Alors que les premiers chercheurs principalement étudié les reins de grands mammifères , à savoir, les porcs et les chiens 2 3 -le premier rapport de l'utilisation de reins de rats, par Weiss et al. , Était une étape importante dans l'étude de la perfusion de petit mammifère organe 4. Schurek et al. signalé la nécessité d'ajouter des érythrocytes de mammifère au perfusat si tubulaire rénale suffisanteoxygénation devait être atteint 5. Critical pour les expériences à long terme a été l'introduction de la dialyse continue de la mémoire tampon par le même groupe de recherche 6. En 2003, Schweda et al. ont été les premiers à signaler un rein de souris fonctionnelle isolé perfusé (MIPK) 7, puis affiné par Rahgozar et al. 18 et Lindell et al. 14.

Bien que techniquement plus difficile que le rat isolé rein perfusé, l'utilisation du MIPK porte l'avantage de permettre l'utilisation d'une large gamme de souris génétiquement modifiées. Cet article présente les détails de la méthode des auteurs pour perfuser les reins de souris isolées pendant 1 h. La méthode permet l'évaluation continue des taux d'écoulement rénale, la résistance vasculaire, la libération d'hormones, l'analyse des gaz du sang, analyse d'urine, et l'application de la drogue. Après la procédure, les reins peuvent être traitées pour l'analyse moléculaire et biochimique, fixés pour la microscopie, outransplantées dans une souris réceptrice (figure 1).

Figure 1
Figure 1: Vue d'ensemble de possibles entrées / sorties du rein isolé perfusé. BGA: analyse des gaz du sang. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cette technique sera probablement recevoir une attention croissante au cours des prochaines années, car de nombreuses applications innovantes sont en cours de discussion à l'aube de longue normothermique perfusion rénale avant la transplantation (avec ou sans l'application d'anti-rejet ou de la drogue du génome édition) 8, 9, 10 , 11, la bioingénierie des reins entiers de échafauds décellularisés 12, et l'application de doses élevées de colorants fluorescents pour multiphotonique imagerie 13 14.

Un protocole étape par étape est donnée pour permettre à d'autres laboratoires pour effectuer isolé souris perfusion rénale avec succès. Tout d'abord, la composition et la préparation de la mémoire tampon est spécifiée. Ensuite, l'opération est décrite en détail, et les étapes essentielles sont représentées. En troisième lieu, les données sont présentées qui sont représentatives d'une préparation réussie: le flux sanguin rénal, la résistance vasculaire, le taux de filtration glomérulaire, et l'électrolyte fractionnée d'excrétion toutes les mesures que fonctionnelles des micrographies de viabilité et électronique à transmission de la morphologie des différents segments de néphron des reins perfusés fixée après 1 h de perfusion.

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Protocol

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Toutes les procédures impliquant des animaux décrits dans ce manuscrit ont été menées conformément au droit suisse et approuvés par l'administration vétérinaire du canton de Zurich, en Suisse.

1. Préparation du tampon

  1. Préparer des solutions 1 - 4 et la solution d' hormone antidiurétique (ADH) (tableau 1).
  2. Préparer le tampon de dialyse (tableau 1).
    NOTE: Ceci est le tampon utilisé comme tampon de dialyse au cours de la perfusion. Plus tard, les érythrocytes sont dilués dans ce tampon pour former la solution de perfusion finale.
  3. préparation des érythrocytes.
    1. Diluer 250 ml de concentré érythrocytaire humaine (matériau testé obtenu à partir de la banque de sang locale) à 500 ml avec le tampon de dialyse. Centrifuger à 2000 xg pendant 8 min. Retirez le tampon, en faisant attention de ne pas supprimer tous les érythrocytes. Répétez 3x.
  4. Préparer la (albumine de sérum bovin, BSA) à l'albumine tampon.
    1. Dans 200 ml de dialysis tampon, dissoudre 44 g de BSA en utilisant une barre d'agitation. On filtre la solution avec du papier filtre.
  5. Préparer le perfusat.
    1. Filtrer les globules rouges de l'étape 1.3.1 à travers un papier filtre dans la mémoire tampon de BSA. Remplir jusqu'à un volume total de 800 ml avec le tampon de dialyse.
      NOTE: Ceci est le perfusat final. L'hématocrite devrait maintenant se situer entre 8 et 12%. Le perfusat peut être stocké pendant jusqu'à 12 heures à 4 ° C.

