Summary
כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. החוצצים טכניקה כירורגית מתוארים בפירוט.
Abstract
כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. זהו תנאי הכרחי ללימוד הפיזיולוגיה של האיבר מבודד עבור יישומים חדשניים רבים שעשויים להיות אפשרי בעתיד, כולל decellularization זלוף עבור Bioengineering כליות או הממשל של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום במינונים גבוהים פריים הכליה להשתלה. במהלך הזמן של זלוף, הכליה ניתן להשפיע, תפקוד כלייתי ניתן להעריך, ומגוון תרופות מנוהלות. לאחר שהסתיים ההליך, הכליה ניתן להשתיל או מעובדי ביולוגיה מולקולרית, לאנליזה ביוכימית, או במיקרוסקופ.
מאמר זה מתאר את perfusate ואת הטכניקה הניתוחית דרושה זלוף vivo לשעבר של כליות עכבר. פרטים של מנגנון זלוף ניתנים ונתונים מוצגים מראים את נiability של הכנת הכליות: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, ונתונים שתנו כמו micrographs אלקטרונים פונקציונלי, שידור של מגזרים נפרון שונים כמו readouts מורפולוגיים, וכתמים מערביים של חלבוני תחבורה של מגזרים נפרון שונים כמו readout המולקולרית.
Introduction
זלוף מבודד איברים כבר את הנושא של מאמץ מתמשך בין פיזיולוגים במשך עשורים רבים 1. הטכניקה מאפשרת את הפונקציה של האיברים, ללא השפעות מערכתיות כגון לחץ דם, הורמונים, או עצבים, כדי להיחקר. קרל אדוארד Loebell נחשב הראשון תאר את זלוף המוצלח של כליות מבודדות, בשנת 1849 2. מאז, מנגנון זלוף עבר עידון משמעותי. פריי גרובר הציגו ריאות מלאכותיות למשאבות חמצון pulsatile זלוף 2 הרציף. בעוד החוקרים מוקדם בעיקר למד הכליות יונקים-כלומר גדול, חזירים 2 וכלבים 3 -The הדו"ח הראשון של השימוש הכליות עכברוש, על ידי וייס ואח '. , היה ציון דרך בחקר זלוף 4 קטן-יונק-איבר. Schurek et al. דיווח על כך שיש צורך להוסיף אריתרוציטים יונקים אל perfusate אם צינורי כליות מספיקחמצון היה להיות מושגת 5. קריטי עבור ניסויים לטווח ארוך היה המבוא של דיאליזה הרציפה של למאגר על ידי אותה קבוצת המחקר 6. בשנת 2003, Schweda et al. היו הראשונים לדווח כליה perfused תפקודית מבודד העכבר (MIPK) 7, מעודן מאוחר יותר על ידי Rahgozar et al. 18 ו ואח 'לינדל. 14.
למרות שמבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר החולדה המבודדת כליות perfused, שימוש MIPK נושא את היתרון של המאפשרים השימוש במגוון רחב של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מציג את הפרטים של השיטה 'המחברים עבור מרוססת כליות עכבר מבודדות במשך שעה 1. השיטה מאפשרת הערכה הרציפה של קצב זרימת כליות, התנגדות כלי דם, שחרור הורמון, ניתוח גז דם, בדיקת שתן, ואת היישום של סמים. בעקבות ההליך, כליות יכולות להיות מעובד לניתוח מולקולרי ביוכימיים, להיות קבוע עבור מיקרוסקופיה, אוהושתל עכבר נמען (איור 1).
איור 1: סקירה כללית של אפשריות קלט / פלט לכליה perfused מבודד. BGA: ניתוח גז דם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טכניקה זו עשויה תקבל תשומת לב גוברת בשנים קרובות, כמו יישומים חדשניים רבים בדיונים מול השחר של זלוף כליות normothermic הממושך לפני ההשתלה (עם או בלי היישום של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום) 8, 9, 10 , 11, Bioengineering של הכליות כולו מן הפיגומים decellularized 12, ואת היישום של מינונים גבוהים של צבעי ניאון הדמיה multiphoton 13 14.