2. Initier Dialyse et Oxygénation

  1. Mettre en marche le bain d'eau entourant le grand réservoir tampon, le réservoir tampon inférieur et la chambre humide (une petite chambre à double paroi portée à 37 ° C et 100% d' humidité pour maintenir ensuite le rein) à 37 ° C (figure 2) .
  2. Remplir le réservoir-tampon plus grand avec le tampon de dialyse et le plus petit réservoir avec le liquide de perfusion.
  3. Allumer la 5% de CO 2 / O 2 à 95% entrée de gaz dans le tampon de dialyse.
  4. Allumez la dialyse continue du perfusat contre le tampon de dialyse. Prenez soin d'utiliser des tubes de dialyse à faible flux. Passez à l'étape 3.

Figure 2
Figure 2: Dessin schématique du circuit Perfusion. Le schéma représente les composants principaux du circuit de perfusion et la direction d'écoulement du tampon. Tous les composants entourés de bleu foncé sont maintenus à 37 ° C avec un bain d'eau / thermostat. 1: Dialyse tampon d'au moins 3 fois le volume du tampon de perfusion est continuellement barboter avec 95% O 2/5% CO 2. 2: Dialyse tampon et un tampon de perfusion continue sont dialysées contre l'autre dans un tube de dialyse par une pompe à rouleaux. 3: constante througho En raison de cette dialyse, le tampon de perfusion est enrichi avec 9% O 2/5% de CO 2 et d' électrolytes niveaux sont maintenusperfusion ut. 4: une pompe à rouleaux propulse le tampon de perfusion vers le rein. 5: Windkessel supprime les ondes péristaltiques et agit comme un piège à bulles. 6: Capteur de pression (relié à 4. (pompe à rouleaux) pour maintenir une pression constante tout en permettant un écoulement libre en alternance). 7: Tout au long de la perfusion, le rein reste dans une chambre humide à 100% d' humidité de l' air et 37 ° C Température du rein. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Surgical Procédure Partie 1 (pour un diagramme de tous les ligatures, voir la figure 3)

Remarque: Effectuer toutes les ligatures en utilisant 5-0 fil chirurgical.

  1. Anesthésier une souris par injection intrapéritonéale (10 ul / g de poids corporel, 20 mg / ml de kétamine et 1 mg / ml de xylazine dissous dans du NaCl à 0,9%). Confirmer la profondeur suffisante de anesthEIES en testant absence de réflexes arrière-pied.
  2. Fixer la souris dans une position couchée dans la chambre humide. Protéger les yeux avec vétérinaire pommade. Placer une seringue de 1 ml en dessous de la colonne vertébrale afin d'élever les vaisseaux lombaires.
  3. Effectuer une laparotomie médiane de la crête du pubis à l'ouverture du sternum d'abord la peau, puis les muscles abdominaux, avec des ciseaux.
  4. Enlever l'intestin et le placer sur le côté gauche de la partie latérale de la souris de l'abdomen.
  5. Libérez la vessie du tissu conjonctif et explorer les deux uretères et l'urètre.
  6. Placer une ligature autour de l'uretère gauche (ligatures I). Ferme le.
  7. Placez une ligature autour de l'urètre (ligature II). Ferme le.
  8. Placer un "lasso" ligature autour de l'ensemble de la vessie (ligatures III).
  9. Inciser la vessie de 1 mm.
  10. Cathétériser l'ouverture avec 2 cm PE 50 tubes.
  11. Fermer III Ligature autour du tube.
  12. Couper l'uretère gauche et de l'urètre distal des ligatures. Le bladder est maintenant attaché à l'uretère droit seulement et se déplacer librement.
  13. Décochez l'aorte abdominale du tissu connectif et la graisse.
  14. Placer une ligature milieu de l'aorte abdominale (IV Ligature).
  15. Placer une ligature autour de l'aorte au-dessous du diaphragme entre l'artère mésentérique supérieure et le tronc coeliaque (V Ligature).
  16. Placer une ligature autour de l'artère mésentérique supérieure (VI Ligature).
  17. Placer une ligature aortique directement en dessous de la droite et au-dessus de l'artère rénale gauche (VII ligatures).
  18. Placez une ligature autour du paquet caudale de veine (cava) (VIII ligatures). Passez à l'étape 4.