פרוטוקול צעד אחר צעד ניתן לאפשר מעבדות אחרות לבצע זלוף כלית עכבר המבודד בהצלחה. ראשית, ההרכב והכין למאגר מצוין. לאחר מכן, הניתוח מתואר בפירוט את השלבים הקריטיים מוצגים. נתונים שלישיים, מוצג מייצגות הכנה מוצלחת: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, GFR, והפרשה-כל אלקטרוליט שבר המדידות התפקודיות ליום micrographs אלקטרוני הילוכים-הכדאיות של המורפולוגיה של מגזרים נפרון שונים של כליות perfused שוות אחר שעה 1 של זלוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים המתוארים בכתב היד הזה נערכו על פי חוק השויצרי ואושרו על ידי ממשל הווטרינרים של קנטון ציריך, שוויץ.
1. הצפת הכנה
- הכינו פתרונות 1 - 4 ואת הורמון נוגד השתנה (ADH) פתרון (טבלה 1).
- הכן את החיץ דיאליזה (טבלה 1).
הערה: זהו המאגר משמש חיץ הדיאליזה במהלך זלוף. מאוחר יותר, אריתרוציטים ידוללו במאגר זה כדי ליצור את perfusate הסופי. - הכנה כדורי.
- לדלל 250 מיליליטר של תרכיז כדורי אדם (חומר נבדק המתקבל מבנק הדם המקומי) ל -500 מיליליטר עם חיץ דיאליזה. צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 8 דקות. הסר את החוצץ, נזהר שלא להסיר כל אריתרוציטים. חזור 3x.
- הכן את (אלבומין בסרום שור; BSA) אלבומין חיץ.
- בשנת 200 מ"ל של dialysiחיץ s, לפזר 44 גרם של BSA באמצעות בר ומערבב. סנן את הפתרון עם נייר סינון.
- הכן את perfusate.
- סנן את אריתרוציטים משלבים 1.3.1 דרך נייר סינון לתוך מאגר BSA. מלאו עד נפח כולל של 800 מ"ל עם חיץ דיאליזה.
הערה: זהו perfusate הסופי. ההמטוקריט צריך להיות עכשיו בין 8 ל 12%. את perfusate ניתן לאחסן עד 12 שעות ב 4 ° C.
- סנן את אריתרוציטים משלבים 1.3.1 דרך נייר סינון לתוך מאגר BSA. מלאו עד נפח כולל של 800 מ"ל עם חיץ דיאליזה.
2. דיאליזה ייזום חמצון
- הפעל באמבט המים המקיף את המאגר למאגר הגדול, מאגר מאגר קטן, ובית נבחרים הלחים (תא קטן, דופן כפולה הביא 37 ° C ו 100% לחות מאוחר יותר להחזיק הכליה) עד 37 ° C (איור 2) .
- מלאו את מיכל חיץ גדול עם למאגר דיאליזה המאגר קטן עם perfusate.
- הפעל את זרימת הגז 5% CO 2/95% O 2 למאגר דיאליזה.
- הפעל דיאליזה רציפה של perfusate נגד מאגר הדיאליזה. תשמור על עצמך כדי להשתמש צינורות דיאליזה נמוכים שטף. המשך לשלב 3.
איור 2: ציור סכמטי של מעגל זלוף. ערכת מוצגי הרכיבים העיקריים של מעגל זלוף ואת כיוון זרימת חיץ. כל הרכיבים מוקפים הכחול כהה נשמרים על 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים / תרמוסטט. 1: דיאליזת חיץ של לפחות 3 פעמים את הנפח של למאגר זלוף הוא מבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. 2: דיאליזת חיץ חיץ זלוף הם dialyzed ברציפות אחד נגד שני בתוך שפופרת דיאליזה באמצעות משאבת הרים. 3: בשל דיאליזה זה, למאגר זלוף מועשר 9% O 2/5% CO 2 ורמות אלקטרוליטים נשמרות througho מתמידזלוף ut. 4: משאבת הרים מניעה למאגר זלוף לכיוון הכליה. 5: windkessel מסיר גלי peristaltic ופועל כמלכודת בועה. 6: רגשי לחץ (מחובר 4. (משאבת הרים) כדי לשמור על לחץ מתמשך ובמקביל לאפשר זרימה לסירוגין בחופשיות). 7: במהלך זלוף, הכליה נשארה בתא לח עבור לחות באוויר 100% וטמפרטורת כליות 37 ° C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. הליך כירורגי חלק 1 (עבור תרשים של כל ליגטורות, ראה איור 3)
הערה: בצע את כל ליגטורה באמצעות 5-0 חוט כירורגי.