Figure 3
Figure 3: Dessin schématique des ligatures placées pendant la chirurgie. Vue de l'abdomen ouvert après la laparotomie. L'intestin est déplacé vers la gauche. L et R indiquent le rein gauche et à droite. ledes lignes noires indiquent la zone de la ligature respective. Les ligatures sont d'abord placés, puis fermés, dans l'ordre indiqué dans le texte. X marque l'emplacement de l'incision de l' aorte pour la canulation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Amorçage du circuit Perfusion

  1. Démarrer la pompe rotative et remplir le tube avec perfusat. Prenez soin de vider toutes les bulles d'air de celui-ci.
  2. Remplissez le dispositif de Windkessel à environ mi-niveau avec perfusat.
  3. Calibrer le capteur de pression à 0 mm Hg lorsque tous les tubes est rempli et le débit est 0. Gardez l'aiguille de perfusion au niveau du rein pendant ce temps.
  4. Gardez l'écoulement à un niveau minimal constant (0,6 ml / min) et passez à l'étape 5.

5. Surgical Procédure Partie 2

  1. Placez une pince entre ligatures IV et la ramification du rena gauchel 'artère.
  2. Faire une petite incision dans la caudale aorte de ligatures IV, en prenant soin de ne pas couper la paroi dorsale.
  3. Dilater l'ouverture dans l'aorte avec un dilatateur de vaisseau.
  4. Cathétériser l'aorte avec une aiguille (2 cm de long, tiré PE 50), poussant la pointe juste à la pince.
  5. Ouvrez la pince.
  6. Poussez la pointe de la céphalique de l'aiguille jusqu'à ce qu'il atteigne la jonction de l'artère rénale droite et l'aorte.
  7. Fermer ligatures VII.
  8. Fermer ligatures IV.
  9. Ouvrez le coffre avec des ciseaux en disséquant le diaphragme. Avec une seule coupe, séparer l'aorte, la veine cave, le cœur et les nerfs végétatifs. Avec cette étape, l'animal est sacrifié par exsanguination rapide sous anesthésie profonde continue.
  10. Commencer le contrôle de la pression de la pompe de perfusion. Maintenir la pression moyenne entre 80 et 100 mmHg.
  11. Fermer V. ligatures
  12. Fermer ligatures VI.
  13. Fermer ligatures VIII.
  14. Gratuit le rein droit du tissu conjonctife et son incorporation dans la capsule adipeuse avec des ciseaux.
  15. Couper l'aorte proximale pour ligaturer V.
  16. Couper l'artère mésentérique supérieure distalement à ligaturer VI.
  17. Couper le navire faisceau de rein de soutien, en prenant soin de ne pas couper dans les navires eux-mêmes.
  18. Couper le foie à la connexion au rein. Prendre soin de libérer le rein, tout en laissant une petite partie de l'adhésif du foie, de sorte que la veine cave est maintenue ouverte par celui-ci.
  19. Prendre le faisceau de rein de la souris. Retirez la souris à partir de la chambre humide.
  20. Placer un "lasso" ligature autour de la connexion du foie et les reins (IX ligatures).
  21. Cathétériser la veine cave avec une ligne veineuse (2 cm de PE 50).
  22. Fermer ligatures IX. écoulement veineux à travers la ligne veineuse devrait immédiatement commencer.
  23. Fermez la chambre humide.

6. Les analyses en aval

  1. Pendant l'heure qui suit, surveiller en permanence le flux sanguin et intravasculpression ar 15. Recueillir l' écoulement veineux, qui peut être utilisé pour l' analyse, par exemple, la libération de rénine rénale 7. Recueillir l' urine pour l' analyse de la concentration d'électrolyte et le taux de filtration glomérulaire 14. Après 1 heure de perfusion, les reins peuvent être snap-congelés pour western blot ou être fixés pour l' imagerie des approches 16.

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Representative Results

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Avec le procédé décrit, les reins de souris isolées peuvent rester viables pendant au moins 1 h. Nous avons testé la viabilité du tissu après 1 h de perfusion continue avec fonctionnelle (flux sanguin rénal et la résistance vasculaire, l' analyse des gaz du sang d'écoulement veineux, le taux de filtration glomérulaire, excrétion fractionnelle Na + et K +, et l'osmolalité urinaire) et morphologique électronique (transmission microscopie, TEM) méthodes dans quatre reins de type sauvage C57BL / 6 souris. En outre, western blots de protéines marqueurs apical des différents segments de tubules ont été réalisées, en comparant les reins perfusés isolés aux reins unperfused des mêmes animaux. Dans toutes les expériences, la perfusion à pression constante a été utilisée, en maintenant la pression de perfusion à ~ 100 mm Hg (figure 4). Dans ces reins, le débit de perfusion et la résistance vasculaire sont restés stables sur un temps de 55 min à 15,6 ± 0,4 ml / min * g de poids des reins et 35 ± 1,0 mm de Hg * min / ml, respectivement (figure 4 A). Une diminution du débit de perfusion ou d'une augmentation de la résistance vasculaire est un paramètre sensible en ce qui concerne la diminution de la viabilité des tissus et doivent être surveillés tout au long de la perfusion avec soin. Gaz du sang et l' analyse d'électrolytes dans des échantillons de 100 ul pris 60 minutes après le début de la perfusion rénale ont révélé la production de CO 2 et O 2 consommation, lorsque l'entrée artérielle a été comparée à l'écoulement veineux (tableau 2). Les autres paramètres sont restés inchangés entre l' artère et la veine (tableau 2). Un accent particulier devrait être mis sur inaltérée libération de potassium veineuse, une augmentation peut se produire lors d'un dommage tissulaire. Le taux de filtration glomérulaire, évalué par la clairance FITC-inuline 14, a eu tendance à augmenter au fil du temps (figure 4 B) , mais cette tendance ne soit pas significative. l'excrétion fractionnée du sodium et de potassium évaluée après 55 minutes de perfusionest augmentée par rapport à la situation in vivo (figure 4 C). L'osmolalité urinaire ne sont pas élevée au- dessus de l'osmolalité de l'écoulement veineux après 55 min de perfusion (figure 4 D).

Pour les études morphologiques, les reins ont été fixés après perfusion de paraformaldehyde à 3% et 0,1% de glutaraldéhyde dans un tampon de dialyse comme décrit précédemment 17. ultrastructure rénale a été évaluée avec le TEM. Glomérules et S1 segments de tubules proximaux sont apparus en grande partie inchangée après perfusion (figures 5 A et B). Certains, mais pas tous les segments S2 / S3 de tubules proximaux et les membres ascendants épais qui ne sont pas près de faisceaux vasculaires ont montré des signes de lésions organiques, comme décrit précédemment dans le rat isolé reins perfusés 5 (figures 5 C et D). Même lors de l'inspection minutieuse, tubules contournés distaux et les canaux collecteurs ne montrent pas des signes évidents de nécrose (Figures 5 E, F et G). En conclusion, les résultats morphologiques dans les reins de souris reflètent la situation constatée chez le rat isolé rein perfusé 5.

Western blots de protéines marqueurs apical des différents segments du néphron dans les reins perfusés isolés (snap-congelés après 1 h de perfusion) par rapport aux reins controlatéraux unperfused du même animal (snap-congelés avant le début de la perfusion) n'a pas révélé d'importantes modifications. Nous avons étudié NaPi-IIa (situé dans les tubules proximaux), NKCC2 (Les membres ascendants épais), NCC (tubules contournés distaux), et ENaC (connexion tubules / canaux collecteurs) (figures 6 A et B).