- להרדים עכבר בזריקה intraperitoneal (10 μl / גרם של משקל הגוף, 20 מ"ג / מ"ל קטמין ו xylazine 1 מ"ג / מ"ל מומס 0.9% NaCl). אשר עומק מספיק של anesthEsia ידי בדיקת עדר רפלקסים אחורי רגל.
- תקן את העכבר במצב שכיבה בתא לח. להגן על העיניים עם משחת וטרינר. מניחים מזרק 1 מ"ל מתחת השדרה לרומם את כלי המותני.
- בצע laparotomy החציוני מפסגת הערווה לפתיחת החזה הראשון העור, אז שרירי הבטן, עם מספריים.
- הסר את המעי ומניח אותו בצד השמאלי של העכבר לרוחב מהבטן.
- לשחרר את השלפוחית מרקמות חיבור ולחקור הן השופכנים ואת השופכה.
- מניחים ליגטורה סביב השופכן השמאלי (אני ליגטורה). סגור את זה.
- מניחים ליגטורה סביב השופכה (ליגטורה השנייה). סגור את זה.
- מניחים ליגטורה "לאסו" סביב השלפוחית כולה (ליגטורה III).
- לחתוך את שלפוחית השתן 1 מ"מ.
- Cannulate הפתיחה עם צינורות 2 סנטימטר PE 50.
- III סביב צינור ליגטורה סגור.
- חותכים את השופכן שמאלה דיסטלי השופכה מן ליגטורה. דפדףדר כעת מצורף השופכן התקין רק ובחופשיות נעה.
- נקה את אבי העורקים בבטן של רקמות שומן החיבור.
- הוסף ליגטורה אמצע אבי העורקים בבטן (IV ליגטורה).
- מניחים ליגטורה סביב האאורטה מתחת לסרעפת בין העורק mesenteric מעולה המטען צליאק (V ליגטורה).
- מניחים ליגטורה סביב עורק mesenteric מעולה (VI ליגטורה).
- הוסף ליגטורה אבי העורקים ישירות מתחת ימינה ומעל עורק הכליה השמאלית (VII ליגטורה).
- מניחים ליגטורה סביב חבילת וריד הזנב (קאווה) (VIII ליגטורה). המשך לשלב 4.
איור 3: ציור סכמטי של ליגטורות להציב במהלך הניתוח. מראה כללי של הבטן הפתוחה לאחר פיום הבטן. המעי מועבר אל מחוץ שמאלה. L ו- R מצביעים הכליה הימנית והשמאלית. הקווים שחורים להציג את האזור של ליגטורה בהתאמה. ליגטורות ממוקמות ראשונה ולאחר מכן סגור, ברצף הנתון בטקסט. X מסמן את מיקום החתך עבור cannulation אבי העורקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. לקרקע של סבב זלוף
- הפעל את המשאבה הסיבובית למלא את הצינורות עם perfusate. תשמור על עצמך כדי לרוקן את כל בועות האוויר ממנו.
- מלאו את המכשיר windkessel לכ מהדרג הבינוני עם perfusate.
- כייל את מתמר לחץ 0 מ"מ כספית כאשר כל הצינורות מתמלאים ותזרים הוא 0. שמור את מחט זלוף ברמת הכליות במהלך הזמן הזה.
- שמור זרימת ברמה מינימלית קבועה (0.6 מ"ל / דקה) והמשך לשלב 5.
5. חלק הליך כירורגי 2
- מניח מהדק בין IV ליגטורה ואת ההסתעפות של רנה עזבהעורק l.
- ביצוע חתך קטן זנב אב העורקים של IV ליגטורה, נזהר שלא לחתוך את הקיר הגבה.
- להרחיב את פתח אב העורקים עם מרחיב כלי.
- Cannulate אבי העורקים עם מחט (2 ס"מ, משך PE 50), דוחף את קצה רק כדי מהדק.
- פתח את המהדק.
- דחוף את קצה המחט cranially עד שהוא מגיע לצומת של העורק בכליה הימנית לבין אבי העורקים.
- VII ליגטורה סגור.
- IV ליגטורה סגור.
- פתח את החזה עם מספריים על ידי לנתח את הסרעפת. עם חתך אחד, להפריד את אב עורקים, וריד נבוב, לב ועצבים וגטטיבי. עם צעד זה, החיה הוא הקריב באמצעות exsanguination מהירה תחת הרדמה עמוקה רציפה.
- להפעיל את תכנית בקרת לחץ של משאבת זלוף. לשמור על לחץ הממוצע בין 80 ל -100 מ"מ כספית.
- V. ליגטורה Close
- VI ליגטורה סגור.
- VIII ליגטורה סגור.
- כליות חינם מימין של tissu החיבורדואר והטבעה שלה לתוך הקפסולה השומן במספריים.
- חותכים את אבי העורקים proximally כדי ליגטורה V.
- חותכים את העורק mesenteric מעולה distally כדי ליגטורה VI.
- חותכים את צרור כלי החוצה תומכת כליות, מקפיד לא לחתוך לתוך כלי עצמם.
- חותכים את הכבד על הקשר לכליה. תשמור על עצמך כדי לשחרר את הכליה, אך להשאיר חלק קטן של החסיד הכבד אליו, כך הווריד הנבוב נשמר פתוח על ידה.
- קח את צרור הכליות מתוך העכבר. הסר את העכבר מהאולם הלח.
- מניחים ליגטורה "לאסו" סביב החיבור של הכבד והכליות (IX ליגטורה).
- Cannulate את הווריד הנבוב עם קו ורידי (2 ס"מ PE 50).
- IX ליגטורה סגור. יצוא ורידי דרך קו הוורידים צריך להתחיל מייד.
- סגור את התא הלח.
6. ניתוח Downstream
- במהלך השעה הבאה, לפקח באופן רציף את זרימת הדם ואת intravascular לחץ 15. אסוף יצוא ורידי, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח של, למשל, שחרור רנין כליות 7. אסוף שתן לניתוח ריכוז אלקטרוליטים ו -14 קצב הסינון הגלומרולרי. אחרי שעת 1 של זלוף, כליות ניתן snap-קפוא במשך מערבי סופג או להיות קבוע עבור הדמיה מתקרבות 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם תארה את השיטה, כליות עכבר מבודדות יכולות להישאר קיימא עבור שעות 1 לפחות. בדקנו את כדאיות הרקמות לאחר 1 hr של זלוף הרציף עם (זרימת דם כליות והתנגדות וסקולרית, ניתוח גז דם של יצוא ורידים, GFR, + Na שבר שתן ו- K + הפרשה, ו osmolality שתן) פונקציונליות מורפולוגיים (אלקטרוני הילוכים מיקרוסקופיה, TEM) שיטות בארבע כליות