Figure 4
Figure 4: Évaluation de la viabilité fonctionnelle des reins perfusés pendant 55 min. A) </ Strong> Pendant la perfusion de pression constante, la résistance vasculaire et le débit de perfusion est resté stable pendant 55 min. Les 15 premières minutes sont exclues en raison de la grande variabilité toujours vu pendant ce temps. B) le taux de filtration glomérulaire (FITC-inuline) de quatre reins évalués après 25 et 55 min affiché une légère mais non significative augmentation au fil du temps. C) L' excrétion fractionnée du sodium et du potassium évaluée au bout de 55 min de perfusion. D) plasma variqueux et osmolalité urinaire après 55 min de perfusion. n = 4 dans toutes les expériences. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: microscopie électronique à transmission. Représentant Morphologie du D Segments DIFFÉRENTES Néphron de perfusé Reins à un point de fin de 1 h. A) Les glomérules sont intacts. Détail d'un podocytes dans un glomérule. Segment B) S1 d'un tubule proximal. segments S1 sont intacts. Le segment C) S2 / S3 d'un tubule proximal. Certains, mais tous les segments S2 / S3 de tubules proximaux ne sont pas très nécrotique. Les cellules apparaissent gonflées et montrent de gros dégâts intracellulaires. L'ébauche tubulaire est maintenue uniquement par la membrane basale. D) croissant épais membre (TAL). Ces TAL qui sont loin des faisceaux vasculaires montrent les premiers signes de dégénérescence hydropique. membranes Luminal apparaissent amincis et fragile. E) Distal tubule contourné (DCT). DCT sont intacts. F) Détail des invaginations basolatéral d'une cellule DCT. Fenestrated endothélium, membrane basale, invaginations basolatéral, et les mitochondries sont intacts. G) La collecte conduit (CD). CD sont intacts.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Western Blot des marqueurs apicales protéines dans Reins isolé perfusé Par rapport à Unperfused Reins des mêmes animaux. A) Western blots des reins perfusés pendant 1 heure et les reins unperfused. NaPi-IIa est représentatif du tubule proximal. NKCC2 est représentative de la branche ascendante épaisse. NCC et NCC phosphorylés au thréonine 53 (pT53 NCC) se trouvent exclusivement dans le tubule contourné distal. Alpha et gamma de sous-unités ENaC dans toute leur longueur et leurs produits protéolytiquement clivés respectifs sont présentés représentant pour le tubule / canal collecteur de connexion. B) Quantification de A) n'a pas révélé de différences significatives entre les reins perfusés fou 1 h et les reins unperfused. n = 3 dans toutes les expériences. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et les valeurs individuelles sont montrées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Composition des solutions et dialyse Buffer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Tableau 2
Tableau 2: gaz de sang hydroélectrolytique Analyse des Arterial entrées et sorties veineuses de perfusé Souris Reins 60 min après le début de Perfusion (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ±SEM.

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Discussion

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La souris isolé rein perfusé est un outil pour l' étude de la fonction rénale dans un environnement contrôlé ex vivo pendant 1 heure, combler le fossé entre les expériences in vivo chez les animaux intacts, ce qui peut être faussée par l'impact de nombreux facteurs systémiques, et des expériences in vitro en segments de néphron isolés ou des cellules en culture, qui négligent nécessairement l'impact de la structure des organes intacts sur la fonction. Il est, à la connaissance des auteurs, aucune autre technique avec laquelle pour effectuer cette tâche spécifique. Des études biochimiques sur le tissu rénal, cependant, peuvent être réalisées de façon beaucoup plus simple en utilisant des tranches de rein 17. Bien que la technique présentée est actuellement utilisé principalement pour étudier la physiologie rénale, de nombreuses nouvelles applications sont en cours de discussion. Par exemple, il pourrait être utilisé pour les reins bioingénierie pendant la perfusion décellularisation et recellularization 12. En outre, la perfusion normothermique prolongée des reins avant transplantation, avec l'administration de doses élevées d'anti-rejet ou la modification du génome de la drogue dans la solution de perfusion est en cours d'étude; même dans des contextes cliniques 8, 9, 10, 11. La souris isolé rein perfusé est un excellent outil qui pourrait être utilisé pour ces applications, en particulier pour élucider le rôle des gènes individuels avec des modèles knock-out.