של wildtype C57Bl / 6 עכברים. בנוסף, כתמים מערביים של חלבוני סמן פסגה של מגזרים אבובית שונים בוצעו, השוואת כליות perfused מבודדות לכליות unperfused של באותן חיות. בכל הניסויים, זלוף לחץ מתמיד שימש, שמירה על לחץ זלוף ב ~ 100 מ"מ כספית (איור 4). בשנת הכליות אלה, זרימת perfusate והתנגדות וסקולרית נשאר יציב לאורך זמן של 55 דקות ב 15.6 ± 0.4 מ"ל / g * דקות של משקל כליות 35 ± 1.0 מ"מ כספית * דק '/ מ"ל, בהתאמה (איור 4 א). ירידה של זרימת perfusate או עלייה בתנגודת כלי דם היא פרמטר רגיש לגבי הפחתת כדאיות רקמות וצריכים להיות במעקב לאורך זלוף בזהירות. גז דם וניתוח אלקטרוליטי 100 דגימות μl נלקחו 60 דקות לאחר תחילת זלוף חשפו ייצור כליות CO 2 וצריכת O 2, כאשר יבואו העורקים הושווה יצוא הוורידים (הטבלה 2). הפרמטרים האחרים לא חלו שינוי בין עורק לוריד (טבלה 2). דגש מיוחד צריך להיות ממוקם על שחרור אשלגן ללא שינוי ורידים, כגידול עלול להתרחש במהלך ניזק לרקמות. GFR, כפי שהוערך FITC-אינולין סיקול 14, נטה לעלות לאורך זמן (איור 4 ב) אך מגמה זו לא נמצאת מובהקת. הפרשה חלקית של נתרן ואשלגן העריכה לאחר 55 דקות של זלוףהוא גדל לעומת המצב vivo (איור 4 ג). Osmolality שתן אינו מוגבה מעל osmolality של יצוא ורידי לאחר 55 דקות של זלוף (איור 4 D).
עבור מחקרים מורפולוגיים, הכליות תוקנו לאחר זלוף paraformaldehyde 3% ו glutaraldehyde 0.1% חיץ דיאליזה כפי שתואר לעיל 17. ultrastructure הכליה הוערך עם TEM. מגזרי glomeruli ו S1 של tubules הפרוקסימלי הופיעו ללא שינוי בעיקר לאחר זלוף (איורים 5 א 'וב'). חלק, אבל לא בכל המגזרים S2 / S3 של tubules הפרוקסימלי ואת הגפיים עולה עבה כי לא היו קרובים חבילות וסקולרית הראו סימנים של נזק לאיבר, כפי שתואר לעיל בכליות perfused מבודד עכברוש 5 (איורים 5 C ו- D). גם בדיקה מקרוב, האבובית המרוחקת ותעלות איסוף לא להראות סימנים ברורים של נמק (איורים 5, F, E ו- G). לסיכום, הממצאים מורפולוגיים כליות עכבר לשקף את המצב נמצא בכלית perfused מבודדת עכברוש 5.
כתמים מערביים של חלבוני סמן פסגה של מגזרי נפרון השונים בכליות perfused מבודדות (snap-קפוא אחרי שעת 1 של זלוף) לעומת כליות נגדיות unperfused של אותו בעל חיים (snap-קפוא לפני תחילת זלוף) לא לחשוף שינויים משמעותיים. למדנו NaPi-IIa (הממוקם tubules הפרוקסימלי), NKCC2 (גפיים עולה עבה), NCC (האבובית המרוחקת), ו ENaC (חיבור tubules / איסוף צינוריות) (איורים 6 א 'וב').
איור 4: הערכת הכדאיות הפונקציונלית של כליות perfused במשך 55 דקות. א) </ Strong> במהלך זלוף לחץ מתמיד, התנגדות כלי הדם ואת זרימת perfusate נותר יציב במשך 55 דקות. 15 הדקות הראשונות אינן נכללות בגלל ההשתנות הגבוהה לראות תמיד בתקופה זו. B) קצב הסינון הגלומרולרי (FITC-אינולין) של ארבעה הכליות העריכו לאחר 25 ו -55 דקות המוצג עלייה משמעותית קלה אך לא לאורך זמן. C) הפרשה חלקית של נתרן ואשלגן העריכה לאחר 55 דקות של טפטוף. D) פלזמת ורידים ושתן osmolality לאחר 55 דקות של טפטוף. n = 4 בכל הניסויים. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים. נציג מורפולוגיה של D מגזרי נפרון ifferent של perfused הכליות לעבר נקודת הסיום של 1 שעה. א) glomeruli הם שלמים. פירוט של podocyte בתוך glomerulus. B) קטע S1 של אבובית הפרוקסימלי. מגזרי S1 הם שלמים. C) S2 / קטע S3 של אבובית הפרוקסימלי. חלק, אבל לא בכל המגזרים S2 / S3 של tubules הפרוקסימלי הם נמקי מאוד. תאי המראה נפוחים ולהיראות גדול ניזק תאי. מתווית צינורי נשמרה רק על ידי קרום המרתף. D) עבה עולה איבר (TAL). TALs אלה רחוקים החבילות וסקולרית להראות הסימנים הראשונים של ניוון hydropic. ממברנות לומינל להופיע דליל ושביר. E) האבובית המרוחקת (DCT). DCTs הם שלמים. F) הפירוט של infoldings basolateral של תא DCT. האנדותל Fenestrated, קרום במרתף, infoldings basolateral, ואת המיטוכונדריה הם שלמים. G) איסוף צינור (CD). תקליטורים הם שלמים.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: כתם המערבי של Apical מרקר חלבונים בכליות perfused מבודדים בהשוואת Unperfused ולכליות על ידי בעלי החיים הזהים. א) כתמים מערביים של כליות perfused עבור שעה 1 וכליות unperfused. NaPi-IIa הוא נציג אבובית הפרוקסימלי. NKCC2 מייצג על אותו איבר עולה עבה. NCC ו- NCC פוספורילציה ב תראונין 53 (pT53 NCC) נמצאים באופן בלעדי האבובית המרוחקת. יחידות משנת אלפא וגמא של ENaC באורך המלא שלהם והמוצרים שלהם בקעו proteolytically מוצגות נציג צינור אבובית / איסוף חיבור. ב) כימות של א) לא גילה הבדלים משמעותיים בין הכליות perfused fאו 1 hr וכליות unperfused. n = 3 בניסויים בכלל. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM וערכים בודדים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: רכב פתרונות דיאליזת הצפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
טבלה 2: גז דם אלקטרוליט ניתוח של יבוא עורקי יצוא ורידים של perfused עכבר כליות 60 דקות לאחר תחילת זלוף (n = 4). הנתונים מוצגים כאמצעי ±SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העכבר מבודד כליות perfused הוא כלי לחקר תפקוד כליות בסביבה מבוקרת vivo לשעבר עבור שעה 1, לגשר על הפער בין in vivo ניסויים בבעלי חיים שלמים, אשר עשוי להיות פגומים על ידי ההשפעה של גורמים מערכתיים רבים, ובניסויים במבחנה מגזרי נפרון מבודדים או תאים בתרבית, אשר בהכרח להזניח את ההשפעה של מבנה איבר ללא פגע על תפקוד. יש, לידיעת המחברים, לא טכניקה חלופית שבה לבצע משימה ספציפית זו. מחקרים ביוכימיים על רקמת כליה, לעומת זאת, יכול להתבצע בצורה הרבה יותר פשוטה באמצעות פרוסות כליה 17. בעוד הטכניקה הציגה משמשת כיום בעיקר ללמוד פיזיולוגית כליות, יישומים חדשים רבים הם דנים. לדוגמה, זה יכול לשמש עבור Bioengineering בכליות במהלך decellularization זלוף recellularization 12. בנוסף, זלוף normothermic הממושך של כליות לפני transplantation, עם הממשל של מינונים גבוהים של נוגדות דחייה או הגנום עריכת סמים לתוך perfusate, נחקרת; אפילו במסגרות קליניות 8, 9, 10, 11. הכליה perfused מבודד העכבר הוא כלי מצוין שיכול לשמש עבור יישומים אלה, במיוחד כדי להבהיר את התפקיד של גנים בודדים עם מודלים בנוקאאוט.