Trois étapes sont essentielles pour une expérience réussie. Ce document fournit des laboratoires intéressés les moyens de reproduire la procédure. Tout d'abord, le tampon doit être préparé d'une manière telle que le rein reçoit la majeure partie des éléments nutritifs nécessaires à la viabilité prolongée dans des conditions reproductibles. Un équilibre doit être trouvé entre les conditions entièrement contrôlées (tampon synthétique) et une condition de perfusion natif (sang total). Par conséquent, l'albumine et les érythrocytes de mammifères à un hématocrite de 10% doivent être inclus. Cette hématocrite représente, dans l'expérience des auteurs, le meilleur compromis entre suffisante tproblème d' oxygénation et une faible viscosité tampon (augmentation de l' hématocrite diminue le débit de façon spectaculaire au cours de la perfusion de pression constante (comparer les valeurs présentées dans ce document à des valeurs dans les reins perfusés sans érythrocytes 18)). La qualité et la fraîcheur des globules rouges est critique. Pendant les étapes de lavage, les érythrocytes doivent être manipulés avec soin pour éviter l'hémolyse. Le tampon doit être préparée fraîchement le jour de l'expérience. Deuxièmement, l'opération doit être effectuée par un chirurgien formé dans les plus brefs délais. Le chirurgien doit effectuer 6 ligatures autour des vaisseaux principaux reliant le rein pour le reste du corps, tout en maintenant la perte de sang de l'animal à un minimum. Pour des résultats optimaux, les interventions chirurgicales doivent être accomplies dans les 30 minutes. Si la moyenne de la pression artérielle de l'animal chute, pendant la chirurgie ou prolongée en raison de l'anesthésie, inférieure à 60 mmHg, la perfusion rénale sera déjà minimale et le tissu sera sujettela nécrose. Pour exclure cette, le rein gauche peut être pris après la chirurgie, lorsque la perfusion du rein droit a déjà commencé, et utilisé comme un témoin non traité. En troisième lieu, pendant la durée de la perfusion du bon fonctionnement de l'appareil de perfusion, constituée d'un circuit de petits animaux de perfusion standard, doit être assurée. Lorsque l'ordinateur exécute la perfusion par lui-même, une surveillance humaine est nécessaire, par exemple pour vérifier la présence de bulles dans le circuit de perfusion.

Les données représentatives fournies permet l'évaluation de la viabilité rénale après 1 h de perfusion ex vivo et la comparaison de la réussite technique de toute exécution de cette méthode à l'approche décrite ici. Pendant au moins 1 h, le débit sanguin rénal, la résistance vasculaire, les gaz sanguins du débit veineux et le débit de filtration glomérulaire doivent rester stables.

Il y a certaines limitations à la technique, que l'on doit garder à l'esprit. Même kidney issu de la chirurgie la plus réussie ne peut rester viable pendant un temps limité. Les auteurs ont constaté 1 heure pour être le meilleur point de moment où arrêter la perfusion. En outre, alors que la perfusion du rein isolé permet l'étude de l'ensemble organe isolé en profondeur, il est difficile de différencier les effets spécifiques sur un type de cellule. Reins fixes après 1 h pourraient présenter des défauts dans les segments S3 de tubules proximaux et les cellules croissant des membres épais, tandis que glomérules, segments S1, DCT, et les CD doivent rester intacts. L'utilisation obligatoire des érythrocytes, en particulier des humains, est également liée à des risques potentiels (par exemple, les infections) pour l'expérimentateur.

En résumé, la souris isolé rein perfusé est une technique utile avec pour étudier l'organe entier ex vivo. Comme toute technique, il présente certains avantages et les limites. Les auteurs estiment que les deux nouvelles applications multiples actuellement résultant et ce protocole pourrait fournir suffisant élan pour d'autres laboratoires de reproduire cet effort.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
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La perfusé Technique du rein de souris isolé
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Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

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