שלוש מדרגות הן קריטיות עבור ניסוי מוצלח. מאמר זה מספק מעבדות עניין עם האמצעי לשחזר את ההליך. ראשית, המאגר צריך להיות ערוך בצורה כזאת כי הכליה מקבלת את רוב חומרי המזון הדרושים כדאי ממושכות בתנאים לשחזור. איזון חייב להימצא בין תנאים בשליטה מלאה (חיץ סינטטי) ותנאי זלוף ילידים (דם מלא). לכן, אלבומין ו אריתרוציטים יונקים המטוקריט של 10% צריך להיכלל. המטוקריט זה מייצג, ב 'ניסיון המחברים, את הפשרה הטובה ביותר בין t מספיקנושא חמצון וצמיגות חיץ נמוך (הגדלת המטוקריט פוחתת לזרום באופן דרמטי במהלך זלוף לחץ-קבוע (להשוות ערכים המוצג במאמר זה לערכי בכליות perfused ללא אריתרוציטים 18)). האיכות והטריות של אריתרוציטים היא קריטית. במהלך שלבי הכביסה, אריתרוציטים צריכים להיות מטופל בזהירות כדי למנוע המוליזה. המאגר צריך להיות טרי ביום הניסוי. שנית, הניתוח צריך להתבצע על ידי מנתח מיומן בתוך זמן קצר ככל האפשר. המנתח צריך לבצע 6 ליגטורה סביב כלי הדם הראשיים המחברים את הכליה אל שאר חלקי הגוף, תוך שמירה על איבוד הדם של בעלי החיים עד למינימום. לקבלת תוצאות אופטימליות, התערבויות הכירורגיות צריכות להתבצע תוך 30 דקות. אם לחץ דם הדם הממוצע של חית טיפות, במהלך ניתוח ממושך או עקב הרדמה, מתחת ל -60 מ"מ כספי, הפרפוזיה הכלייתית כבר תהיה מינימאלית ואת הרקמה תהיה נוטהכדי נמק. כדי לשלול זה, הכליה עזבה ניתן לקחת לאחר ניתוח, כאשר זלוף בכליה הימנית כבר החל, ומשמש קבוצת ביקורת. שלישית, בזמן של זלוף לתפקוד התקין של מנגנון זלוף, מורכב של מעגל קטן-חיה-זלוף סטנדרטי, צריך להיות מובטח. בזמן שהמחשב מבצע את זלוף ידי עצמו, פיקוח אנושי הכרחי, למשל כדי לבדוק בועות במעגל זלוף.
הנתונים נציג הניתנים מאפשר הערכה של כדאיות כליות לאחר 1 hr של זלוף vivo לשעבר וההשוואה של ההצלחה הטכנית של כל ביצוע של שיטה זו על הגישה המתוארת במסמך זה. במהלך לפחות 1 שעה, זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, גזים בדם של יצוא הוורידים וקצב סינון גלומרולרי צריכים להישאר יציבים.
ישנן מגבלות מסוימות על הטכניקה, אשר אחד צריך לזכור. אפילו קיdney הנפקה מהניתוח המצליח ביותר מסוגלים להמשיך להתקיים רק לזמן מוגבל. המחברים מצאו 1 hr להיות נקודת הזמן הטובה ביותר שבו להפסיק זלוף. בנוסף, בעוד זלוף של הכליה המבודדת מאפשר לחקר האיבר כולו המבודד לעומק, קשה להבדיל השפעות ספציפיות על סוג תא אחד. כליות השווות אחר 1 hr עלולות להראות פגמי מגזרי S3 של tubules הפרוקסימלי ותאי איבר עולה עבים, תוך glomeruli, מגזרי S1, DCTs, ותקליטורים צריכים להישאר שלמים. שימוש החובה של אריתרוציטים, במיוחד מבני האדם, קשור גם סיכונים פוטנציאליים (למשל, זיהומים) עבור הנסיין.
לסיכום, הכליה perfused מבודד העכבר היא טכניקה יעילה שבה ללמוד את איבר שלם vivo לשעבר. כמו כל טכניקה, יש לו יתרונות ומגבלות מסוימים. החוקרים מאמינים כי הן היישומים החדשים סעפת הנובעים כיום פרוטוקול זה יכול לספק sufficienמומנטום t עבור מעבדות אחרות כדי לשחזר את המאמץ הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
